DELLA蛋白缺失對(duì)擬南芥干旱脅迫耐受性的影響

王 瑋，馮 起，張莉環(huán)，楊 寧*

(1 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；2 中國科學(xué)院 西北生態(tài)環(huán)境資源研究院，內(nèi)陸河流域生態(tài)水文重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

赤霉素(gibberellins，GAs)屬四環(huán)二萜類化合物，作用于植物整個(gè)生命周期，調(diào)節(jié)和控制著高等植物生長發(fā)育、分化開花和繁殖的不同過程[1-4]，是一類生長促進(jìn)類植物激素。在擬南芥的赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，GA與受體GID(gibberellin insensitive dwarf)和DELLA蛋白結(jié)合，在去磷酸酶TOPP4和E3泛素連接酶SLY1(sleepy1)作用下將DELLA去磷酸化并泛素化，隨后進(jìn)入降解途徑降解，從而解除DELLA蛋白對(duì)GA應(yīng)答基因的阻遏作用，啟動(dòng)應(yīng)答基因表達(dá)[5-7]。因此DELLA蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮著重要的負(fù)調(diào)控作用。

赤霉素在干旱脅迫方面的作用機(jī)制研究還比較少[8]，赤霉素作為植物體內(nèi)促進(jìn)發(fā)育的激素之一，其含量在水分缺失條件下的降低，是植物為了應(yīng)對(duì)干旱而降低生長速率所進(jìn)行的適應(yīng)策略，并且赤霉素與脫落酸具有拮抗作用，因此植物在干旱脅迫下赤霉素應(yīng)該被負(fù)調(diào)控[8-9]。一系列研究表明，冷、鹽、干旱等非生物脅迫通過DREB1/CBF家族(dehydration-responsive element binding protein/c-repeat binding factor)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)GA代謝酶GA2ox(gibberellin 2-oxidase)基因表達(dá)，降低有生物活性的GA的含量，促進(jìn)DELLA蛋白積累，抑制植物生長，從而提高植物對(duì)逆境脅迫的耐受能力[8, 10-11]。在土豆中過表達(dá)擬南芥赤霉素甲基轉(zhuǎn)移酶基因，雖然降低了土豆中赤霉素的活性，但增加了植株對(duì)干旱的脅迫耐受能力[12]。干旱脅迫下，外源施加GA降低了擬南芥的耐受能力，提高了植株死亡率[13]。與此一致的是，在擬南芥中過表達(dá)GA合成酶基因，植株表現(xiàn)出GA過量的表型，同樣降低了擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受能力；相反，GA合成酶基因缺失突變體卻提高了其在干旱脅迫下的存活能力[8]。然而，擬南芥spy，一個(gè)表現(xiàn)出赤霉素過量表型的赤霉素負(fù)調(diào)控因子SPINDLY蛋白缺失突變體，卻表現(xiàn)出對(duì)高鹽和干旱較強(qiáng)的耐受能力[13]，這一發(fā)現(xiàn)使得赤霉素相關(guān)突變體在干旱脅迫中的抗逆機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本研究以表現(xiàn)出GA過量表型的擬南芥DELLA蛋白五缺突變體gai-t6rga-t2rga1-1rga2-1rga3-1(簡稱della)為研究對(duì)象，觀察其在干旱脅迫下的存活率、失水率、萌發(fā)率等表型，檢測脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量等生理指標(biāo)，對(duì)發(fā)揮植物細(xì)胞脫水保護(hù)功能的胚胎晚期豐富蛋白編碼基因LEA(late embryogenesis abundant protein)和ABA(abscisic acid)應(yīng)答基因表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析，初步確定della突變體抗旱能力提高的表型及原因，為后期深入研究della突變體抗逆機(jī)制和選育抗旱植物的新方向奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)所用擬南芥野生型Ler(Landsbergerecta，CS20)和della突變體(CS16298)均訂購于Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。種子用0.1% HgCl2表面消毒5～8 min，然后用無菌水沖洗6～8次，點(diǎn)播于1/2 MS固體培養(yǎng)基(MS鹽+1%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8)上。在4 ℃條件下春化3 d，放于培養(yǎng)間培養(yǎng)，光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度22 ℃，光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度80%。

1.2 方 法

1.2.1生存率參考Qin等的方法[13]，分3個(gè)生物學(xué)平行，每個(gè)平行的Ler和della種植到同一個(gè)花盆中，正常生長14 d后停止?jié)菜?，干旱脅迫21 d后重新澆水，復(fù)水7 d后統(tǒng)計(jì)2種實(shí)生苗的生存率。

1.2.2萌發(fā)率參考Xu等的方法[14]，Ler和della種植到分別含0、200 mmol/L甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，春化后每24 h統(tǒng)計(jì)一次萌發(fā)率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7 d。實(shí)驗(yàn)分3個(gè)重復(fù)進(jìn)行，每個(gè)平行100顆種子。

1.2.3葉片失水率參考Qin等的方法[13]，摘取土壤中生長14 d的Ler和della幼苗綠色組織，隨機(jī)分成3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，置于22 ℃環(huán)境下的無蓋培養(yǎng)皿中自然風(fēng)干，分別在0、10、20、30、40、60、90、120、150、180 min時(shí)間點(diǎn)測量材料重量。葉片失水率=[(鮮重-風(fēng)干后重量)/鮮重]×100%。

1.2.4生理指標(biāo)檢測干旱脅迫按照1.2.1的方法處理，分別于第3、6、9、12、15 d取樣并分為3個(gè)重復(fù)。脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5基因定量表達(dá)分析干旱脅迫按照1.2.2的方法處理，0.1 g植物材料用Trozol法提取總RNA，1 μg總RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說明書方法去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR加樣體系與儀器程序參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)說明書。每一個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCT方法計(jì)算，用GAPC作為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)至少3次生物學(xué)重復(fù)。熒光定量PCR所需的引物如表1所示。

表1 本研究所用到的引物Table 1 All primers used in this study

** 表示0.01顯著性水平,下同** indicate significant differences P < 0.01, the same as below

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)Ler和della生長的影響

為比較Ler和della在相同干旱脅迫下生長狀態(tài)的差異，2種擬南芥種植在同一個(gè)花盆中，以確保干旱處理?xiàng)l件的一致性。經(jīng)21 d干旱脅迫后，野生型和突變體都表現(xiàn)出多數(shù)葉片干枯萎蔫的脅迫癥狀，但突變體的葉片顏色較綠。復(fù)水7 d后，統(tǒng)計(jì)Ler的生存率約為31.7%，而della的生存率約為44.9%，顯著高于野生型對(duì)照(圖1)。結(jié)果說明表現(xiàn)出生長快、開花早等GA過量表型的della突變體耐受干旱脅迫的能力比野生型強(qiáng)。

萌發(fā)率結(jié)果如圖2所示，正常生長條件下，della的萌發(fā)率略高于野生型，在第3天即可達(dá)到100%萌發(fā)，而Ler在第3天的萌發(fā)率約為85.4%，在第5天才能夠100%萌發(fā)。200 mmol/L甘露醇模擬干旱脅迫時(shí)，野生型Ler和突變體della的萌發(fā)率都受到明顯影響，但della的萌發(fā)率顯著高于野生型，并且在第6天完全萌發(fā)，此時(shí)Ler的萌發(fā)率僅為57.6%。外源施加GA能夠增加野生型植株在甘露醇脅迫下的萌發(fā)率，但仍無法達(dá)到della萌發(fā)率水平。這些結(jié)果表明della突變體耐受滲透脅迫的能力比野生型強(qiáng)，并且萌發(fā)能力提高的表型特征可能不完全是GA信號(hào)通路持續(xù)激活引起的。

2.2 干旱脅迫對(duì)Ler和della葉片失水率的影響

野生型和突變體離體葉片的失水速度的檢測結(jié)果如圖3所示，隨著干旱處理時(shí)間的增加，2種植物失水率都逐漸增大，但della的失水速度顯著低于野生型，處理180 min后，della的失水率達(dá)到44.9%，而Ler的失水率則高達(dá)54.2%。說明較低的植株失水速度是della突變體較野生型耐旱的原因之一。

2.3 干旱脅迫對(duì)Ler和della脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量的影響

對(duì)Ler和della的脯氨酸和可溶性糖含量檢測結(jié)果顯示，正常生長條件下，與Ler相比della的脯氨酸和可溶性糖含量沒有顯著性差異，干旱脅迫后della的脯氨酸和可溶性糖含量升高的速率比Ler慢(圖4)這些結(jié)果表明在相同干旱處理?xiàng)l件下，della突變體受到的脅迫程度較低，同時(shí)也說明滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和變化速率并不是della突變體較Ler耐旱的原因。

A.對(duì)照,正常水分供應(yīng)；B. 200 mmol/L甘露醇模擬干旱脅迫A. Control; B. 200 mmol/L Mannitol

圖3 Ler和della離體葉片失水率Fig.3 The water loss rate of leaves detached from Ler and della mutant

* 表示0.05水平顯著性，下同* indicates significant differences P < 0.05，the same as below

丙二醛是植物膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量反映了植物脅迫后的氧化損傷程度。圖4結(jié)果所示，干旱脅迫后della的丙二醛含量升高的速率比Ler慢，同樣說明della突變體脅迫后受到的氧化損傷程度較低。

2.4 干旱脅迫下LEA基因的表達(dá)模式

在擬南芥赤霉素負(fù)調(diào)控因子SPINDLY蛋白缺失突變體spy中，3個(gè)LEA基因(At2g03850、At2g36640和At3g17520)的高表達(dá)可能是其對(duì)干旱脅迫耐受的原因[13]，為檢測這3個(gè)LEA基因在Ler和della突變體中的表達(dá)模式，利用qRT-PCR檢測At2g03850、At2g36640和At3g17520 mRNA的干旱誘導(dǎo)表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，干旱脅迫后，除AT2g36640基因在Ler和della表達(dá)模式相似以外，At2g03850和At3g17520基因在della中的上調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)均高于Ler，這說明較高的LEA基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)可能是導(dǎo)致della突變體較野生型耐旱的另一個(gè)原因。

2.5 干旱脅迫下ABA應(yīng)答基因的表達(dá)模式

干旱條件下，ABA通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉降低蒸騰作用防止水分丟失、誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗旱能力[15]。為檢測della突變體抗旱能力較強(qiáng)的表型是否由于ABA信號(hào)應(yīng)答引起的，對(duì)LOX3、COR15b和COR413等3個(gè)ABA應(yīng)答基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明(圖6)，干旱脅迫后，這3個(gè)ABA應(yīng)答基因在della中的上調(diào)表達(dá)程度均低于野生型。尤其是LOX3基因在Ler中干旱脅迫1 h后表達(dá)量升高了約125倍，而在della突變體中僅升高了約17倍。這些結(jié)果表明，della突變體中ABA信號(hào)并沒有過度激活，較之野生型在干旱脅迫后的表現(xiàn)反而受到了抑制。

圖5 At2g03850、At2g36640和At3g17520基因表達(dá)模式Fig.5 Gene expression patterns of At2g03850, At2g36640, and At3g17520

圖6 LOX3、COR15b和COR413基因表達(dá)模式Fig.6 Gene expression patterns of LOX3, COR15b, and COR413

3 討 論

植物激素是一類小分子化合物，調(diào)控了植物生長和發(fā)育以及對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)。通過改變激素的合成、運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，植物能夠調(diào)節(jié)生長與脅迫耐受的平衡，促進(jìn)植物在脅迫環(huán)境中生存。作為生長促進(jìn)類激素，在低溫、高鹽和干旱脅迫下，赤霉素的含量和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)降低來抑制植物生長抵抗逆境；相反，在樹蔭和水淹環(huán)境下，赤霉素的含量和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)又會(huì)增強(qiáng)來促進(jìn)植物生長從而逃離不利環(huán)境[8]。越來越多的證據(jù)表明，GA缺陷雖然植株矮化但增加了其對(duì)脅迫的耐受能力[8, 10-12, 16]。然而，表現(xiàn)出GA過量表型的spy突變體通過降低在干旱脅迫下的失水速率、誘導(dǎo)LEA基因和CKX基因表達(dá)，提高了植物對(duì)高鹽和干旱脅迫的耐受性，推測可能是由于SPINDLY蛋白與其他蛋白(而不是DELLA蛋白)相互作用參與了脅迫應(yīng)答，因?yàn)橥庠词┘覩A降解DELLA后，擬南芥對(duì)干旱脅迫不耐受[13]。在本研究中，同樣具有GA過量表型的擬南芥DELLA蛋白五缺突變體也表現(xiàn)出對(duì)干旱脅迫有較高的耐受能力，并且這種耐受能力并不是脯氨酸、可溶性糖等小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量高導(dǎo)致的，而是由于在干旱脅迫后，della突變體葉片失水速度較野生型慢以及LEA基因表達(dá)量上調(diào)程度較高引起的。這一結(jié)果與在spy突變體中觀察到的結(jié)果一致，說明單純的DELLA蛋白失活能夠提高植物脅迫耐受能力，只是這種失活不能是由于GA水平升高引起，可能存在其他機(jī)制。

ABA通過正調(diào)控SnRK2s(sucrose non-fermenting1-related protein kinases 2)促進(jìn)氣孔關(guān)閉減少植物在干旱脅迫下的水分丟失[15, 17]，Lin等[9]的研究發(fā)現(xiàn)GA能夠降低SnRK2活性拮抗ABA信號(hào)通路。干旱脅迫后的della突變體中，因GA信號(hào)持續(xù)激活，ABA應(yīng)答基因的上調(diào)表達(dá)的程度低于野生型，這一結(jié)果說明della突變體干旱脅迫下失水率較低的表型并不是ABA含量升高引起的，也存在著其他原因(圖7)。但另一方面該結(jié)果解釋了della突變體在甘露醇脅迫下萌發(fā)率較快的原因可能由于ABA應(yīng)答程度較低引起的。

本研究發(fā)現(xiàn)DELLA蛋白缺失植物表現(xiàn)出干旱脅迫耐受的表型，這種表型的產(chǎn)生是由于della突變體在干旱脅迫后失水速率低、LEA基因誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)程度高引起的。但是通過提高GA水平降解DELLA蛋白反而降低了植物對(duì)干旱脅迫的耐受，說明DELLA蛋白在植物平衡生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答的功能方面仍待進(jìn)一步研究。這個(gè)發(fā)現(xiàn)改變了以往GA過量表型突變體對(duì)干旱脅迫耐受程度低的認(rèn)識(shí)，為深入研究DELLA蛋白功能及其在干旱脅迫下GA與ABA拮抗響應(yīng)中的作用鋪墊了基礎(chǔ)，也為篩選抗旱植物提供了新的思路。

圖7 della突變體增強(qiáng)干旱脅迫耐受性的模式圖Fig.7 A model showing the della enhancing drought tolerance

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