黃芪破壁飲片與傳統(tǒng)飲片5種有效成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究＊

鄧銀愛，楊澤銳，鄧 雯，成金樂(lè)＊＊

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心 廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室 中山 528437；3.廣東省破壁粉粒工程技術(shù)研究開發(fā)中心 中山 528437）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效[1]。黃芪破壁飲片是由黃芪常規(guī)飲片通過(guò)超音速氣流粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片粉碎至D90＜45 μm（300目以上）的粉體，再經(jīng)過(guò)不添加成型劑專利技術(shù)制成的30-100目的顆粒狀飲片[2]。研究表明，黃芪主要含有黃芪皂苷、黃酮類以及黃芪多糖三大類活性成分。目前同時(shí)測(cè)定黃酮皂苷類及黃酮類成分主要有HPLC-DAD-ELSD以及LC-MS法[3,4]，關(guān)于黃芪破壁飲片的藥代動(dòng)力學(xué)研究筆者未見國(guó)內(nèi)（外）文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定了大鼠血漿中黃芪的5種有效成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素），并比較了黃芪傳統(tǒng)飲片水煎液與黃芪破壁飲片混懸液5種有效成分在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，為黃芪破壁飲片后續(xù)的體內(nèi)代謝機(jī)理提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥與儀器

黃芪破壁飲片（廣東省中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20160825）、黃芪傳統(tǒng)飲片（廣東省中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20160825），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根；黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素對(duì)照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程中心，純度均≥98%；批號(hào)分別為BGTG-0302、BGTG-0445、BGTG-0111、BGTG-0455、BGTG-0444)；內(nèi)標(biāo)柚皮素(中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程中心，純度≥98%；批號(hào)為BGTG-0809)。

表1 洗脫條件表

高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，型號(hào)：1290)；三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司，型號(hào)：6470）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ3200E型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司，型號(hào)：RV10 basic plus）；離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司，型號(hào)：Eppendorf 5427R）；氮?dú)獯蹈蓛x（北京八方世紀(jì)科技有限公司，BF-2000）；氮?dú)庖惑w機(jī)（北京中興匯利科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：NA-5L）；渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司，型號(hào)：VX-Ⅲ）；恒溫烘箱（上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：HPX-9052MBE）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重約350-400 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)研究院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，許可證編號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品與供試品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素適量，加甲醇溶解分別制備為23.4 μg·mL-1、33.6 μg·mL-1、28.4 μg·mL-1、32.6 μg·mL-1、29.4 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密量取對(duì)照品適量，加入甲醇稀釋配制成黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素濃度分別為 46.80 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1、48.28 ng·mL-1、48.90 ng·mL-1、49.98 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精密稱取黃芪傳統(tǒng)飲片42 g，置于圓底燒瓶中，加入420 mL水，浸泡30 min，煮沸，回流提取兩次，每次30 min，合并兩次濾液，減壓濃縮濾液至200 mL，稀釋成0.14 g·mL-1，即得丹參傳統(tǒng)飲片水煎液。

精密稱取黃芪破壁飲片14.00 g，置于研缽中，慢慢加入水，研磨均勻，使成0.14 g·mL-1，即得黃芪破壁飲片混懸液。

2.2 給藥和樣品采集

取健康大鼠18只，雄性，分為2組，每組9只，即黃芪破壁飲片混懸液組和黃芪傳統(tǒng)飲片水煎液組。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水，將配置好供試藥液按照2.5 mL·100g-1灌胃給藥，每種形態(tài)藥材灌胃9只大鼠，給藥后4 h后內(nèi)禁食禁水，給藥前采集空白血樣，灌胃后于5 min、15 min、30 min、1 h、2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h、36 h、48 h、72 h眼眶取血0.5 mL，置EDTA管中，5 000 rpm離心10 min，分離血漿，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜與質(zhì)譜分析條件

色譜條件：色譜柱為 Agilent XDB-C18（1.8 μm，3.0×50 mm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫（洗脫條件見表1）；柱溫為30℃；進(jìn)樣器溫度為20℃；流速為0.2 mL·min-1（前一分鐘不進(jìn)質(zhì)譜）；進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)方式為正離子模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓為3 500 V；氮?dú)鉁囟葹?00℃，氮?dú)饬魉贋? L·min-1；鞘氣溫度為250℃，流速為11 L·min-1；噴嘴電壓為500 V。在此條件下檢測(cè)離子的信息如表2所示。

2.4 血漿樣品的處理

室溫解凍樣品后，精密吸取100.0 μL內(nèi)標(biāo)溶液置于5 mL離心管中，N2吹干，再吸取100 μL供試品溶液，渦旋混合，加入400 μL蛋白沉淀劑（0.1%甲酸），渦旋混合2 min，超聲4 min，13000 rpm 離心5 min，分離上清液400 μL于N2吹干，殘?jiān)?50 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混合2 min，超聲4 min，13 000 rpm離心5 min，取上清液2 μL進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.5 數(shù)據(jù)處理

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)由DAS 3.2.6藥動(dòng)學(xué)軟件處理得到，結(jié)果采用IBMSPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)取對(duì)數(shù)之后兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，三組之間比較采用單因素方差分析，方差不齊則選用非參數(shù)檢驗(yàn)；P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。P＜0.01認(rèn)為具有極顯著性差異。

表2 檢測(cè)離子信息

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 色譜行為及專屬性

空白血漿、含對(duì)照品血漿、含藥血漿離子流圖如圖1，結(jié)果顯示黃芪中5種有效成分與血漿中其他組分分離完全，峰形良好，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素保留時(shí)間為6.9 min、3.2 min、4.3 min、5.2 min、6.7 min。。

3.2 線性范圍和定量限、檢測(cè)限

以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得到黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的回歸方程分別為Y=0.0002X+0.0002、Y=0.0024X-0.0048、Y=0.0057X-0.0141、Y=0.0012X-0.0013、Y=0.0023X-0.0005；濃度依次在 0.91-468.00、0.98-504.00、0.94-482.90、0.95-489.00、0.97-499.80 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于等于0.9954；定量限依次為0.91 ng·mL-1、0.98 ng·mL-1、0.94 ng·mL-1、0.95 ng·mL-1、0.97 ng·mL-1；檢測(cè)限依次為0.30 ng·mL-1、0.33 ng·mL-1、0.31 ng·mL-1、0.32 ng·mL-1、0.32 ng·mL-1。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度

取質(zhì)控樣品于日內(nèi)和日間各測(cè)量6次，連續(xù)測(cè)定3天，計(jì)算精密度。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素日內(nèi)精密度分別為7.24%、5.02%、4.39%、5.48%、2.89%，日間精密度分別為2.83%、2.73%、3.86%、3.39%、2.12%。日內(nèi)、日間RSD均小于10%（n=6），本法所建立的分析方法精密度生物樣品定量分析指導(dǎo)原則的要求。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)及回收率

取血漿樣品測(cè)定峰面積，與流動(dòng)相配制的相同濃度對(duì)照品溶液所測(cè)峰面積相比，計(jì)算血漿的回收率。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素基質(zhì)效應(yīng)分別為90.60%、95.40%、92.93%、80.96%、100.54%；回收率分別為92.74%、102.02%、102.99%、106.65%、100.20%（n=6），5種成分的基質(zhì)效應(yīng)以及回收率均在80%-120%之間，符合生物樣品定量分析指導(dǎo)原則的要求。

圖1 大鼠血漿樣品總離子流圖

圖2 黃芪破壁飲片和傳統(tǒng)飲片中5種有效成分血藥濃度-時(shí)間曲線(Xˉ±SD,n=9)

表3 黃芪破壁飲片與傳統(tǒng)飲片在大鼠血漿中5種有效成分的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(±SD,n=9)

表3 黃芪破壁飲片與傳統(tǒng)飲片在大鼠血漿中5種有效成分的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(±SD,n=9)

注：1-5分別代表黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素成分；A：破壁飲片，B：傳統(tǒng)飲片；與B相比，*P＜0.05；**P＜0.01。

成分飲片藥動(dòng)學(xué)參數(shù)1 2 3 4 5相對(duì)生物利用度2.67±1.18 1.79±0.50 1.46±0.48 2.41±0.58 A B A B A B A B A B Cmax/μg·L-1 7.91±1.54**5.379±1.48 4.28±0.56**3.00±0.24 5.43±103.02**3.49±0.33 3.32±1.33*1.95±0.81 5.43±2.11 4.63±0.98 Tmax/min 318.31±434.10**180±213.71 30.55±56.64 36.66±38.07 8.33±1.21**18.88±8.93 50.55±79.93 41.11±45.81 8.33±5 13.33±7.90 T1/2/min 480±103.92 214.56±148.26 87.31±28.6**41.81±0.29 103.42±22.14 140.16±90.93 94.08±49.86*219.22±13.29 125.83±18.10**210.86±17.37 AUC0-t/（μg·L-1*min）5 166.19±1 594.72**2 222.64±940.73 1 018.29±294.62**572.85±103.61 966.27±199.05*702.13±192.89 528.96±169.66**230.08±78.79 749.73±201.94**429.09±93.22 AUC0-∞/（μg·L-1*min）6 079.20±3 313.60**2 306.60±1 010.76 1 018.37±294.68**572.85±103.61 966.42±199.10 806.54±465.08 529.03±169.64**230.08±78.79 749.73±201.94**429.09±93.22 1.78±0.46

3.5 黃芪破壁飲片和傳統(tǒng)飲片5種成分在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

黃芪破壁飲片混懸液和黃芪傳統(tǒng)飲片水煎液灌胃給藥后，大鼠血漿中5種成分藥時(shí)曲線見圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。結(jié)果顯示，兩者5種有效成分的藥時(shí)曲線趨勢(shì)相似，具有相似的代謝行為，黃芪破壁飲片混懸液中5種有效成分的生物利用度均高于黃芪傳統(tǒng)飲片水煎液。

4 討論

黃芪破壁飲片與傳統(tǒng)飲片中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的AUC0-t、AUC0-∞均具有顯著性差異，以傳統(tǒng)飲片為參比制劑，其相對(duì)生物利用度分別為2.67±1.18、1.79±0.50、1.46±0.48、2.41±0.58、1.78±0.46，且5種成分藥-時(shí)曲線具有相似性，均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)大鼠灌胃給予黃芪破壁飲片混懸液及黃芪傳統(tǒng)水煎液，破壁飲片黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素生物利用度分別提高了167%，79%，46%，141%，78%。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)在此研究之前對(duì)黃芪破壁飲片煎煮、沖泡與傳統(tǒng)飲片煎煮后5種有效成分溶出含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃芪破壁飲片煎煮5-10 min可達(dá)到傳統(tǒng)飲片煎煮30 min的效果，破壁飲片最優(yōu)工藝沖泡15 min后5種成分（黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）可達(dá)到傳統(tǒng)飲片煎煮溶出量的80%-90%[5]，黃芪破壁飲片體外溶出量等于或低于傳統(tǒng)飲片水煎液溶出量。黃芪破壁飲片混懸液5種有效成分的生物利用度均比傳統(tǒng)飲片水煎液高的原因之一是黃芪破壁飲片粉體粒徑小，已達(dá)到破壁狀態(tài)，由于經(jīng)植物細(xì)胞壁粉碎，可使有效物質(zhì)更好地溶出釋放，同時(shí)提高藥物在胃腸道的分散度和溶出度使藥物的藥效增強(qiáng)[6]；原因之二是黃芪傳統(tǒng)飲片水煎液中能被體內(nèi)吸收利用的有效成分含量為溶于水中的總量，藥渣中殘留的有效成分無(wú)法利用。黃芪破壁飲片混懸液進(jìn)入體內(nèi)后，破壁粉體中的有效成分持續(xù)溶出，體內(nèi)可吸收利用的有效成分含量是粉體中所包含的所有物質(zhì)的總量，因此藥物吸收利用率大幅提升，從而提高了活性成分生物利用度。

本研究室在該研究前對(duì)破壁飲片混懸液與傳統(tǒng)飲片水煎液的藥效、急性毒性進(jìn)行比較研究，其研究結(jié)果與本文結(jié)論相似，具體研究如下。決明子破壁飲片混懸液為傳統(tǒng)飲片1/2劑量以下，小鼠小腸推進(jìn)作用與傳統(tǒng)飲片常規(guī)量效果相似[7]。丹參破壁飲片在低于傳統(tǒng)飲片的劑量下即可發(fā)揮與傳統(tǒng)飲片相似的藥效，且丹參破壁飲片和傳統(tǒng)飲片用藥安全性相似[8]。參斛復(fù)方中藥破壁飲片在給藥劑量?jī)H為參斛復(fù)方中藥合劑的1/3條件下，改善冠心病的胸悶、胸痛、心悸等癥狀的療效更佳[9]。丹參破壁飲片混懸液與丹參傳統(tǒng)飲片水煎液中的丹參酮ⅡA和隱丹參酮在人體內(nèi)生物不等效，破壁飲片混懸液中丹參酮ⅡA和隱丹參酮生物利用度明顯高于傳統(tǒng)飲片水煎液[10]。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，5種成分藥-時(shí)曲線均會(huì)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，文獻(xiàn)報(bào)道其原因之一可能是其存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象。肝腸循環(huán)是指經(jīng)膽汁或部分經(jīng)膽汁排入腸道的藥物，在腸道中又重新被吸收，經(jīng)門靜脈又返回肝臟的現(xiàn)象[11]。另外一種解釋就是可能藥物在胃腸道存在多吸收位點(diǎn)，因此導(dǎo)致其出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象[12]。至于其具體是通過(guò)哪一種機(jī)制，現(xiàn)有研究資料并未能給出明確解釋，后期工作可對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究，以探明相關(guān)機(jī)制。

中藥破壁飲片是一種創(chuàng)新型中藥飲片，提高了中藥飲片的均勻性、利用率，滿足現(xiàn)代人的用藥需求。

1 衛(wèi)生部藥典委員會(huì),中國(guó)藥典,一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2015.

2 楊澤銳,彭麗華,鄧雯,等.中藥粉體的發(fā)展歷史概述.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(12):141-143+145.

3 Chen H,Zhou X,Zhao Y,et al.HPLC-DAD-ELSD Combined Pharmacodynamics and Serum Medicinal Chemistry for Quality Assessment of Huangqi Granule.Plos One,2015,10(4):e0123176.

4 Nurahmat M,Chen M X,Luo Q L,et al.Rapid characterization and determination of multiple components in Bu-Shen-Yi-Qi-Fang by high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization and quadrupole time-of-flight mass spectrometry.J Sep Sci,2014,37(23):3509-3517.

5 楊澤銳,程翔燕,鄧雯,等.黃芪破壁飲片煎煮、沖泡與傳統(tǒng)飲片煎煮后5種有效成分溶出含量比較.中國(guó)藥房,2017,28(19):2688-2692.

6 黃昆,舒朝暉,劉根凡.中藥飲片粉碎粒度研究進(jìn)展.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2005,12(4):97-98.

7 程翔燕,楊澤銳,鄧雯,等.決明子破壁飲片對(duì)小腸推進(jìn)及急性毒性的研究.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2016,14(15):144-145.

8 徐吉銀,楊迎暴,徐江平,等.丹參破壁飲片、傳統(tǒng)飲片對(duì)大鼠心肌缺血和血液流變學(xué)的影響及急性毒性研究.北方藥學(xué),2016,13(7):129-131.

9 郭文賢,李亮,成金樂(lè),等.參斛復(fù)方中藥破壁飲片治療冠心病的臨床療效研究.中藥材,2017,40(8):1963-1965.

10 鄭玲杰,鄧雯,邢露,等.丹參傳統(tǒng)飲片水煎液與破壁飲片混懸液中隱丹參酮及其代謝物的藥代動(dòng)力學(xué)研究.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2017,22(5):545-550.

11 Zhu Z,Zhao L,Liu X,et al.Comparative pharmacokinetics of baicalin and wogonoside by liquid chromatography-mass spectrometry after oral administration of Xiaochaihu Tang and Radix scutellariae extract to rats.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(24):2184-2190.

12 Yin O Q,TomLinson B,Chow A H,et al.A modified two-portion absorption model to describe double-peak absorption profiles of ranitidine.Clin Pharmacokinet,2003,42(2):179-192.