針刺對(duì)瘙癢模型小鼠延髓β-EP表達(dá)的影響

趙一丁,閆嬋娟,李文彬

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院,西安 710003)

瘙癢的定義最早由德國醫(yī)生Samuel Hafenreffer于350年前提出[1],是一種可引發(fā)搔抓意愿和搔抓反射的特異性皮膚感覺,可由多種皮膚疾病和系統(tǒng)性疾病引起,臨床醫(yī)生通常將持續(xù)時(shí)間超過 6周的瘙癢定義為慢性瘙癢[2],其發(fā)生率隨年齡的增加而升高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于瘙癢產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜,目前尚缺乏可以長期緩解的治療手段,大量研究證實(shí)針刺對(duì)瘙癢具有不同程度的抑制作用[3],但作用機(jī)制尚不清楚,本研究擬構(gòu)建瘙癢動(dòng)物模型,通過針刺穴位,觀察模型小鼠延髓β-內(nèi)啡肽(β-EP)的表達(dá),以期探討針刺在對(duì)瘙癢調(diào)控過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康C57B/6J雄性小鼠50只,SPF級(jí),6～8周齡,體重 20～25 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK2012-003)。飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中,室溫控制在 18～24℃,濕度控制在50%～70%,光照時(shí)間 8:00—20:00,自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置均符合 2006年國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器

冰凍切片機(jī)(德國 LAIKA)、超低溫冰箱(日本SANYO)、熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)、臺(tái)式離心機(jī)(美國 Benchmark)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海生工生物工程股份有限公司)、蛋白垂直電泳槽(美國Biorad公司)、蛋白濕轉(zhuǎn)儀(美國Biorad公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、攝像機(jī)(日本 SONY)、50 μL微注射器、0.25 mm×25 mm華佗牌一次性針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、微計(jì)量器、血管鉗、手術(shù)刀、眼科剪等。

1.2.2 主要試劑

一 抗 Beta endorphin(66358-1-Ig,美 國Proteintech公司),Beta-actin(SC-47778,美國Santa Cruz Biotechnology公司),羊抗鼠二抗(31430,美國 PIERCE公司),羊抗兔二抗(31460,美國 PIERCE公司)、考馬斯亮藍(lán)R-250、Tween20(美國Amresco公司),兔IgG免疫組化試劑盒、抗熒光衰減封片劑、DAPI染色劑(武漢博士德生物工程有限公司),OCT包埋劑(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司),NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico(美國PIERCE公司),RIPA蛋白裂解液(上海邦奕生物科技有限公司),Cocktail蛋白酶抑制劑(德國Roch公司),98%組胺二磷酸鹽,氯喹等。

1.3 動(dòng)物分組與處理[4-5]

采用隨機(jī)數(shù)字表將50只C57B/6J小鼠隨機(jī)分為組胺組20只、氯喹組20只和空白對(duì)照組10只,其中組胺組和氯喹組又分為針刺組和非針刺組,每組10只。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠放入透明樹脂盒內(nèi)每天適應(yīng)1 h,連續(xù)3 d。第3天適應(yīng)結(jié)束后將組胺組和氯喹組小鼠頸背部(肩胛連線中點(diǎn)上方約5 mm處)皮膚刮毛。

組胺組小鼠,適應(yīng)結(jié)束后第 1天置于透明樹脂盒內(nèi)適應(yīng)1 h后于小鼠頸背部刮毛區(qū)皮內(nèi)注射磷酸組胺100 μL/只造模。第2天適應(yīng)及給藥同第1天,給藥后針刺組隨即進(jìn)行針刺干預(yù),針刺組取雙側(cè)血海、曲池及合谷穴,小鼠穴位定位及針刺深度均參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6],將毫針直刺雙側(cè)血海、曲池及合谷穴2.5～3 mm,采用提插和捻轉(zhuǎn)手法刺激,留針時(shí)間為20 min,每日1次,共針刺2次。

氯喹組小鼠,適應(yīng)結(jié)束后第 1天置于透明樹脂盒內(nèi)適應(yīng) 1 h后于小鼠頸背部刮毛區(qū)皮內(nèi)注射氯喹50 μL/只造模。第 2天適應(yīng)及給藥同第 1天,給藥后針刺組給予針刺干預(yù),具體同組胺針刺組。

空白對(duì)照組:適應(yīng)結(jié)束后不做任何處理，每日進(jìn)行行為學(xué)觀察前需適應(yīng)1 h。

1.4 取材

針刺后各組小鼠腹腔注射 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,固定在操作臺(tái)上,迅速開胸,提拉胸骨柄,完全暴露小鼠心臟,使用6號(hào)靜脈輸液器插入左心室后,用血管鉗固定好輸液器進(jìn)針處,并夾閉心臟,剪開右心耳,打開靜脈輸液器最快滴速注入生理鹽水,觀察小鼠肝臟及腸管,待肝臟由紅色變?yōu)榘咨?腸管鼓脹,四肢及尾部僵直,迅速緊貼小鼠枕骨下用剪刀斷頭,剔除多余皮膚、肌肉組織,用彎鉗剪去顱骨,將大腦沿腹側(cè)剝出并置于冰面上,切除小腦后定位延髓上、下界,取延髓后切半,一半置于凍存管內(nèi)放入液氮罐中凍存,后移入﹣80℃冰箱中保存,用于 Western blot檢測(cè);另一半置于 4%多聚甲醛固定液中固定,經(jīng) 30%蔗糖溶液脫水4 d,待組織沉底后在冰凍切片機(jī)中做水平切片,收集切片于防脫載玻片上,置于切片盒中 4℃冰箱保存用于免疫熒光檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 行為學(xué)觀察

各組小鼠均于適應(yīng)結(jié)束后第1天開始放入透明樹脂盒子內(nèi)觀察小鼠行為學(xué)變化,連續(xù)觀察3 d。第1天組胺組和氯喹組于第1次頸部皮下注射致癢劑后觀察;第2～3天組胺針刺組和氯喹針刺組于針刺后觀察,組胺非針刺組和氯喹非針刺組行為學(xué)觀察時(shí)間同第1天。觀察過程中保持室內(nèi)安靜無人,攝像機(jī)錄像40 min,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后回放錄像觀察小鼠活動(dòng)情況。瘙癢行為學(xué)觀察以搔抓次數(shù)作為評(píng)判方法,具體以小鼠后爪離開盒子底面并搔抓皮膚到其后爪落地或舔舐其后爪為1次完整的搔抓動(dòng)作,在此期間不管搔抓多少次,均記為 1次[7],由2名不參加實(shí)驗(yàn)的工作人員記錄小鼠搔抓次數(shù)。

1.5.2 免疫熒光檢測(cè)延髓β-EP能神經(jīng)元

將制備的延髓組織切片用含 0.3% TritonX-100的PBS洗1次,再用PBS洗3次,每次10 min,用10%羊血清封閉液封閉 30 min,之后甩干凈封閉液,晾干;一抗用PBS稀釋(1:200),4℃過夜,棄去一抗,用 0.3%TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min;二抗用PBS稀釋,室溫孵育30 min,用0.3% TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min;用稀釋的SABC-FITC室溫孵育30 min,0.3% TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次 10 min,用 DAPI染色劑染色 5 min,0.3%TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min,最后加入抗熒光衰減封片劑加蓋玻片于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5.3 Western blot檢測(cè)延髓β-EP的表達(dá)

取出﹣80℃冰箱保存的延髓組織,稱重后在研缽中倒入液氮,研碎組織塊后移入 EP管中,在管中加入RIPA蛋白裂解液(3 mL/g)、蛋白酶抑制劑Aprotinin,充分裂解后取上清液置于新 EP管內(nèi),冰上保存,將各樣品蛋白液1:50稀釋,參照BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白測(cè)定,每個(gè)樣品取相同質(zhì)量的蛋白,加入5×loading buffer后沸水煮10 min使蛋白變性;將制備好的 10%凝膠板放入電泳槽內(nèi),倒入 1×running buffer,用細(xì)槍頭加樣,確定加樣順序和計(jì)算加樣量;將電泳槽與電源連接好,以90 V穩(wěn)壓狀態(tài)電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓調(diào)整至100 V,待溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部停止電泳;按方向依次放好濾紙、膠、膜,直至整個(gè)夾板保持緊密,用含5%脫脂奶粉的TBS封閉,可在室溫封閉 4 h;結(jié)合一抗,在 4℃過夜,HTR2B(1:1000),室溫漂洗3次,每次10 min,結(jié)合二抗,室溫結(jié)合 2 h;羊抗鼠二抗(1:10000)、羊抗兔二抗(1:10000),室溫漂洗 3次,每次 10 min,最后一次用TBS漂洗以去除吐溫;化學(xué)發(fā)光,于暗室中曝光操作,梯度曝光10 s至5 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SAS9.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用one-way ANOVA,所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組干預(yù)后小鼠搔抓次數(shù)比較

組胺組及氯喹組模型動(dòng)物搔抓次數(shù)均明顯高于空白對(duì)照組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),可作為成功建立瘙癢模型的指征;針刺對(duì)組胺組及氯喹組動(dòng)物搔抓行為均具有抑制作用,氯喹針刺組搔抓次數(shù)低于氯喹非針刺組(P＜0.05),組胺針刺組搔抓次數(shù)明顯低于組胺非針刺組(P＜0.01),氯喹非針刺組搔抓次數(shù)高于組胺針刺組(P＜0.01)。詳見表1。

2.2 各組干預(yù)后延髓β-EP能神經(jīng)元表達(dá)比較

免疫熒光結(jié)果顯示,空白對(duì)照組及組胺非針刺組延髓β-EP能神經(jīng)元表達(dá)均不明顯(見圖1 A、E);組胺針刺組延髓β-EP能神經(jīng)元表達(dá)數(shù)量略有增加,氯喹針刺組及氯喹非針刺組延髓β-EP能神經(jīng)元均有一定的表達(dá),延髓β-EP呈點(diǎn)狀、條索形或不規(guī)則狀分布(見圖1 B、C、D)。

表1 各組干預(yù)后搔抓次數(shù)比較 (x ±s,次/40 min)

2.3 各組干預(yù)后延髓β-EP蛋白表達(dá)比較

Western blot結(jié)果顯示,氯喹針刺組、氯喹非針刺組及組胺針刺組延髓β-EP表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01),組胺非針刺組延髓β-EP表達(dá)與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),組胺針刺組延髓β-EP表達(dá)明顯高于組胺非針刺組(P＜0.01),氯喹針刺組與氯喹非針刺組延髓β-EP表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2、圖2。

表2 各組干預(yù)后延髓β-EP表達(dá)比較 (x±s)

圖2 各組干預(yù)后延髓β-EP表達(dá)

3 討論

瘙癢是許多皮膚疾病常見而棘手的臨床表現(xiàn),如特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、皮膚瘙癢癥、銀屑病等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為瘙癢由風(fēng)、濕、熱、蟲、毒之邪氣郁于皮膚腠理之間,使其氣血不和,膚失濡養(yǎng),郁生微熱所致,或由于血虛風(fēng)燥阻于皮膚,肌膚失養(yǎng),內(nèi)生虛熱而發(fā)[8-9]。針灸通過穴位刺激可以激發(fā)機(jī)體的自愈能力,達(dá)到疏風(fēng)解表、清熱祛濕、殺蟲止癢、調(diào)和氣血的作用[10-11],本研究取曲池、合谷,屬手陽明大腸經(jīng),乃多氣多血之經(jīng),善于開泄,能疏泄蘊(yùn)于肌膚之邪,達(dá)到開腠理、疏風(fēng)清熱止癢的作用,血海屬足太陰脾經(jīng)穴,為血會(huì),具有理血活血、散風(fēng)除濕的作用,“治風(fēng)先治血,血行風(fēng)自滅”。針刺對(duì)瘙癢性皮膚病具有很好的療效及安全性,對(duì)于針刺止癢的機(jī)制研究主要圍繞外周瘙癢介質(zhì)展開[12-14],針刺對(duì)中樞神經(jīng)元、瘙癢信號(hào)及其分子機(jī)制尚不清楚。

瘙癢與疼痛同為傷害性刺激,延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核作為中樞調(diào)制系統(tǒng)中下行抑制系統(tǒng)的重要組成部分,參與多種神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)感覺的調(diào)控,RVM區(qū)神經(jīng)元在脊髓水平傷害性信號(hào)的傳導(dǎo)中具有重要的作用[15]。阿片類物質(zhì)是具有鎮(zhèn)痛作用的一類特殊的神經(jīng)肽,內(nèi)源性阿片活性物質(zhì)的代表是內(nèi)啡肽及強(qiáng)啡肽,廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng),其中β-EP是由31個(gè)氨基酸組成的阿片類物質(zhì),β-EP通過與其特異性受體μ-阿片類受體(μ opioid receptor,MOR)結(jié)合,可以抑制電壓依賴的Ca2﹢通道開放和腺苷環(huán)化酶活化,同時(shí)激活K﹢通道,降低神經(jīng)細(xì)胞興奮性,從而抑制痛覺[16-18],同時(shí) MOR的異構(gòu)體 MOR1D(morphine receptor-1D)與胃泌素釋放肽受體形成異二聚體,傳導(dǎo)瘙癢信號(hào)產(chǎn)生癢覺[19]。

本研究結(jié)果顯示針刺對(duì)組胺致癢及氯喹致癢動(dòng)物模型搔抓行為均具有抑制作用,對(duì)組胺致癢動(dòng)物模型延髓β-EP的表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用,對(duì)氯喹致癢動(dòng)物模型β-EP的表達(dá)影響不明顯,但氯喹致癢動(dòng)物模型β-EP表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,說明無論針刺與否β-EP均參與氯喹誘導(dǎo)的非組胺依賴性瘙癢的產(chǎn)生。而組胺致癢動(dòng)物模型延髓β-EP的表達(dá)與針刺密切相關(guān),這可能與針刺誘發(fā)模型動(dòng)物痛覺產(chǎn)生有關(guān),有研究顯示,辣椒素局部注射可引起痛覺過敏,在出現(xiàn)痛覺過敏的皮膚內(nèi)注射致癢劑,可發(fā)現(xiàn)瘙癢強(qiáng)度減低,癢覺超敏和癢覺過敏消失[20],亦有研究顯示破壞大鼠脊髓背角瘙癢相關(guān)神經(jīng)元可以減少慢性疼痛和痛覺過敏[21-24],均反映了疼痛和瘙癢可能共用—部分神經(jīng)通路,故本研究中針刺誘發(fā)疼痛使β-EP表達(dá)反饋性增加,同時(shí)抑制癢覺的產(chǎn)生,存在疑問的是本研究中β-EP的表達(dá)增加沒有引起搔抓行為的增加,可能與針刺穴位、手法、刺激量、刺激時(shí)間均存在聯(lián)系,有待進(jìn)一步深入研究。

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