UPLC-MS/MS測定人參花中5種內(nèi)源植物激素含量△

陳康，劉娟，周修騰，紀(jì)瑞鋒，童宇茹，3，陳同，袁媛*

(1.道地藥材國家重點實驗室，中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；3.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，沈陽 110016)

人參花為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Meyer的干燥花蕾，具有補氣強身、抵抗疲勞、延緩衰老的作用[1]。研究表明，人參花中含有20多種皂苷活性物質(zhì)、17種氨基酸、11種微量元素、3種抗癌活性蛋白、多種生物活性揮發(fā)油等[2-3]，具有藥品及保健品開發(fā)潛力；同時，人參主要活性成分人參皂苷在人參花中含量高達(dá)5%～7%，是人參根的5～6倍[4]，且從人參花中分離得到了多種具有生物活性的新穎結(jié)構(gòu)人參皂苷[5-7]。近年來，隨著新藥源的拓展研究，有關(guān)于人參花的藥理、藥化、提取工藝報道越來越豐富，但尚未見到有關(guān)人參花的內(nèi)源植物激素報道。

植物內(nèi)源性激素是植物體內(nèi)重要的信號分子，其分布具有明顯的組織特異性，對植物的生長發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)控制作用。其中，生長素(如：IBA、IAA、NAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)參與了多個植物生長發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、休眠、植物生長、開花、葉片衰老脫落等；茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)作為脅迫激素，受到生物脅迫和非生物脅迫的調(diào)控，增強植物的抗逆性，在植物的脅迫耐受性和抗性中發(fā)揮著重要作用[8-10]。研究表明，以上5種植物激素對藥用植物次生代謝調(diào)控均具有重要意義。其中IBA可以提高匍枝筋骨草β-脫皮甾酮的含量[11]，GA可以誘導(dǎo)丹參毛狀根酚酸類物質(zhì)的積累[12]，ABA可以調(diào)控滇紫草細(xì)胞紫草寧生物合成[13]，JA與SA可促進(jìn)白木香懸浮細(xì)胞的倍半萜生物合成[14-15]等。

植物激素對人參皂苷的合成具有重要的調(diào)控意義[16-18]，但有關(guān)人參內(nèi)源性激素的研究較少，而在人參花中內(nèi)源性植物激素的分布尚未見報道。本研究根據(jù)課題組前期建立的激素測定方法[19]，采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對人參花中5種內(nèi)源性植物激素ABA、GA3、IAA、JA、SA進(jìn)行測定，同時還對JA前體12-氧-二烯酸(OPDA)和JA活性形式JA-異亮氨酸(JA-ile)含量進(jìn)行測量分析，旨在為揭示內(nèi)源性植物激素對人參花中次生代謝的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試人參幼苗，由康美新開河種植基地提供，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心黃璐琦研究員鑒定為人參PanaxginsengC.A.Mey.的幼苗。

1.2 儀器

AB Sciex公司QTRAP?6500三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)；美國Thermo Scientific公司Millipore超純水系統(tǒng)；BT-224S型萬分之一電子分析天平；THZ-C-1全溫震蕩搖床；5810R高速冷凍離心機。

1.3 試劑

生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸等對照品，均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈、甲酸購自Fisher公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純，超純水自制。

2 方法

2.1 激素提取方法

分別收集新鮮的人參花，液氮冰浴研磨，準(zhǔn)確稱取根和葉片各0.1 g到5 mL離心管中，加入異丙醇：水：HCl(2∶1∶0.002)提取液1 mL，4 ℃，100 r·min-1搖床中振動30 min，取出離心管后加入2 mL二氯甲烷，再次振動30 min；4 ℃，13 000 r·min-1冷凍離心5 min，吸取有機相層溶液1.8 mL，氮氣吹干，加入50%甲醇-水溶液400 μL，4 ℃，13 000 r·min-1冷凍離心15 min，吸取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITYUPLCBEH C18色譜柱(2.1 mm YUPLCB，1.71 mm)，流動相：0.05%甲酸水-乙腈溶液。線性洗脫梯度：0～0.3 min，10%乙腈；0.3～3 min，10%～60%乙腈；3～6 min，60%～95%乙腈；6～6.2 min，10%乙腈。流速為0.6 mL·min-1，柱溫40 ℃，樣品盤溫度4 ℃，進(jìn)樣量10 μL，分析時間7 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為負(fù)離子掃描；監(jiān)測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；氣簾氣的壓力為30 psi，離子化電壓為-4500 V，離子源溫度550 ℃，噴霧氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為50 psi，數(shù)據(jù)處理用MultiQuant定量軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果及分析

3.1 專屬性檢測

配置內(nèi)源性植物激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2項下的質(zhì)譜-色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，人參花的內(nèi)源性植物激素峰型單一、分離度較高，且均在5 min以內(nèi)出峰，實現(xiàn)了植物激素準(zhǔn)確快速測定的目的，適用于人參花中激素含量的測定(見圖1)。

注：A：IBA標(biāo)準(zhǔn)品；B：GA3標(biāo)準(zhǔn)品；C：ABA標(biāo)準(zhǔn)品；D：人參花IBA樣品；E：人參花GA3樣品；F：人參花ABA樣品；G：SA標(biāo)準(zhǔn)品；H：JA-ile標(biāo)準(zhǔn)品；I：OPDA標(biāo)準(zhǔn)品；J：人參花SA樣品；K：人參花JA-ile樣品；L：人參花OPDA樣品。圖1 內(nèi)源性植物激素選擇反應(yīng)監(jiān)測離子流圖

3.2 人參花中5種內(nèi)源激素含量檢測及分析

本實驗對人參花中內(nèi)源性植物激素含量進(jìn)行分析，每種激素平行5個樣品。表1為人參花中5種內(nèi)源性植物激素含量的檢測結(jié)果。由結(jié)果可以看出，人參花中含有較多抗逆激素SA與ABA，研究也表明水楊酸可以誘導(dǎo)植物開花、促進(jìn)果實生長[20]，而ABA對植物成花的誘導(dǎo)和發(fā)育具有重要調(diào)控作用[21]；而與植物向性生長相關(guān)的IBA及伸長生長相關(guān)的GA3含量較低，研究表明植物中越是代謝旺盛的器官生長素與赤霉素含量越高，說明人參花的代謝速度較慢；而茉莉酸JA在人參花中含量極低(低于檢測限以下)，因此有必要對JA激素合成通路相關(guān)的前體及活性成分進(jìn)行進(jìn)一步檢測分析(圖2)。

表1 人參花中內(nèi)源性植物激素含量

圖2 人參花5種內(nèi)源性植物激素含量比例分析

3.3 人參花中JA合成通路關(guān)鍵成分的分析

JA生物合成通路主要分成三個階段：(1)在質(zhì)體中，由甘油酯轉(zhuǎn)變?yōu)镺PDA；(2)在過氧化物酶體中，OPDA轉(zhuǎn)變?yōu)檐岳蛩?JA)；(3)在胞質(zhì)溶膠中，JA轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问降能岳蛩崤c異亮氨酸的偶聯(lián)物(JA-ile)(圖3)。JA在不同組織的差異性積累導(dǎo)致了特異性的基因調(diào)控效應(yīng)[22]。在對模式植物擬南芥和番茄的研究中，JA被認(rèn)為通過調(diào)控水運輸?shù)交ㄋ幒突ńz的過程來調(diào)控花藥的開裂和衰老，從而達(dá)到調(diào)控開花時間的作用[23-24]。在對水稻、小麥、黑麥和高粱等禾本科植物的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性JA也參與穎花開放的調(diào)控[25]。從我們的數(shù)據(jù)中可以看到存在大量的JA前體OPDA，這種現(xiàn)象既是為了可能的應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)大量JA信號提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也是開花期植物花中JA組成性表達(dá)的必然結(jié)果。JA及其衍生物主要的活性物質(zhì)MeJA、JA-ile早就被證明是人參皂苷合成通路上非常有效的化學(xué)誘導(dǎo)子[26]，往往都是通過刺激合路上關(guān)鍵酶基因[27]或是調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。其中用外源100 μM MeJA處理人參不定根，參與人參皂苷生物合成基因如HMGR、SS、SE和DDS有明顯上調(diào)，而CAS略有下降[29]。我們的數(shù)據(jù)中JA和JA-ile的含量水平不高，考慮到激素本身作用就是具有級聯(lián)放大的作用效果，維持較低的濃度才是穩(wěn)態(tài)。

圖3 人參花中JA合成通路含量分析

4 討論

內(nèi)源性激素對于藥用植物的生長及次生代謝產(chǎn)物(多數(shù)為藥效成分)的含量具有重要的調(diào)控作用，植物內(nèi)源性激素作為天然生長調(diào)節(jié)劑，參與了多種植物的生長發(fā)育過程并調(diào)控植物的次生代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性植物激素可能參與調(diào)控了人參開花過程以及花中人參皂苷的積累。前人研究表明，內(nèi)源性激素對植物開花過程存在調(diào)控[30-32]。ABA對刺梨Rosaroxburghii[33]、銀杏GinkgobilobaL.[34]、荔枝Litchichinensis[35]、蝴蝶蘭(Phalaenopsishybrida)[36]等花的形成起促進(jìn)作用[37]。2004年，Ulger 等的研究結(jié)果顯示在花誘導(dǎo)和起始階段高濃度的ABA對花的形成起促進(jìn)作用[38]。中藥領(lǐng)域中，在石斛DendrobiumcandidumWall.ex Lindl.離體培養(yǎng)的研究中也發(fā)現(xiàn)，原球莖在ABA培養(yǎng)基上預(yù)處理15d再轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，花芽形成頻率明顯提高，且單株花數(shù)增加[39]；同時，人參皂苷也在人參的花蕾中含量相對較高[40]，植物激素和人參花中皂苷合成和積累可能存在一定相關(guān)性：而SA和JA都對人參皂苷合成起到調(diào)控作用[41]。從內(nèi)源性植物激素對中藥的次生代謝的影響來說，ABA促進(jìn)黃花蒿中青蒿素的含量[42]，JA也對藥用植物次生代謝產(chǎn)生重要影響[43]。因此，內(nèi)源性植物激素對人參的生長及次生代謝的調(diào)控影響值得深入討論，同時內(nèi)源性植物激素對中藥質(zhì)量的影響及具體機制的研究有待今后的進(jìn)一步研究。

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