金銀花中烯啶蟲胺測(cè)定方法的研究△

侯少巖，李嘉欣，薛健*，王鵬思，武曉麗，袁亞莉

(1.南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

金銀花Lonicera Japonicae Flos.自古被譽(yù)為清熱解毒的良藥，其性甘寒氣芳香，甘寒清熱而不傷胃，芳香透達(dá)又可祛邪[1]。種植過(guò)程中常伴有多種病蟲害，尤以蚜蟲最為嚴(yán)重[2]。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，煙堿類農(nóng)藥對(duì)蚜蟲有優(yōu)良的殺滅作用，其中烯啶蟲胺(Nitenpyram)為常用除蟲劑[3]，金銀花生產(chǎn)中也有使用。研究表明，新煙堿類殺蟲劑對(duì)傳粉昆蟲具有嚴(yán)重危害，威脅蜜蜂的種群，造成依靠蜜蜂傳粉的作物產(chǎn)量降低，歐盟現(xiàn)已經(jīng)禁用包括吡蟲啉在內(nèi)的3種新煙堿類殺蟲劑[4]。烯啶蟲胺在金銀花上的使用，可能在藥材上殘留，對(duì)環(huán)境及人體健康造成危害[5]。為準(zhǔn)確評(píng)估其殘留風(fēng)險(xiǎn)，需要對(duì)藥材殘留情況進(jìn)行測(cè)定。目前雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道烯啶蟲胺的測(cè)定方法[6-8]，但未發(fā)現(xiàn)在金銀花中建立測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究金銀花中烯啶蟲胺殘留量的測(cè)定方法。

1 材料

1.1 供試藥材

本實(shí)驗(yàn)所用樣品由田間獲得，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾，即金銀花。

1.2 試劑

乙腈、丙酮、甲醇(分析純，北京化工廠)；丙酮(色譜純，美國(guó)Mreda公司)；烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg·mL-1，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，批號(hào)：20170428)；中性氧化鋁(200～300目，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，550 ℃中活化5 h，貯存于干燥器中，過(guò)夜冷卻?；罨蟮闹行匝趸X中小心加入5%蒸餾水，充分搖勻，放置過(guò)夜)；弗羅里硅土(60～100目，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，650 ℃中活化5 h，貯存于干燥器中，過(guò)夜冷卻?；罨蟮母チ_里硅土中小心加入5%蒸餾水，充分搖勻，放置過(guò)夜)。

1.3 儀器

Agilent 6890N氣相色譜儀，電子捕獲檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；SB-2500DT超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；LABOROTA4000/4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國(guó)Heidolph公司；TDZ5-WS低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 氣相色譜條件

安捷倫DB-1701石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；電子捕獲檢測(cè)器；載氣為高純氮?dú)?>99.999%)；進(jìn)樣口溫度260 ℃，不分流進(jìn)樣；檢測(cè)器溫度320 ℃；升溫程序：初始溫度110 ℃，保持1 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至240 ℃，保持15 min；恒流模式，流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL；外標(biāo)法定量。在該色譜條件下，烯啶蟲胺典型色譜圖如圖1A所示，保留時(shí)間為7.68 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

取烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1)1 mL于10 mL茶色容量瓶中，加色譜丙酮至刻度，得到10 μg·mL-1溶液作為母液保存于-20 ℃冰箱。取該母液1 mL，稀釋10倍得到1 μg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.3 樣品提取及凈化方法研究

2.3.1 樣品的提取 本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單、經(jīng)典的超聲提取法對(duì)樣品進(jìn)行提取。對(duì)烯啶蟲胺溶解度較好的溶劑有丙酮和乙腈，對(duì)這兩種溶劑進(jìn)行考察，通過(guò)比較提取率和對(duì)金銀花基質(zhì)的提取情況擇優(yōu)選擇溶劑。

選擇丙酮、乙腈分別對(duì)樣品進(jìn)行提取。精密稱取金銀花粉末樣品2.0 g(過(guò)《中華人民共和國(guó)藥典》2號(hào)篩)于50 mL具塞離心管中，加入提取溶劑30 mL超聲提取15 min，靜置，過(guò)濾。樣品殘?jiān)偌尤胩崛∪軇?0 mL超聲提取15 min，重復(fù)2次，靜置，過(guò)濾。合并所有濾液。40～45 ℃水浴旋蒸濃縮至近干，待凈化。

2.3.2 樣品的凈化 樣品提取后在烯啶蟲胺出峰位置存在干擾峰，為了將農(nóng)藥與樣品的雜質(zhì)分離，降低樣品對(duì)儀器的損害，需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化。與其他方法相比，固相萃取操作簡(jiǎn)便、選擇性高，故采用固相萃取法。固相萃取凈化柱有商品柱和自組裝柱，相同填料時(shí)自組裝柱成本較低。金銀花基質(zhì)復(fù)雜，且含有較多葉綠素，中性氧化鋁和弗羅里硅土對(duì)色素等復(fù)雜基質(zhì)有較好的吸附，故通過(guò)比較中性氧化鋁與弗羅里硅土的凈化效果，擇優(yōu)選擇。

分別填裝中性氧化鋁、弗羅里硅土作為凈化填料。玻璃柱(12 mm×250 mm)中依次加入2 g無(wú)水硫酸鈉、5 g填料、2 g無(wú)水硫酸鈉。輕敲玻璃柱身使其裝填盡量均勻、緊密，保持表面水平，用20 mL甲醇預(yù)淋玻璃柱內(nèi)的填料，棄去流出液。待凈化樣品用少量甲醇轉(zhuǎn)移至凈化柱內(nèi)，用25 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶?jī)?nèi)，于40～45 ℃減壓濃縮至近干，冷卻后用色譜丙酮定容至2 mL，4000 r·min-1離心5 min，取上清液注入氣相色譜儀，檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取溶劑的選擇

由表1可知，丙酮、乙腈對(duì)0.5 mg·kg-1添加的金銀花樣品中烯啶蟲胺的提取率分別為86.90%、95.40%；根據(jù)圖1中丙酮和乙腈對(duì)金銀花基質(zhì)的提取效果可知，乙腈提取的金銀花基質(zhì)色譜圖中的雜峰明顯少于丙酮，故選擇乙腈作為本實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

注：1.烯啶蟲胺；A.烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液；B.丙酮提取空白樣品溶液；C.乙腈提取空白樣品溶液。圖1 不同溶劑提取空白金銀花基質(zhì)溶液的GC圖

表1 不同溶劑對(duì)金銀花中烯啶蟲胺的提取率

3.2 凈化方法的選擇

凈化效果如圖2所示，D和B相比，經(jīng)中性氧化鋁凈化后，烯啶蟲胺出峰位置干擾峰消失，基線明顯降低； D與C對(duì)比，雜質(zhì)峰較低，基線也更低，即中性氧化鋁填充柱的凈化效果更佳。

注：1.烯啶蟲胺；A.烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；B.未凈化空白樣品溶液；C.經(jīng)弗羅里硅土凈化后的空白樣品溶液；D.經(jīng)中性氧化鋁凈化后的空白樣品溶液。圖2 不同填料對(duì)金銀花基質(zhì)凈化效果比較

3.3 金銀花中烯啶蟲胺測(cè)定的方法學(xué)考察

3.3.1 線性范圍 將母液稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、100、200、500 μg·L-1系列的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，線性擬合，得回歸方程為Y= 35.729X+239.98，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。說(shuō)明在5～500 μg·L-1烯啶蟲胺濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

3.3.2 儀器的精密度 取0.2 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，連續(xù)3 d進(jìn)行GC-ECD測(cè)定，得到烯啶蟲胺含量的精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度以RSD計(jì)為1.08%，日間精密度為2.76%，符合測(cè)定要求。

3.3.3 方法的檢出限與定量限 測(cè)定添加回收樣品溶液譜圖烯啶蟲胺色譜峰的信噪比，以信噪比(S/N)3為方法的檢出限，以信噪比(S/N)10為方法的定量限。結(jié)果顯示，方法對(duì)烯啶蟲胺的檢出限(LOD)為0.006 mg·kg-1，定量限(LOQ)為0.02 mg·kg-1。

3.3.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度 精密稱取空白樣品2.0 g，分別精密添加烯啶蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到0.02、0.1、0.2 mg·kg-1烯啶蟲胺添加樣品，按照所建立的方法進(jìn)行提取、凈化，分別重復(fù)3次，測(cè)得峰面積并計(jì)算含量，得到各添加濃度回收率及精密度(見表2)。3個(gè)添加濃度的回收率在79.14%～98.37%之間，精密度(以RSD計(jì))在3.66%～4.39%之間，符合農(nóng)殘規(guī)定(回收率在70%～110%，RSD<15%)[11]及本實(shí)驗(yàn)要求。

表2 金銀花中烯啶蟲胺添加回收率及精密度(n=3)

3.4 樣品測(cè)定

為驗(yàn)證所建立方法的適用性，按照本實(shí)驗(yàn)確定的方法對(duì)收集的施藥后的金銀花樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 金銀花樣品中烯啶蟲胺殘留量

注：ND指殘留量低于檢出限。

4 討論

目前未有金銀花中烯啶蟲胺的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2016 食品中農(nóng)藥最大殘留限量[12]中要求在糙米中最大殘留限量(MRL)為0.1 mg·kg-1，稻谷中的MRL為0.5 mg·kg-1，蔬菜的MRL為0.2 mg·kg-1。若以最嚴(yán)格的糙米中的最大殘留限量0.1 mg·kg-1為參考標(biāo)準(zhǔn)，本方法的檢出限遠(yuǎn)低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)烯啶蟲胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。

本研究建立了GC-ECD測(cè)定金銀花中烯啶蟲胺殘留量的分析方法，靈敏度較高，準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到分析要求。此外，本方法還具有操作簡(jiǎn)便、成本低、線性好的特點(diǎn)，同時(shí)，運(yùn)用該方法對(duì)施用烯啶蟲胺的金銀花樣品進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證了檢測(cè)方法的適用性。

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