響應(yīng)面法優(yōu)化柴胡多糖提取工藝△

鄧寒霜，楊麗娜

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。味辛、苦，性微寒。具有解熱止痛、疏肝解郁，以及升舉脾胃清陽(yáng)之氣的作用[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標(biāo)性成分，但柴胡皂苷并不能全面反映柴胡的藥理作用。研究證明，柴胡中所含的多糖類成分具有抗輻射、降血脂、增強(qiáng)免疫力等活性，可用于治療肝炎、腎炎、紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病[2]。本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)柴胡多糖的水提醇沉法方法進(jìn)行了優(yōu)化，希望能為進(jìn)一步研究柴胡中多糖類成分，擴(kuò)大柴胡藥用范圍提供一定的幫助。

1 材料與儀器

1.1 材料

柴胡購(gòu)自商洛市藥材市場(chǎng)，經(jīng)商洛學(xué)院張小斌教授鑒定為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根。苯酚(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)、濃硫酸(西安化學(xué)試劑廠)、三氯甲烷(西安化學(xué)試劑廠)、正丁醇(西安化學(xué)試劑廠)、95%乙醇(西安化學(xué)試劑廠)；D-無水葡萄糖對(duì)照品(上海金穗生物科技有限公司)。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度計(jì)(島津UV-PC2800S)；電子天平(丹佛S-144)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(陜西愛信EYELA-N-1100)等。

2 方法

2.1 樣品的制備

將柴胡干燥后粉碎，過60目篩，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品100 mg放置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，搖勻，既得濃度為1 mg·mL-1的葡萄糖對(duì)照品溶液。分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL放置于10 mL容量瓶中，分別加水補(bǔ)至10 mL容量瓶刻度線處，搖勻。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取3 g苯酚(重精餾)，放置于50 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，搖勻，即得濃度為6%的苯酚溶液。用1 mL移液管分別吸取2.2項(xiàng)下不同濃度的葡萄糖對(duì)照品溶液各1 mL置于具塞比色管中，加入1 mL的6%苯酚溶液，并迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，放在30 ℃的水浴鍋中30 min。以水作為空白對(duì)照，在490 nm處測(cè)定吸光度A[3]。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得到回歸方程Y=0.7431X+0.0016，r=0.999 4。試驗(yàn)結(jié)果表明濃度在0.0～0.6 mg·mL-1的范圍內(nèi)曲線線性良好。

2.4供試品溶液的制備

精密稱取2.0 g柴胡粉末放進(jìn)圓底燒瓶中，加入25倍量的95%乙醇，在微沸條件下回流2 h進(jìn)行脫脂，減壓回收乙醇。在一定溫度下，向?yàn)V渣內(nèi)加入一定量的水進(jìn)行回流，每提取10 min攪拌1 min中，提取一段時(shí)間后，趁熱抽濾，反復(fù)抽提數(shù)次，合并濾液，將濾液濃縮為水料比1∶1倍量的溶液。待溶液冷卻后，快速攪拌溶液并緩慢地向溶液中加入95%乙醇，使溶液含醇量達(dá)90%，密閉靜置24 h。將溶液放置在離心機(jī)中進(jìn)行離心(8000 r·min-1)，棄去上清液，得柴胡粗多糖。用20 mL的蒸餾水將粗多糖沉淀全部溶解，再向溶液里加入等量的Sevage試劑，劇烈振搖30 min，離心(同上)。吸取上清液，加入上清液體積1/4的Sevage試劑，振搖30 min后離心(同上)，反復(fù)操作數(shù)次，直至將變性蛋白層除完，即得柴胡多糖溶液。用移液管吸取1 mL柴胡多糖溶液，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，既可得柴胡多糖供試品溶液[4-8]。按式(1)計(jì)算多糖提取率(%)：

提取率(%)=(多糖濃度×稀釋因子×濾液體積)/原料干重×100%

(1)

2.5方法學(xué)試驗(yàn)

2.5.1精密度試驗(yàn) 對(duì)葡萄糖對(duì)照品溶液進(jìn)行5次平行測(cè)定，計(jì)算吸光度A的RSD值為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)同一組供試品溶液分別在密閉冷藏1、3、5、7、9、11后測(cè)定吸光度A，計(jì)算RSD值為0.9%，表明供試液在11 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 按2.4項(xiàng)下的方法在相同條件下制備5份柴胡多糖供試液，測(cè)定吸光度A，計(jì)算RSD值為1.2%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.5.4加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量(19.16%)的柴胡樣品粉末6份，每份2.0 g，分別精密加入無水葡萄糖對(duì)照品10.0 mg，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算柴胡多糖的回收率為97.9%、RSD值為2.7%。

2.6 技術(shù)路線

本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design方法的設(shè)計(jì)原理，以多糖提取率為響應(yīng)值，以單因素試驗(yàn)所得最適值為中心點(diǎn)，采用Design-Expert.8.05進(jìn)行響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，確定柴胡多糖的最佳工藝條件。技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 柴胡多糖提取工藝優(yōu)化技術(shù)路線

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 提取溫度 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣加入水料比10∶1量的蒸餾水，分別在60、70、80、90、100 ℃下回流提取，每提取10 min攪拌1 min，0.5 h后趁熱抽濾，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計(jì)490 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算柴胡多糖提取率。

圖2 提取溫度對(duì)柴胡多糖提取率的影響

從圖2上可以看出隨著提取溫度的升高，柴胡多糖的提取率也一直在升高，在90 ℃的時(shí)候提取率增長(zhǎng)開始變緩慢。造成這種變化的原因可能是高溫下多糖類成分會(huì)變得不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間在高溫下提取，反而可能引起多糖提取下降，所以確定最優(yōu)提取溫度為90 ℃。

3.1.2 水料比 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣分別加入水料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1量的蒸餾水，在90 ℃下回流提取，每提取10 min攪拌1 min，0.5 h后趁熱抽濾，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計(jì)490 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算柴胡多糖提取率。

圖3 水料比對(duì)柴胡多糖提取率的影響

從圖3上可以看出隨著水料比的升高，提取率也一直在升高，在水料比為30∶1的時(shí)候提取率增長(zhǎng)開始變緩慢。分析造成這種變化的原因可能是越多的溶劑越有利于多糖成分的溶出，但當(dāng)溶劑量達(dá)到一定水平后，多糖成分已經(jīng)充分溶出，再增加提取溶劑無助于增加多糖提取率，所以確定最優(yōu)水料比為30∶1。

3.1.3 提取時(shí)間 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣加入水料比30∶1量的蒸餾水，在90 ℃下回流提取，每提取10 min攪拌1 min，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后趁熱抽濾，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計(jì)490 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算柴胡多糖提取率。

圖4 提取時(shí)間對(duì)柴胡多糖提取率的影響

從圖4上可以看出隨著提取時(shí)間的升高，提取率也一直在升高，在2.0 h的時(shí)候提取率最高，超過2.0 h后提取率開始降低。分析造成這種變化的原因可能是隨著提取時(shí)間的增加，多糖成分可以更加充分的溶出，但當(dāng)時(shí)間超過2.0 h，在一定溫度下過長(zhǎng)的提取時(shí)間導(dǎo)致多糖類成分被破壞，所以確定最優(yōu)提取時(shí)間為2.0 h。

3.1.4 提取次數(shù) 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣加入水料比30∶1量的蒸餾水，在90 ℃下回流提取，每 10 min攪拌1 min，2.0 h后分別重復(fù)浸提1次、2次、3次、4次、5次，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計(jì)490 nm處測(cè)定吸光度A，計(jì)算柴胡多糖提取率。

圖5 提取次數(shù)對(duì)柴胡多糖提取率的影響

從圖5可以看出提取2次之后，提取率變化不大。考慮到實(shí)際應(yīng)用中要注意溶劑用量和濃縮濾液的問題，所以確定最優(yōu)提取次數(shù)為2次。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

3.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，2次提取后，柴胡中大部分多糖成分已充分溶出。因此，在進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)將提取次數(shù)固定為2次，不再進(jìn)行考察，以柴胡多糖提取率為響應(yīng)值，選取提取溫度、水料比、提取時(shí)間三個(gè)影響因素進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表3[9-14]。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平

運(yùn)用Design-Expert.8.05軟件，進(jìn)行響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)的方案，得到17組試驗(yàn)方案，具體結(jié)果見表4。

表4 試驗(yàn)方案和結(jié)果

3.2.2試驗(yàn)結(jié)果分析 利用響應(yīng)面軟件處理數(shù)據(jù)可得方差分析結(jié)果(具體結(jié)果見表5)，以及試驗(yàn)變量與響應(yīng)值間的回歸方程Y=18.99+1.20A+0.39B+0.072C-0.16AB-0.22AC-0.20BC-1.22A2-0.35B2-0.14C2。所得模型對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(P<0.01)，具有較高的可信度；相關(guān)系數(shù)r=0.983 6，校正系數(shù)R2Adj=0.925 4，說明該模型能解釋92.54%的響應(yīng)變化，即模型與實(shí)際情況擬合較好。三個(gè)因素中提取溫度對(duì)響應(yīng)值具有極顯著影響，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大，其次為水料比，影響最小的是提取時(shí)間。

表5 方差分析

注：*.P<0.05為顯著；**.P<0.01為極顯著。

響應(yīng)面法可以比較直觀的反應(yīng)出各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小以及各試驗(yàn)因素之間的關(guān)系，具體見圖6～8。

由圖6～8可以看出，提取溫度與水料比、提取溫度與提取時(shí)間、水料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率具有顯著性影響。分析圖6、圖7可知，溫度曲線的變化比水料比、時(shí)間曲線劇烈，說明溫度因素對(duì)試驗(yàn)的影響大于其它兩因素；分析圖8可知，水料比曲線的變化比時(shí)間曲線劇烈，表明水料比因素對(duì)試驗(yàn)的影響大于時(shí)間因素。結(jié)果與由表5所得結(jié)論相符。

利用響應(yīng)面軟件中的Numerical選項(xiàng)卡對(duì)回歸方程式2進(jìn)行偏導(dǎo)數(shù)分析，可知柴胡多糖的最佳提取工藝為提取溫度95.02 ℃、水料比46.27∶1、提取時(shí)間1.7 h，預(yù)測(cè)最大提取率為19.39%。

圖6 提取溫度與水料比交互作用的等高線與響應(yīng)面

圖7 提取溫度與提取時(shí)間交互作用的等高線與響應(yīng)面

圖8 水料比與提取時(shí)間交互作用的等高線與響應(yīng)面

為便于操作，對(duì)上述提取工藝稍作調(diào)整，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在固定提取次數(shù)為2次的基礎(chǔ)上，設(shè)定提取溫度為95 ℃、水料比為45∶1，提取時(shí)間為1.5 h，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到平均提取率為19.16%，與理論值19.39%相近，說明該模型可以很好的預(yù)測(cè)試驗(yàn)的實(shí)際表達(dá)情況。

4 結(jié)論與展望

本文在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法，重點(diǎn)研究了提取時(shí)間、水料比、提取溫度三個(gè)因素對(duì)柴胡多糖提取率的影響。經(jīng)優(yōu)化后提到柴胡多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：提取溫度為95 ℃、水料比為45∶1、提取時(shí)間為1.5 h，重復(fù)提取2次。

植物多糖因其具有多種生理活性，近年來成為植物成分提取方面研究的熱點(diǎn)。但因植物多糖中含有較多脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、色素、鹽類等其它物質(zhì)[15]，對(duì)其分離純化工藝要求較高。在今后的研究中，我們將對(duì)柴胡多糖的純化工藝做進(jìn)一步研究，以期柴胡多糖的開發(fā)利用奠定一定的基礎(chǔ)。

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