長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物對(duì)乙醇誘導(dǎo)小鼠胃潰瘍的保護(hù)作用研究

王淑敏，曹 菁，穆雙雙，王 方，祝恩智

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

急性酒精性胃黏膜損傷，是指由于大量酗酒及飲用高濃度酒而引起以急性胃黏膜糜爛或淺表性潰瘍?yōu)樘卣鞯募毙晕葛つ\表性損害，是急性胃黏膜損傷較常見的一種類型。經(jīng)口攝入酒精可直接損害胃黏膜上皮的脂蛋白層，使胃黏膜屏障受損，加上胃液中氫離子回滲入黏膜上皮細(xì)胞，導(dǎo)致組胺、5-羥色胺和肝素釋放，引起黏膜下動(dòng)脈短路，毛細(xì)血管壓力升高與通透性增加，最終出現(xiàn)黏膜充血、紅細(xì)胞滲出、胃黏膜糜爛出血，甚至淺表性潰瘍。

長(zhǎng)柄側(cè)耳（Pleurtus Spodotecus Fr.），又名灰白側(cè)耳、匙形側(cè)耳、灰凍菌。屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）的真菌，主要分布于吉林、云南、貴州、西藏等地，是一種常見的食藥用菌[1]。側(cè)耳屬真菌肉質(zhì)細(xì)膩，味鮮可口，營養(yǎng)豐富。60年代后，人們發(fā)現(xiàn)側(cè)耳多糖具有多種功效，它能控制細(xì)胞分裂，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老，可作為免疫促進(jìn)劑,對(duì)腫瘤、心血管疾病和肝炎具有治療作用，從而引起人們的重視[2]?，F(xiàn)代研究表明，側(cè)耳屬真菌具有較好的提高機(jī)體免疫力、降血脂、降血壓、抗腫瘤及抗氧化等作用[3]。本文主要研究長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物對(duì)乙醇誘導(dǎo)小鼠胃潰瘍的保護(hù)作用，為長(zhǎng)柄側(cè)耳的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

奧美拉唑（蘇州中化藥品工業(yè)有限公司）；長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥用真菌研究室提供。ICR小鼠，22～25 g；許可證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0004；合格證編號(hào)：NO.201401547揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。乙醇購自于南京海普樂生物有限公司，髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、IL-6、TNF-α、JnK 抗體、ErK抗體、p38抗體、NF-?Bp65抗體等試劑盒購自南京建成生物有限公司。酶標(biāo)儀（KX-21，美國SYSMEX）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠酒精性胃潰瘍模型復(fù)制及分組 取小鼠50只，隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水）；乙醇組（灌胃無水乙醇，0.2 mL/只），奧美拉唑組（灌胃乙醇前1 h給予藥物，0.5 g/kg），長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物低劑量組（灌胃乙醇前1 h給予藥物，0.5 g/kg），長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物高劑量組（灌胃乙醇前1 h給藥物，1 g/kg），每組10只小鼠。灌胃乙醇或生理鹽水后4 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)，取血清及胃組織測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 血清中MPO、SOD、MDA含量測(cè)定 按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 胃病理學(xué)檢查 切取胃，以4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察胃組織病理學(xué)改變。

2.2.3 血清中IL-6、TNF-α檢測(cè) 按照試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.4 Western blot 將胃組織置于冰冷的裂解液收集裂解物總蛋白，組織蛋白行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至PVDF膜；室溫封閉2 h，分別與JnK抗體、ErK抗體、P38抗體、NF-?BP65抗體一抗孵育，膜經(jīng)漂洗后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑顯影，灰度成像軟件（UVP，UK）測(cè)定主帶的光密度值以計(jì)算JnK、ErK、P38、NF-кBP65蛋白表達(dá)水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 胃組織的病理學(xué)變化 光鏡觀察顯示,空白對(duì)照組小鼠胃黏膜上皮完整，連續(xù)性好，腺體排列整齊，黏膜層組織結(jié)構(gòu)層次清楚。乙醇所致胃黏膜損傷未累及黏膜肌層，可見部分黏膜上皮細(xì)胞受損脫落，灶狀糜爛出血，固有膜毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，腺體腫脹，結(jié)構(gòu)破壞，凝固性壞死，藥物組加乙醇組上述變化明顯減輕（圖1）。

圖1 藥物對(duì)乙醇誘導(dǎo)小鼠酒精性胃潰炎胃組織病變的影響（HE，×100）

3.2 血清中 MPO含量 與空白組相比，乙醇組血清中MPO含量升高（P＜0.01）；藥物組血清中MPO含量顯著下降（P＜0.001），結(jié)果見表 1。

表1 藥物對(duì) MPO 的影響（x± s ，n = 10）

3.3 血清中SOD、MDA含量 與空白組相比， 乙醇組血清中MDA含量升高（P＜0.01）；與乙醇組比較，SOD含量降低（P＜0.01）。藥物組血清中MDA含量顯著下降，SOD含量顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見表 2。

3.4 血清中IL-6、TNF-α含量 與空白組相比，乙醇組血清中IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）。與乙醇組比較，藥物組血清液中IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.01），結(jié)果見表 3。

3.5 胃組織中 JnK、ErK、p38、NF-кBp65蛋白水平 與空白組相比，乙醇組胃組織中JnK、ErK、p38、NF-кBp65蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；藥物組胃組織中JnK、ErK、p38、NF-kBp65蛋白水平降低（P＜0.05），結(jié)果見圖 2及表4。

表2 藥物對(duì) SOD 和MDA 的影響（x± s ，n = 10）

表3 藥物對(duì)IL-6和TNF-α的影響（x± s ，n = 10）

表4 藥物對(duì)JnK、ErK、P38、NF-кBP65的影響（x± s ，n = 3）

圖2 胃組織中JnK、ErK、P38、NF-кBp65蛋白水平

4 討論

乙醇引起的胃潰瘍與氧自由基具有密切的關(guān)系，過量飲酒使乙醇在體內(nèi)不能及時(shí)氧化代謝，就會(huì)通過酶或非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧化自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并形成脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物—MDA，MDA與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)合形成脂褐質(zhì)沉積于細(xì)胞中，造成細(xì)胞損傷[4]。同時(shí)，MPO的主要功能是在吞噬細(xì)胞內(nèi)殺滅微生物，利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基。并在一定條件下催化反應(yīng)生成過量的氧化劑，超過局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷。SOD是催化清除自由基的重要酶類，是胃黏膜的重要保護(hù)因子之一[5-6]。長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物能顯著提高胃潰瘍小鼠血清中SOD水平，降低血清中MPO、MDA水平，提示長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物可通過清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少自由基的生成，起到保護(hù)胃黏膜作用。IL-6、TNF-α作為重要的促炎細(xì)胞因子，其大量合成與釋放會(huì)造成炎癥反應(yīng)[7-8]。核因子кB（NF-кB）在感染、免疫反應(yīng)中起廣泛的作用。在炎癥反應(yīng)中，NF-кB與其抑制蛋白聚合的三聚體分離，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與DNA上特異部位結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活化，誘導(dǎo)細(xì)胞合成各種生物大分子如IL-6、TNF-α等[9]。NF-кBp65是NF-кB的亞單位，長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物能夠抑制NF-кBp65的表達(dá)，從而減少NF-кB的核移位來抑制其活性，達(dá)到抑制炎性因子IL-6、TNF-α的釋放而減輕炎性因子對(duì)胃黏膜的損傷。

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）鏈?zhǔn)钦婧松镄盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAPK通路包括3個(gè)主要成員： p38MAPK,ErK和JnK。這3條通路均可被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和應(yīng)激因素激活，與炎癥有關(guān)的主要是p38、JnK和ErK蛋白[9]。長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物能夠抑制3種炎性蛋白的表達(dá)從而起到保護(hù)胃黏膜的作用。

本文采用乙醇建立酒精性胃潰瘍模型來評(píng)價(jià)藥物的抗酒精性胃潰瘍保護(hù)作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物可有效減輕小鼠乙醇所致胃潰瘍病理學(xué)變化，能顯著提高胃潰瘍小鼠血清中SOD水平，降低血清中MPO、MDA及炎癥因子IL-6、TNF-α水平；降低JnK、ErK、p38、NF-кBp65蛋白表達(dá)水平。提示長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物可能是通過減少體內(nèi)自由基的生成、有效清除體內(nèi)過剩的自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；抑制NF-кBp65 的表達(dá)，減少 NF-кB 的核移位抑制 NF-кB活性，抑制炎性因子IL-6、TNF-α的釋放；抑制炎性蛋白的表達(dá)來達(dá)到對(duì)酒精性胃潰瘍的預(yù)防和保護(hù)作用。

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