經(jīng)胃左動脈注入VX2瘤粒建立兔胃癌模型

馮國棟， 余 輝，馮建防， 周 斌，席 瑋， 武 貝，張靜淵， 陳環(huán)球，嚴(yán) 楓， 陳 駿

胃癌是常見惡性腫瘤之一，多數(shù)患者確診時已至中晚期。部分進(jìn)展期胃癌術(shù)前需行全身或局部化療、動脈栓塞等，以達(dá)到降低腫瘤分期及術(shù)后復(fù)發(fā)率效果［1-3］。目前適用于外科、介入治療乃至影像診斷的胃腫瘤動物模型較少。本實驗采用DSA導(dǎo)引下經(jīng)胃左動脈輸注瘤粒方法建立兔VX2胃癌模型，具有成功率高、成瘤時間短、血供豐富及影像學(xué)表現(xiàn)典型的特點，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與器材

取18只新西蘭大白兔（東南大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK蘇2010-0004），雌雄不限，體重2.5～3 kg。VX2腫瘤細(xì)胞株（東南大學(xué)分子影像重點實驗室）每隔2周經(jīng)兔大腿部肌肉成瘤傳代。

主要實驗器材包括BV Pulsera移動式C形臂X射線系統(tǒng)、OminiDiagnost Eleva數(shù)字胃腸造影機（荷蘭Philips公司）、2.5 F微導(dǎo)管、股動脈穿刺針套件（日本Terumo公司）、戊巴比妥鈉（北京百奧萊博科技公司）、肝素鈉（1.25 U/支，江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司）、金霉素眼膏（2 g/支，上海朝暉藥業(yè)公司）、硫酸鋇干混懸劑（青島紅蝶新材料公司）、蘇木精-伊紅（HE，上海碧云天生物技術(shù)公司）、4%甲醛溶液（江蘇省腫瘤醫(yī)院病理科）。

1.2 VX2瘤粒制作

VX2腫瘤細(xì)胞經(jīng)兔大腿外側(cè)部肌內(nèi)注射2周后建立傳代荷瘤兔。無菌環(huán)境下采用外科方法取出腫瘤，沿腫瘤中線切開并剔除中心少量壞死區(qū)域，0.9%NaCl溶液沖洗中心血凝塊，于靠近邊緣部位準(zhǔn)確剪取灰白色魚肉樣組織并置于0.9%NaCl溶液中，外科剪修剪為大小約為0.5 mm×0.5 mm瘤粒備用。

1.3 兔胃左動脈DSA及瘤粒輸注

實驗兔術(shù)前禁食、禁水24 h，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉（1 mL/kg）后仰臥位固定于木質(zhì)手術(shù)臺上，右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)備皮消毒鋪單，外科無菌方式暴露腿部股動脈主干；直視下采用股動脈穿刺針成功穿刺股動脈并置入2.5 F微導(dǎo)管，微導(dǎo)管選入腹腔干作DSA造影，分辨胃左動脈，將微導(dǎo)管超選至目標(biāo)動脈，再次造影證實（圖1①）；用1 mL注射器抽取混有瘤粒的0.9%NaCl溶液1 mL（含瘤粒約20粒），通過微導(dǎo)管緩慢輸注后繼續(xù)輸注0.9%NaCl溶液3 mL沖洗導(dǎo)管內(nèi)剩余腫瘤組織塊，再次手推對比劑造影確認(rèn)靶血管被栓塞（圖1②）；術(shù)畢結(jié)扎股動脈，縫合肌層及皮膚，切口處涂抹金霉素眼膏預(yù)防切口感染。

1.4 DSA、消化道鋇餐造影及病理學(xué)檢查

術(shù)后2、4 d，分別隨機抽取3只實驗兔，處死后獲取大體標(biāo)本作病理學(xué)檢查。12只實驗兔于術(shù)后6 d禁食禁水24 h，術(shù)后7 d經(jīng)左側(cè)股動脈同樣方式，微導(dǎo)管超選至胃左動脈作DSA造影。術(shù)畢于DSA手術(shù)臺，透視下插入自制胃管至食管中上段，再將實驗兔置于胃腸造影機檢查床；經(jīng)胃管注射約15 mL高濃度鋇餐后，再注入約40 mL空氣，不同體位翻轉(zhuǎn)實驗兔，使鋇劑涂抹均勻后多方位攝影點片；隨機處死3只模型兔，獲取胃大體標(biāo)本觀察，并對比造影結(jié)果選取病變區(qū)域，于4%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，制作切片作HE染色。余9只模型兔術(shù)后24 h予以正常飲食，觀察記錄生存時間，并于兔自然死亡后獲取標(biāo)本，觀察標(biāo)本大體情況并作HE染色光鏡檢查。

2 結(jié)果

2.1 建模成功率及術(shù)后大體情況

18只模型兔胃左動脈DSA及瘤粒輸注均成功，成功率100%。術(shù)后18只模型兔均出現(xiàn)明顯進(jìn)食進(jìn)水減少、體重減輕等。術(shù)后2、4、7 d剩余模型兔均成活，9 只剩余模型兔于術(shù)后 10 d（3 只）、11 d（1 只）、12 d（2 只）、14 d（1 只）、15 d（2 只）死亡。

2.2 DSA血管造影及消化道鋇餐造影

12只模型兔術(shù)后7 d胃左動脈DSA可見胃底近賁門處腫瘤染色，呈富血供狀態(tài)（圖1③）；氣鋇雙重造影可見胃底部局部黏膜正常結(jié)構(gòu)消失，病灶部位可見壓跡及雙邊征，與DSA造影相符合（圖1④）。

圖1 實驗兔胃左動脈DSA及消化道鋇餐造影顯像

2.3 大體標(biāo)本及光鏡檢查

術(shù)后2、4 d，大體標(biāo)本可見胃底部近大彎側(cè)局部黏膜明顯水腫、潰瘍形成（圖2①②）；鏡下可見胃黏膜局部缺失呈潰瘍改變、黏膜下明顯腫脹，未見明顯黏膜及肌層組織腫瘤侵犯，局部動脈血管內(nèi)可見鱗狀細(xì)胞癌栓（圖3①～③）。術(shù)后7 d，大體標(biāo)本可見胃底靠近賁門部位病灶，表面有火山口樣潰瘍，周邊黏膜紊亂、水腫明顯，未見明顯穿孔征象（圖2③）；術(shù)后自然死亡模型兔均可見病變部位局部穿孔，穿孔處周邊黏膜紊亂并向病灶聚集伴明顯充血水腫（圖2④）。鏡下可見大量腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布，聚集于肌層并向黏膜及漿膜層侵犯（圖3④～⑥）。

圖2 模型兔標(biāo)本大體觀（沿胃大彎側(cè)切開）

2.4 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況見表1。

3 討論

目前用于實驗研究的胃癌動物模型常見于鼠等嚙齒類動物，采用原位移植法、移植瘤法等方式構(gòu)建，此種模型可采用人類來源的腫瘤細(xì)胞株，能更好地模擬人類胃癌的生物學(xué)行為等［4-5］，但缺點是體積小，不太適合于介入治療、外科手術(shù)，乃至影像診斷等相關(guān)研究。VX2腫瘤細(xì)胞具有較高的惡性程度，生長速度快，幾乎可種植至新西蘭大白兔各個器官組織中成瘤［6-7］。兔胃解剖及血供系統(tǒng)與人類較為相似，體形相對較大，比較適合于介入、外科治療和影像診斷等相關(guān)實驗研究。目前關(guān)于兔VX2胃癌模型的文獻(xiàn)報道較少，且局限于采用外科切開暴露胃壁直視下注射瘤粒方法，該方法創(chuàng)傷大，有較高的腹膜種植轉(zhuǎn)移率［8-9］。本實驗采用經(jīng)胃左動脈輸注瘤粒，成功建立了兔VX2胃癌模型。該方法創(chuàng)傷小、成功率高；實驗表明兔VX2胃癌生長速度快、血供豐富、成瘤部位均一、影像學(xué)表現(xiàn)典型。該方法建立的兔VX2胃癌模型，DSA、消化道造影與大體病理表現(xiàn)一致，有望應(yīng)用于介入化療藥物和栓塞劑、影像診斷新技術(shù)、外科手術(shù)方式等的實驗研究與探索。

本實驗?zāi)[瘤種植后2、4 d可見兔胃底局部黏膜腫脹明顯及潰瘍形成，鏡下見局部黏膜層缺損，肌層完整呈淺潰瘍改變，黏膜及肌層均未見明顯腫瘤組織侵犯，局部動脈血管內(nèi)可見鱗狀細(xì)胞癌栓。這些表現(xiàn)與本研究設(shè)計相符合：從胃左動脈輸注瘤粒，進(jìn)而向相關(guān)鄰近區(qū)域侵犯生長。從移植腫瘤進(jìn)展看，實驗7 d見病灶呈火山口樣潰瘍，周邊黏膜明顯充血水腫并向病灶聚集，未見明顯穿孔征象，腫瘤細(xì)胞主要分布于胃壁肌層并向黏膜及漿膜層侵犯；10 d即出現(xiàn)3只腫瘤模型兔自然死亡；10、11、12、14、15 d可見腫瘤局部穿孔征象；14 d可見網(wǎng)膜、肝、肺等轉(zhuǎn)移，組織學(xué)檢查可見大量腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布于胃壁全層。這些表現(xiàn)與臨床胃癌發(fā)展過程較為相似，胃腫瘤穿孔可能是動物死亡的主要原因。文獻(xiàn)報道VX2腫瘤種植2周后開始于皮下、肌肉及肝臟內(nèi)出現(xiàn)明顯壞死，因此對VX2肝臟、肌肉等原位腫瘤動物模型，術(shù)后2周是進(jìn)行相關(guān)實驗研究較為合適的時間點［7，10］。本實驗術(shù)后10 d獲取的標(biāo)本即出現(xiàn)穿孔征象，提示該胃癌模型適合于1周左右進(jìn)行相關(guān)實驗研究。

圖3 模型兔術(shù)后病理學(xué)表現(xiàn)

表1 實驗兔胃腫瘤及轉(zhuǎn)移n

消化道鋇餐造影能夠觀察胃內(nèi)病灶大小、形態(tài)、部位，顯示胃腔形態(tài)，動態(tài)觀測胃腸道蠕動情況等［11-12］。本實驗消化道鋇餐造影結(jié)果顯示胃底部病灶顯示清晰，可見局部黏膜走行紊亂并可見壓跡及雙邊征，與臨床胃癌影像學(xué)表現(xiàn)相似；動脈DSA造影顯示腫瘤病灶血供豐富，腫瘤部位與胃腸造影相符合，為該模型后續(xù)應(yīng)用于胃癌的介入栓塞劑開發(fā)和治療提供了實驗依據(jù)。

本實驗未觀察兔成瘤發(fā)展速度和時間是否與注入的VX2瘤粒數(shù)量和大小有關(guān)，以滿足不同實驗?zāi)康暮托枨螅?dāng)屬不足之處，值得進(jìn)一步探索；另一不足是未對實驗兔行CT、MR檢查，一則局限于兔呼吸和腸道運動，再則兔消化道準(zhǔn)備不太方便?？傊?，本研究建立的兔胃癌模型操作簡便、創(chuàng)傷小、成瘤率高、成瘤部位和影像學(xué)表現(xiàn)均一，可用于介入動脈化療栓塞、影像診斷及外科手術(shù)等相關(guān)實驗研究。

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