基于EGCG，ECG和咖啡堿含量的烏龍茶產(chǎn)地鑒定

曹瓊，蘇歡，宛曉春，寧井銘

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036

烏龍茶屬于半發(fā)酵茶，由鮮葉經(jīng)曬青、晾青、做青、殺青、揉捻及干燥等工序加工而成，其生產(chǎn)和加工地區(qū)主要集中在閩南、閩北、廣東和臺灣[1]。除此之外，安徽、浙江、湖北、貴州等省也生產(chǎn)烏龍茶。不同地區(qū)的烏龍茶品質(zhì)特征各異，因此價(jià)格也存在差異。近年來，隨著烏龍茶產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，烏龍茶越來越受消費(fèi)者的喜愛，一方面給茶葉生產(chǎn)商帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)效益；另一方面，烏龍茶品種繁多，部分花色品種外形特征相似，從而存在假冒原產(chǎn)地產(chǎn)品現(xiàn)象，給茶葉市場的監(jiān)管增加難度。因此鑒別烏龍茶的產(chǎn)地，非常有必要。

傳統(tǒng)鑒定烏龍茶產(chǎn)地的方法依賴于感官經(jīng)驗(yàn)，容易受到人為因素及周圍環(huán)境的影響。由于受到不同地理環(huán)境條件、茶樹品種、采摘方式及加工工藝的影響，不同產(chǎn)區(qū)的烏龍茶在感官品質(zhì)及理化成分上存在差異[2]，這使得利用理化成分來鑒定烏龍茶的產(chǎn)地成為可能。有學(xué)者通過對烏龍茶中金屬元素及多酚、水浸出物等生化成分進(jìn)行檢測，結(jié)合因子分析和判別分析實(shí)現(xiàn)了對烏龍茶品質(zhì)和產(chǎn)地的判定[3]。此外有學(xué)者采用 HS-SPME/GC–MS技術(shù)結(jié)合主成分分析及聚類分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來判定烏龍茶的品種[4]。

本研究對茶葉中的兒茶素、咖啡堿、沒食子酸和茶氨酸等成分采用 HPLC方法進(jìn)行檢測，并用遺傳算法和連續(xù)投影算法篩選出特征性的化合物，然后分別結(jié)合支持向量機(jī)、隨機(jī)森林和反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)路等機(jī)器學(xué)習(xí)方法建立烏龍茶產(chǎn)地鑒定模型，從而找出一種能夠量化判別烏龍茶產(chǎn)地的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)樣品：本研究共收集烏龍茶樣品130個(gè)，其中閩南71個(gè)，閩北29個(gè)，廣東15個(gè)，臺灣 15個(gè)。所收集的樣品為來自不同企業(yè)2015—2017年加工生產(chǎn)的不同等級的烏龍茶樣品。將樣品研磨成粉，使磨碎樣品能完全通過孔徑為600 μm的篩，并放置于4℃貯存。

HPLC系統(tǒng)：Waters E2695高效液相色譜儀，2489的紫外可見光檢測器和 Waters Empower色譜管理系統(tǒng)；HPLC色譜分析柱：Phenomen 公司 5 μm，Gemini-NX C18，250 mm×4.6 mm色譜柱用于檢測兒茶素、沒食子酸及咖啡堿；Phenomen公司 4 μm，Synergi Hydro-RP C18，250 mm×4.6 mm色譜柱用于檢測茶氨酸；AB104-N型萬分之一電子天平，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-8D型水浴鍋，上海一恒科技有限公司；SC-3610型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

兒茶素標(biāo)品：兒茶素（C，純度≥99%）、表兒茶素（EC，純度≥99%）、表沒食子兒茶素（EGC，純度≥98%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，純度≥99%）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG，純度≥98%）、沒食子酸（GA，純度≥99%）、咖啡堿（純度≥99%）、茶氨酸（純度100%），均購于美國Sigma公司；色譜級乙腈、甲醇，美國 Tedia公司；EDTA、抗壞血酸均購于上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水分的測定

水分的測定按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO1573：1980中的（103±2）℃恒重法[5]。

1.2.2 兒茶素、沒食子酸及咖啡堿的測定

茶葉中兒茶素、沒食子酸的測定均按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 14502—1:2005中的HPLC法進(jìn)行測量[6]。最終物質(zhì)含量單位均以干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示（%）。

烏龍茶樣品中咖啡堿含量的測定按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10727:2002中的HPLC法進(jìn)行測量[7]。采用Waters E2695高效液相色譜儀，型號為2489的紫外可見光檢測器進(jìn)行測量。

1.2.3 茶氨酸的測定

烏龍茶樣品中茶氨酸含量的測定按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 19563:2017中的HPLC法進(jìn)行測定[8]。采用Waters E2695高效液相色譜儀，型號為2489的紫外可見光檢測器進(jìn)行測量。

1.2.4 SPSS 21.0軟件

用于進(jìn)行ANOVA分析，比較不同產(chǎn)地烏龍茶樣品理化成分的差異；Matlab 2014a用于提取特征化學(xué)指標(biāo)并建立判別模型，驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)烏龍茶理化成分的差異

采用高效液相色譜法對 4個(gè)傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的130個(gè)烏龍茶樣品中的多酚、咖啡堿及茶氨酸含量進(jìn)行檢測，并用SPSS 21.0對不同產(chǎn)區(qū)烏龍茶的理化成分進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果如表1所示。由表中可知，廣東烏龍茶中的沒食子酸（GA）、咖啡堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）及兒茶素總量等明顯高于其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)；而臺灣烏龍茶中的表沒食子兒茶素（EGC）和兒茶素（C）的含量明顯高于其他產(chǎn)區(qū)，但咖啡堿和ECG的含量卻明顯低于閩南、閩北和廣東烏龍；4個(gè)產(chǎn)區(qū)烏龍茶樣品的咖啡堿、EGCG和ECG含量存在顯著性差異。由于4個(gè)產(chǎn)區(qū)烏龍茶的這些理化成分含量之間存在差異，因此本研究旨在依據(jù)這些化學(xué)成分，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法建立其產(chǎn)地鑒定模型。

2.2 主要理化成分的主成分分析

針對上述檢測的9個(gè)理化指標(biāo)，首先采用主成分分析法提取與烏龍茶產(chǎn)地相關(guān)的主成分，其前兩個(gè)主成分解釋了變量總方差的97.35%，其中主成分1（PC1）解釋了84.87%，第二主成分（PC2）解釋了12.48%。4個(gè)產(chǎn)區(qū)烏龍茶樣品中兒茶素、沒食子酸、茶氨酸及咖啡堿等理化成分的主成分得分圖如圖1所示，可以看出，廣東烏龍、臺灣烏龍和閩南烏龍可以完全區(qū)分開，但閩北烏龍茶的分布與閩南烏龍和臺灣烏龍均有重疊。因此采用主成分的聚類結(jié)果并不能實(shí)現(xiàn)對 4個(gè)產(chǎn)區(qū)烏龍茶的有效區(qū)分。為了實(shí)現(xiàn)對4個(gè)傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)烏龍茶的高效判別和鑒定，采用遺傳算法和連續(xù)投影算法來篩選特征的化學(xué)指標(biāo)，結(jié)合支持向量機(jī)、反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以及隨機(jī)森林等分類模型，建立一種用少量的理化成分高效鑒定烏龍茶產(chǎn)地的方法。

2.3 特征指標(biāo)篩選方法及結(jié)果

特征指標(biāo)篩選的目的是減少測量空間的維度，提取相關(guān)信息進(jìn)行模式識別，從而建立烏龍茶產(chǎn)地鑒定模型，來預(yù)測烏龍茶的產(chǎn)地。本研究采用遺傳算法和連續(xù)投影算法來提取特征性的化學(xué)指標(biāo)。

遺傳算法（Genetic algorithm）是一類借鑒生物界自然選擇和自然遺傳機(jī)制的隨機(jī)搜索算法[9-10]，模擬自然選擇和自然遺傳過程中發(fā)生的繁殖、交叉和基因突變現(xiàn)象，在每次迭代中都保留一組候選解，并按某種指標(biāo)從解中選取較優(yōu)的個(gè)體，利用遺傳算子（選擇、交叉和變異）對這些個(gè)體進(jìn)行組合，產(chǎn)生新一代的候選解，重復(fù)此過程，直到滿足某種收斂指標(biāo)為止。在本研究中，經(jīng)過遺傳算法篩選出的化合物如圖2所示，分別為咖啡堿、EGCG和ECG。由表1可知，遺傳算法篩選出的3種化合物，其4個(gè)產(chǎn)區(qū)之間的含量均存在顯著差異。

表1 不同產(chǎn)區(qū)烏龍茶化學(xué)成分含量Table 1 Chemical contents of Oolong tea from different geographical origins%

圖1 4個(gè)產(chǎn)區(qū)烏龍茶中理化成分的主成分得分圖Fig. 1 PC1 vs. PC2 score plot of four origins of Oolong tea by principal component analysis

連續(xù)投影算法（Successive projections algorithm, SPA）是一種前向循環(huán)的特征變量提取方法[11]，可以通過使矢量空間共線性最小化，消除冗余信息來減少建模的變量，從而提高建模效率[12]。本研究中由連續(xù)投影算法篩選出的對烏龍茶產(chǎn)地鑒定起重要作用的化合物如圖3所示，分別為EGC、EGCG、ECG和兒茶素總量。結(jié)合表1可知，4個(gè)產(chǎn)區(qū)烏龍茶 EGCG、ECG的含量均存在顯著差異，而閩南、閩北及臺灣烏龍茶之間EGC的含量差異顯著，閩南、閩北及廣東烏龍茶之間的兒茶素總量差異顯著，這使得用這些指標(biāo)來建立模型鑒定不同產(chǎn)地的烏龍茶成為可能。

2.4 不同分類模型及其判別結(jié)果的比較

支持向量機(jī)（Support vector machine,SVM）是由Vapnik等人于70年代提出，是參數(shù)空間的一種線性分類器[13]。支持向量機(jī)方法通過擴(kuò)大分類面與訓(xùn)練樣本之間的距離來減少判別誤差的上確界，進(jìn)而尋找最優(yōu)的分類面。近年來，支持向量機(jī)在茶葉類別鑒定方面應(yīng)用廣泛[14-15]。本研究中用支持向量機(jī)分類模型結(jié)合不同化合物篩選結(jié)果對 4個(gè)產(chǎn)地的烏龍茶進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表2所示。由表2可知，沒食子酸等 9個(gè)原始理化指標(biāo)結(jié)合支持向量機(jī)模型可以對閩南、閩北、廣東及臺灣4個(gè)產(chǎn)區(qū)的烏龍茶實(shí)現(xiàn)最準(zhǔn)確的鑒定，訓(xùn)練集的判別率為97.70%，而預(yù)測集的判別率為93.02%。

反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Back propagation artificial neural networks, BPNN）是一種非線性的數(shù)據(jù)分析方法，應(yīng)用極為廣泛[16-17]。BPNN采用輸入層、隱含層和輸出層3層結(jié)構(gòu)，通過控制節(jié)點(diǎn)的權(quán)重，使系統(tǒng)誤差最小，從而提高判別率。本研究基于兒茶素、沒食子酸、咖啡堿和茶氨酸等理化成分，采用BPNN模型判別烏龍茶的產(chǎn)地。該模型結(jié)合不同指標(biāo)的判別結(jié)果如表3所示。由表中可知，BPNN模型結(jié)合不同理化指標(biāo)均能實(shí)現(xiàn)對烏龍茶產(chǎn)地的高效判定，但遺傳算法篩選的指標(biāo)判別結(jié)果最好，且篩選出的化合物種類最少，即基于咖啡堿、EGCG和ECG的遺傳算法結(jié)合 BPNN模型判別率最高，訓(xùn)練集和預(yù)測集的判別率分別為97.13%和98.38%。

隨機(jī)森林（Random forest, RF）分類器最早是由Leo Breiman和Adele Cutler提出的[18]，是一種高效的組合分類法，在許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，如農(nóng)業(yè)[19]、醫(yī)學(xué)[20]等。隨機(jī)森林通過構(gòu)建決策樹來建立模型，每一棵決策樹之間沒有關(guān)聯(lián)，將未知樣本輸入隨機(jī)森林時(shí)，根據(jù)決策樹被選擇的次數(shù)，樣本屬于被選擇最多的一類[21]。本研究中采用隨機(jī)森林分類算法結(jié)合不同的化合物對烏龍茶的產(chǎn)地進(jìn)行劃分。隨機(jī)森林分類模型的判別結(jié)果如表4所示，由表4可知，訓(xùn)練集的判別率均為100%，而原始的9個(gè)檢測指標(biāo)及遺傳算法篩選的指標(biāo)，結(jié)合隨機(jī)森林算法，對烏龍茶產(chǎn)地鑒定，預(yù)測集的判別率均為 95.34%，但遺傳算法篩選的指標(biāo)少，因此遺傳算法結(jié)合隨機(jī)森林模型判別結(jié)果最好。

圖2 遺傳算法篩選化合物結(jié)果Fig. 2 Compound selection by genetic algorithm

圖3 連續(xù)投影算法篩選化合物的結(jié)果Fig. 3 Compound selection by successive projections algorithm

表2 支持向量機(jī)模型的判別結(jié)果Table 2 Discriminant results of support vector machine model%

表3 反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的判別結(jié)果Table 3 Discriminant results of back propagation artificial neural networks model%

表4 隨機(jī)森林模型的判別結(jié)果Table 4 Discriminant results of random forest model%

3 討論

本研究依據(jù) ISO標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法檢測了130個(gè)烏龍茶樣品的多酚、咖啡堿及茶氨酸等理化成分，并用遺傳算法和連續(xù)投影算法對原始的檢測指標(biāo)進(jìn)行篩選，篩選出一些特征性的化合物，基于不同的化合物結(jié)合 3種經(jīng)典的分類模型（支持向量機(jī)、反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)森林）對 4個(gè)產(chǎn)地的烏龍茶樣品進(jìn)行判別和預(yù)測。結(jié)果表明，遺傳算法篩選出的化合物（咖啡堿、EGCG和 ECG）結(jié)合 BPNN模型能夠利用較少的理化指標(biāo)實(shí)現(xiàn)對訓(xùn)練集樣品和預(yù)測集樣品的高效判別，且訓(xùn)練集的判別率為 97.13%，預(yù)測集的判別率為 98.38%。對于未知產(chǎn)地的烏龍茶樣品，用HPLC方法檢測其EGCG、ECG和咖啡堿的含量，輸入反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，即可判別出屬于 4個(gè)傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的某個(gè)產(chǎn)區(qū)，對于 4個(gè)傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)之外的烏龍茶，則需大量樣本，檢測兒茶素等理化成分，然后依據(jù)遺傳算法和反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型修訂參數(shù)，然后判別產(chǎn)地。該鑒定方法相比于傳統(tǒng)的感官審評方法，排除了環(huán)境等因素的影響，鑒定結(jié)果更加穩(wěn)定和科學(xué)；而且該方法只需要EGCG、ECG和咖啡堿3個(gè)指標(biāo)，相比于其他檢測方法更加簡便。因此該模型可以為烏龍茶產(chǎn)地的量化判別提供理論依據(jù)，從而為規(guī)范烏龍茶市場作出貢獻(xiàn)。

[1] 梅宇, 王智超. 2016年全國烏龍茶產(chǎn)銷形勢調(diào)研報(bào)告[J].廣東茶業(yè), 2017(Z1): 1-8.

[2] 蔡烈偉, 許勇泉, 周炎花, 等. 不同產(chǎn)區(qū)烏龍茶感官品質(zhì)與茶湯化學(xué)成分分析[J]. 福建茶葉, 2016, 38(11): 17-19.

[3] 孫威江, 董青華, 周衛(wèi)龍, 等. 烏龍茶品質(zhì)評定與產(chǎn)品判別研究[J]. 茶葉科學(xué), 2011, 31(4): 305-312.

[4] Lin J, Zhang P, Pan Z, et al. Discrimination of Oolong tea(Camellia sinensis) varieties based on feature extraction and selection from aromatic profiles analysed by HS-SPME/GC–MS [J]. Food Chemistry, 2013, 141(1): 259-265.

[5] ISO 1573. Tea-Determination of loss in mass at 103 degrees C [S]. Technical Committee ISO/TC 34: Agricultural Food Products, 1980.

[6] ISO 14502-2. Determination of substances characteristic of green and black tea—Part 2: content of catechins in green tea—Method using high performance liquid chromatography,MOD [S]. Technical Committee ISO/TC 34, Food Products,Subcommittee SC 8, Tea, 2005.

[7] ISO 10727. Tea and instant tea in solid form—Determination of caffeine content—Method using high-performance liquid chromatography [S]. Technical Committee ISO/TC 34, Food Products, Subcommittee SC 8, Tea, 2002.

[8] ISO 19563. Determination of theanine in tea and instant tea in solid form using high performance liquid chromatography[S]. Technical Committee ISO/TC 34, Food Products,Subcommittee SC 8, Tea, 2017.

[9] Wiegand P, Pell R, Comas E. Simultaneous variable selection and outlier detection using a robust genetic algorithm [J]. Chemometrics & Intelligent Laboratory Systems, 2009, 98(2): 108-114.

[10] Leardi R, Seasholtz M B, Pell R J. Variable selection for multivariate calibration using a genetic algorithm: prediction of additive concentrations in polymer films from Fourier transform-infrared spectral data [J]. Analytica Chimica Acta,2002, 461(2): 189-200.

[11] Soares S, Gomes A A. The successive projections algorithm[J]. Trac Trends in Analytical Chemistry, 2013, 42(42):84-97.

[12] 陳斌, 孟祥龍, 王豪. 連續(xù)投影算法在近紅外光譜校正模型優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 分析測試學(xué)報(bào), 2007(1): 66-69.

[13] 劉華煜. 基于支持向量機(jī)的機(jī)器學(xué)習(xí)研究[D]. 大慶: 大慶石油學(xué)院, 2005.

[14] Zhao J, Chen Q, Huang X, et al. Qualitative identification of tea categories by near infrared spectroscopy and support vector machine [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 41(4): 1198-1204.

[15] Chen Q, Zhao J, Fang C H, et al. Feasibility study on identification of green, black and Oolong teas using near-infrared reflectance spectroscopy based on support vector machine (SVM) [J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2007, 66(3): 568-574.

[16] 歐文娟, 孟耀勇, 張小燕, 等. 紫外可見吸收光譜結(jié)合主成分-反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)鑒別真假蜂蜜[J]. 分析化學(xué),2011, 39(7): 1104-1108.

[17] 王麗瓊, 范琦, 易珍奎, 等. HPLC指紋圖譜結(jié)合反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和判別分析鑒定不同的麻黃藥材[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 37(5): 73-77.

[18] 李欣海. 隨機(jī)森林模型在分類與回歸分析中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2013, 50(4): 1190-1197.

[19] 馬玥, 姜琦剛, 孟治國, 等. 基于隨機(jī)森林算法的農(nóng)耕區(qū)土地利用分類研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2016, 47(1):297-303.

[20] 詹曙, 姚堯, 高賀. 基于隨機(jī)森林的腦磁共振圖像分類[J].電子測量與儀器學(xué)報(bào), 2013, 27(11): 1067-1072.

[21] 方匡南, 吳見彬, 朱建平, 等. 隨機(jī)森林方法研究綜述[J].統(tǒng)計(jì)與信息論壇, 2011, 26(3): 32-38.