黑茶真菌污染研究進(jìn)展及探討

姜依何，胥偉，朱旗*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128

真菌毒素（Mycotoxins）是由真菌（Fungi）產(chǎn)生的一類具有細(xì)胞、器官或機(jī)體毒性的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于食品和飼料中，主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉素、伏馬毒素、單端孢霉烯族毒素等種類[1-4]。真菌毒素的研究范圍集中于產(chǎn)毒菌株的確證[5]、生物合成通路的解析[6]、產(chǎn)毒條件的研究[7]、暴露值的評估[8]、生物毒理性影響[9]、共軛型隱蔽毒素的分析[10]、檢測技術(shù)的建立[11-13]、脫毒（或解毒）材料的篩選和方法的建立[14]等，為降低食品風(fēng)險、減少危害提供理論及技術(shù)支持，在保障食品安全方面具有重要意義。

近年來隨著消費(fèi)者對純天然飲品需求量的增加及茶葉保健功效的不斷深入研究，特別是在減肥降脂[15]、調(diào)理代謝[16]等方面生物活性的科學(xué)確證，使得全球范圍內(nèi)茶葉消費(fèi)量得到不斷提高。在茶葉加工過程中，以微生物胞外酶催化為主導(dǎo)作用促進(jìn)品質(zhì)轉(zhuǎn)化形成其特有品質(zhì)風(fēng)格的茶類為黑茶?，F(xiàn)有黑茶微生物的研究已明確曲霉屬真菌（2013年，散囊菌屬的部分菌株已移入曲霉屬，冠突散囊菌即在此列[17]）為黑茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群[18-20]。而從食品安全的角度考慮，曲霉屬（Aspergillus）真菌可產(chǎn)生多種真菌毒素，如：黃曲霉毒素（Aflatoxins）[21]、赭曲霉素（Ochratoxins）[4]、橘霉素（Citrinin）[21-22]、環(huán)匹阿尼酸（Cyclopiazonic acid）[23]、棒曲霉素（Patulin）[24]、青霉酸（Penicillic acid）[25]等。由于黑茶可長期儲存的特性，從貯存的角度考慮，有研究表明該階段有青霉屬（Penicillium）真菌存在[26-27]，青霉屬真菌亦可產(chǎn)生多種真菌毒素，除上述真菌毒素之外[28]，還存在如下數(shù)種：婁地青霉素C（Roquefortine C）[29]、PR毒素（PR-toxin）[4]等。

在已有的研究中，雖無直接研究成果證明黑茶的真菌毒素暴露水平對消費(fèi)者產(chǎn)生了毒理性影響，但部分學(xué)者已經(jīng)報道了黑茶真菌毒素方面的研究成果。特別是近期針對真菌污染黑茶可能產(chǎn)生的有害微生物及其毒素爭論較激烈，如何客觀的認(rèn)識該問題，本文介紹了幾種已在黑茶樣本中研究的真菌毒素類型、形成的條件及檢測方法，以期為食品安全政策制定者和科研人員提供參考。

1 黃曲霉毒素（Aflatoxins）

1.1 黃曲霉毒素概況

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉（Aspergillusflavus，產(chǎn)毒菌株占 40%~50%[30]）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus，產(chǎn)毒菌株約占90%[30]）產(chǎn)生的具有生物毒性的次生代謝產(chǎn)物[31]。依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，黃曲霉素又分為 B1、B2、G1、G2、M1、M2等數(shù)種類型，其中以 AFB1（Aflatoxin B1, AFB1）的毒性最大[32]，其生物合成通路見圖 1，AFM1和 AFM2是哺乳動物攝入黃曲霉素后在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成的一類物質(zhì)[33]。不像寄生曲霉鮮見于東南亞，黃曲霉分布廣泛[30]，因此，黑茶中黃曲霉素的研究主要針對黃曲霉污染后在黑茶上的生長及生物合成。

1.2 黃曲霉外源污染黑茶基質(zhì)

在現(xiàn)有的黑茶微生物群落組成研究中，暫未發(fā)現(xiàn)有黃曲霉的報道[34]。但從外源接種的角度來講，茶葉樣本如若經(jīng)過潮水使得茶葉含水量達(dá)到渥堆水平時，黃曲霉存在在該基質(zhì)上生長的可能[35-36]；如若僅接種而不潮水，黃曲霉則無法在該基質(zhì)生長[35]。這表明，茶葉樣本含水量是黃曲霉是否在茶葉基質(zhì)上生長的關(guān)鍵因子，但添加黑茶水浸出物（有研究直接添加茶多酚[37]）的培養(yǎng)基能顯著地抑制黃曲霉在平板上的生長[38]。在對茶葉生產(chǎn)環(huán)境中的真菌多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)茶葉加工空氣中有黃曲霉菌株的存在[39]，表明在黑茶生產(chǎn)的過程中存在黃曲霉菌污染的可能。從黑茶等溫吸濕模型可以看出[40]，在允許的時間范圍內(nèi)，空氣濕度直接決定了倉儲期的黑茶平衡含水率，從理論上來講，黃曲霉在高濕條件下便有侵染黑茶基質(zhì)的可能。

1.3 黃曲霉外源污染黑茶的毒素暴露水平

出于黑茶發(fā)酵過程真菌體系復(fù)雜的考慮，多種真菌毒素檢測技術(shù)應(yīng)用到了黑茶樣本中。雖然有研究報道了黑茶中存在黃曲霉毒素的可能[11,41-46]，但檢出陽性結(jié)果的方法多來自于酶聯(lián)免疫檢測法，由于茶葉中含有大量的多酚類物質(zhì)、黑茶中的茶色素以及其他干擾物質(zhì)，使得該種檢測方法在檢測真菌毒素的測試中被廣泛地認(rèn)定存在假陽性結(jié)果的可能[47]，測試技術(shù)發(fā)展到如今，該方法已被淘汰，其陽性結(jié)果也需要進(jìn)行色譜確證。目前使用高效液相色譜聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測茶葉樣品中黃曲霉毒素有選擇性好、且得到的試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸取代傳統(tǒng)的液相色譜方法[48]。使用上述兩種檢測方法研究黑茶樣品中黃曲霉毒素的結(jié)果也有報道，劉妍等[44]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測了 10份普洱茶樣，其中有兩份檢出 AFB1，含量分別為 3.1 ng·g-1和 7.5 ng·g-1。吳靜等[49]采用IAC-HPLC的方法檢測了60份普洱茶樣品，AFB1含量范圍在 0.236~8.452 ng·g-1，88.3%的樣 品 低 于 5 ng·g-1。 Doris Haas[26]、 Sofie Monbaliu[50]和 B. Romagnoli[51]則均未檢出黃曲霉毒素。上述結(jié)果表明，黃曲霉毒素并非廣泛存在于黑茶樣品中，而存在黃曲霉毒素陽性結(jié)果的黑茶樣品中含量亦遠(yuǎn)低于日本報道的20世紀(jì)90年代日常植物性食物黃曲霉毒素的含量（10~4 918 ng·g-1）[52]，由于黃曲霉毒素難溶于水，黃曲霉毒素從茶葉到茶湯的轉(zhuǎn)移率也是極低的。因此，黑茶的黃曲霉素暴露處于較低水平，黃曲霉毒素污染所導(dǎo)致的食品安全風(fēng)險極低。

圖1 黃曲霉毒素生物合成通路示意圖Fig. 1 The diagram of biosynthesis pathway of aflatoxins

1.4 茶葉基質(zhì)對黃曲霉素合成途徑的影響

茶葉基質(zhì)成分具有很強(qiáng)的特殊性和復(fù)雜性，內(nèi)含有豐富的咖啡堿、茶色素、多酚類等物質(zhì)，這些成分是茶葉具有健康功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[53]，在外源污染真菌侵染的情況下，此類次生代謝產(chǎn)物同時具有抑制或制止霉菌產(chǎn)生真菌毒素的能力。李亞莉等[54]通過接種外源產(chǎn)毒黃曲霉于普洱茶基質(zhì)上，并在高溫高濕條件下培養(yǎng)和倉儲，在一定的陳化期后進(jìn)行樣品檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有產(chǎn)毒能力的黃曲霉在普洱茶基質(zhì)上未產(chǎn)生黃曲霉毒素。這表明，黑茶基質(zhì)中的某些成分具有抑制黃曲霉毒素合成的能力。H.Z.Mo等[55]和吳清華[56]通過半定量PCR技術(shù)研究了普洱茶對黃曲霉毒素合成過程的影響，結(jié)果表明，普洱茶基質(zhì)能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄黃曲霉毒素基因家族的AflS和AflR來減少黃曲霉毒素的生物合成，AflS和AflR通過轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)酯鍵水解酶（Est A），該酶是黃曲霉毒素合成過程的限速酶，該酶的表達(dá)減量抑制了VHA甲氧基酯鍵的水解形成VAL的過程，但下調(diào)表達(dá)相關(guān)基因的分子機(jī)理未得到明確闡述。張浩等[57]認(rèn)為茶葉中多酚類物質(zhì)槲皮素是抑制黃曲霉生長和產(chǎn)毒的活性因子，該物質(zhì)通過激活抗氧化系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子Yap 1誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)AflS和AflR基因。普洱茶不僅具有抑制黃曲霉產(chǎn)生毒素的能力，而且在普洱茶抗突變的研究中顯示，普洱茶水提物甚至具有拮抗黃曲霉毒素誘導(dǎo)突變的能力[58]。

2 赭曲霉素（Ochratoxins）

2.1 赭曲霉素概況

赭曲霉素最初發(fā)現(xiàn)由赭曲霉代謝產(chǎn)生[59]，后研究表明是一類由曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）真菌[60]產(chǎn)生的具有致畸、致癌、免疫抑制、肝臟毒性及嚴(yán)重腎毒性的次生代謝產(chǎn)物[61-62]?，F(xiàn)國際癌癥機(jī)構(gòu)認(rèn)定其為2B類致癌物[63]，依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，赭曲霉素又分為A、B、α、β等數(shù)種類型，其中以O(shè)chratoxin A（Ochratoxin A, OTA）的毒性最大[64-65]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑[60]見圖2。

2.2 黑茶赭曲霉素暴露水平

不像黃曲霉鮮見于黑茶基質(zhì)，曲霉屬真菌和青霉屬真菌在黑茶微生物研究中被廣泛檢出[34,66]，部分研究論文明確報道了黑茶基質(zhì)中赭曲霉的存在[67]，并檢測了赭曲霉素含量為 1.8 ng·g-1。劉妍等[45]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)從10份黑茶樣本中檢出1份含有赭曲霉素，含量為 4.2 ng·g-1。Sofie Monbaliu等[41]則報道了茶葉中的赭曲霉素含量范圍為2~10 ng·g-1，沖泡后的茶湯中的含量范圍為0.5~2 ng·mL-1。Doris Haas 等[26]從 36 份普洱茶樣品中檢出了4份樣本含赭曲霉素，含量分別為 0.65、0.65、14.8、94.7 ng·g-1，并認(rèn)為黑茶樣本中含量最高的OTA可能由樣本中青霉屬真菌代謝產(chǎn)生。莫瑾等[68]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測了19份普洱茶樣品，結(jié)果均未檢出 OTA。J.M. Mogensen等[19]采用HPLC方法檢測的市售的普洱茶和紅茶樣本，結(jié)果亦均未檢出 OTA。上述結(jié)果表明，OTA并非廣泛存在于黑茶樣品中，檢出陽性樣本的OTA含量在0.5~94.7 ng·g-1，這與外源污染真菌的種類有著直接的聯(lián)系。黑茶中赭曲霉素相關(guān)研究較少，可能與其毒素等級有關(guān)。由于赭曲霉素來源廣泛，且曲霉素和青霉屬真菌是其主要的來源，而此類真菌與黑茶品質(zhì)形成有著密不可分的聯(lián)系。因此，赭曲霉素在黑茶中存在的狀態(tài)值得進(jìn)一步關(guān)注。

3 嘔吐毒素（Deoxynivalenol）

3.1 嘔吐毒素概況

嘔吐毒素，學(xué)名：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生[69]的一類能夠引起動物或人類嘔吐、腹瀉甚至腸道壞死的次生代謝產(chǎn)物，歐盟將其定義為三級致癌物[70]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑[71]見圖3。

圖2 赭曲霉素結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑Fig. 2 Constitutional formula and biosynthetic pathway of ochratoxins

3.2 嘔吐毒素在黑茶樣品中的暴露水平

不像曲霉屬真菌和青霉屬真菌在黑茶中廣泛存在，鐮刀菌屬真菌在黑茶微生物多樣性研究中較少檢出，僅趙仁亮報道了鐮刀菌的產(chǎn)生[72]，陳建玲等[43]采用酶聯(lián)免疫的方法對廣州市場上的 70份普洱茶樣本進(jìn)行了 DON含量的檢測，其含量范圍為357~3107 ng·g-1，其中超過 1 000 ng·g-1的樣本有 63份。吳靜[49]采用酶聯(lián)免疫的方法對60份普洱茶樣本進(jìn)行了DON含量的檢測，其含量范圍為347~3 005 ng·g-1，其中超過 1 000 ng·g-1的樣本有 41 份。如前文所述，酶聯(lián)免疫在黑茶樣本中由于多酚類物質(zhì)及其他次生代謝產(chǎn)物的干擾，假陽性結(jié)果存在普遍性，結(jié)果僅能做為初篩結(jié)果，需進(jìn)行色譜確證。劉妍等[73]基于此，開發(fā)了針對黑茶樣本的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測了黑茶樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所檢的 61份黑茶樣品中，嘔吐毒素檢出3份，檢出率為4.9%，其含量分別為 8.6、70.1、299.5 ng·g-1，色譜數(shù)據(jù)所檢出結(jié)果低于國家標(biāo)準(zhǔn) GB 2761—2017[74]中對谷物及制品的限量要求1 000 ng·g-1，表明黑茶中DON的暴露水平值低。由于黑茶中真菌毒素研究的相關(guān)報道較少，而嘔吐毒素又在黑茶中有檢出，因此相關(guān)研究是今后黑茶食品安全研究的方向之一。

圖3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇結(jié)構(gòu)式及生物合成途徑Fig. 3 Constitutional formula and biosynthetic pathway of Deoxynivalenol（DON）

4 討論與展望

我國黑茶生產(chǎn)體系中真菌多樣性豐富，種類復(fù)雜的微生物在它們的共同作用下形成了不同地域不同風(fēng)格的黑茶類產(chǎn)品。但由于黑茶產(chǎn)品從原料存放、生產(chǎn)加工、產(chǎn)品儲藏、物流運(yùn)輸、商品貯存到最后的消費(fèi)需要經(jīng)歷一個漫長的過程，如在不規(guī)范生產(chǎn)或貯存的情況下，黑茶產(chǎn)品存在產(chǎn)毒真菌菌株污染并產(chǎn)生真菌毒素的可能。本文通過對黑茶類產(chǎn)品真菌毒素的研究成果進(jìn)行歸納總結(jié)，提示了不規(guī)范的生產(chǎn)方式和消費(fèi)方式可能存在的安全風(fēng)險，以期為企業(yè)生產(chǎn)和消費(fèi)者飲用提供參考。

黑茶的生產(chǎn)與飲用歷經(jīng)千年，還未曾報道過流行病學(xué)顯示的黑茶產(chǎn)品的安全性風(fēng)險。雖然我們在現(xiàn)有的研究手段下，檢測到非規(guī)范生產(chǎn)或貯存下的產(chǎn)品存在污染真菌菌株在黑茶基質(zhì)上生長的現(xiàn)象，也檢測出存在有真菌毒素的可能，表明標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化生產(chǎn)黑茶是非常必要的，生產(chǎn)貯存全過程應(yīng)嚴(yán)格按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[75-76]。

原料存放：由于黑茶原料的存放比較粗放，使用包裝材料沒有嚴(yán)格要求，但作為食品加工，黑茶包裝應(yīng)嚴(yán)格使用專用食品包裝袋，忌用其他用途的包裝袋，特別是采用舊飼料包裝袋或糧油種子包裝袋打包黑茶原料的做法，以防止有害微生物的交叉污染；同時，倉庫管理上要留意氣溫和濕度的變化，防止原料在存放過程中發(fā)生霉變。

生產(chǎn)加工：要設(shè)定安全的渥堆場地，嚴(yán)格控制生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)。把握好渥堆原料的大小，茶葉含水量的高低，渥堆時間等因素從而促進(jìn)有益微生物的生長，抑制有害菌的生長；不能有急功近利、唯利是圖的思想，采用不合理的生產(chǎn)方式，如高含水量和短時渥堆等錯誤方式，以免有害微生物滋生，影響產(chǎn)品的安全性；茯磚茶的發(fā)花工藝要嚴(yán)格控制好初始含水量及烘焙過程中的烘房內(nèi)的溫濕度等參數(shù)，時刻抽檢在制品的發(fā)花進(jìn)程，保證有益微生物的正常生長和培育。

產(chǎn)品貯存：黑茶產(chǎn)品通過陳放可改善其滋味，提高品質(zhì)，但一定要避免不規(guī)范的濕倉做老，加水做陳等影響品質(zhì)安全性的方式。實(shí)際上，高濕條件的產(chǎn)品貯存不但無法提高產(chǎn)品品質(zhì)，相反極易造成受有害微生物的侵染，滋生多種有害霉菌[77]，導(dǎo)致茶葉品質(zhì)劣變，甚至不能飲用。消費(fèi)者自藏黑茶產(chǎn)品要嚴(yán)格保證存放條件，忌水、忌潮、忌異味。

另外，相關(guān)研究結(jié)果表明，黑茶多種品質(zhì)成分具有抑制菌株生長或產(chǎn)毒的能力，而且已知的真菌毒素多為不溶于水或微溶于水的次生代謝物，對于只飲茶湯不食茶葉的消費(fèi)方式來說，更加確保了黑茶產(chǎn)品飲用的安全性。因此，良好的生產(chǎn)規(guī)范和合理的貯存方式是黑茶安全生產(chǎn)的前提，根據(jù)黑茶加工技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)，真菌污染是可以避免的，消費(fèi)者通過正規(guī)渠道購買正規(guī)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品是安全的。

雖然黑茶類產(chǎn)品因污染真菌而導(dǎo)致的安全風(fēng)險極低，但不規(guī)范的生產(chǎn)和儲運(yùn)方式仍存在增加黑茶產(chǎn)品感染污染真菌的風(fēng)險。國際上對發(fā)酵類食品的微生物菌種管理非常嚴(yán)格，如美國的GRAS（Generally recognized as safe）評價體系和歐洲的QPS（Qualified presumption of safety）評價體系對食品用菌種的名單列表、審批程序、安全性評估、合理使用和監(jiān)管都有嚴(yán)格的規(guī)定[78-86]。參照發(fā)酵食品加工的管理和監(jiān)控經(jīng)驗(yàn)，完善黑茶生產(chǎn)過程中的檢測和檢驗(yàn)手段及方法，應(yīng)是今后黑茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展要加強(qiáng)的方面。同時，現(xiàn)代發(fā)酵食品生產(chǎn)理念要求對食品中存在的微生物要明確其菌種信息并清晰其在食品加工過程中所發(fā)揮的作用。因此，精確解析黑茶加工過程中有害微生物的產(chǎn)生條件和有毒菌株的產(chǎn)毒可能性，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)食品工程的加工原理，嚴(yán)格篩選可用于黑茶發(fā)酵生產(chǎn)的有益菌種，實(shí)現(xiàn)黑茶加工精準(zhǔn)定向發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用和推廣也應(yīng)是黑茶生產(chǎn)努力的方向。

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