黃花蒿葉甲醇粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用△

馬玉楠，陳傳嬌，馬曉惠，程永現(xiàn)，董鮮*，徐福榮*

(1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院，廣東 深圳 518060)

三七是我國(guó)傳統(tǒng)道地中藥材，為五加科人參屬多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖[1]，具有散瘀止血、消腫定痛等功能。主要用于治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾病，其用藥范圍甚廣，社會(huì)需求量日益增加，從而引起種植面積的急劇擴(kuò)大。由于三七生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，造成其連作障礙十分嚴(yán)重，制約著三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，是三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的問(wèn)題[2]。據(jù)報(bào)道，連作障礙易導(dǎo)致三七根部的腐爛。Miao等[3]通過(guò)對(duì)三七的腐爛根際真菌微生物進(jìn)行研究，表明毀壞柱孢菌Cylindrocarpondestructans(Zinssm.)Scholten、腐皮鐮刀菌Fusariumsolani(Mart.)Sacc和尖孢鐮刀菌F.oxysporumSchltdl是三七根腐病的主要病原真菌，其中分離頻率最高的為柱孢屬真菌[4-5]。鐮刀菌屬類(lèi)病原菌能引發(fā)多數(shù)作物根腐病的發(fā)生，給作物生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。

黃花蒿ArtemisiaannuaL.為菊科Asteraceae蒿屬Artemisia1年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，具有很高的藥用價(jià)值。黃花蒿的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分，其中非揮發(fā)性成分的主要代表是青蒿素，揮發(fā)性成分主要包括芳香族、脂肪族及萜類(lèi)化合物[6]。本課題組經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在三七土壤表面覆蓋黃花蒿能促進(jìn)三七植株的生長(zhǎng)，與無(wú)黃花蒿覆蓋的三七相比，葉綠素含量(SPAD)升高，株高和根系干重也有所增加，覆蓋黃花蒿的三七發(fā)病率(10%)顯著低于無(wú)黃花蒿覆蓋的三七發(fā)病率(33.13%)，黃花蒿對(duì)三七根腐病的防控效果高達(dá)76.60%[7]。本實(shí)驗(yàn)用甲醇為溶劑對(duì)黃花蒿的葉進(jìn)行超聲提取，測(cè)定其提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)、孢子活力、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響，試圖揭示黃花蒿抑制三七根腐病的發(fā)生機(jī)理，從而尋求防治三七根腐病的新途徑，為消減三七連作障礙及規(guī)?；N植提供理論依據(jù)。

1 材料

供試黃花蒿：黃花蒿種子由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，在云南省道地瀕危中藥材繁育與栽培工程技術(shù)研究中心內(nèi)種植。

供試菌株：菌株分離自發(fā)病三七植株根系，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum，對(duì)三七植株有強(qiáng)致病性。在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，接種3～4次后，取生長(zhǎng)旺盛的菌株備用。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

2 方法

2.1 黃花蒿葉甲醇粗提物的制備

將黃花蒿葉片陰干，粉碎，過(guò)40目篩，稱取50 g用甲醇超聲提取(100 mL×2 h×3次)。過(guò)濾，冷凍干燥得粉末2.565 g，制備成質(zhì)量濃度分別為3.66、5.13、8.55、25.65 mg·mL-1的甲醇溶液，置于4 ℃冰箱備用，空白對(duì)照為甲醇溶液。

2.2 尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率的測(cè)定

用瓊脂平板表面萌發(fā)法[8]。取培養(yǎng)7 d的尖孢鐮刀菌，加20 mL無(wú)菌水到培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌載玻片將菌絲和孢子輕輕刮下，8層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲和培養(yǎng)基，最后配制成濃度為5×103個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。采用2%水瓊脂培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入15 mL的水瓊脂和1 mL無(wú)菌黃花蒿葉甲醇提取物，充分混勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入50 μL上述已制備好的孢子懸浮液，使用無(wú)菌涂布棒將孢子懸浮液順時(shí)針均勻涂布在培養(yǎng)基上。涂布完成后，將培養(yǎng)皿放置在微生物培養(yǎng)箱中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，按公式(1)計(jì)算孢子的萌發(fā)率。

(1)

2.3 尖孢鐮刀菌孢子活力的測(cè)定

黃花蒿葉甲醇提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制作用參照牛津杯法[9]，孢子活力測(cè)定采用吖啶橙-碘化丙啶熒光染色法[10]。在無(wú)菌操作條件下，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15 mL PDA培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的尖孢鐮刀菌，用直徑5 mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌塊，接種于培養(yǎng)基中央，然后將4個(gè)無(wú)菌牛津杯距離真菌塊25 mm處等距離放置，每個(gè)牛津杯加入200 μL上述不同質(zhì)量濃度的黃花蒿葉甲醇提取物(事先用0.22 μm有機(jī)系濾頭過(guò)濾除菌)，于微生物培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。生長(zhǎng)1周后，刮下菌絲，用無(wú)菌水制成孢子懸浮液(1×106個(gè)·mL-1)。取50 μL的菌懸液，加入50 μL的無(wú)菌水和20 μL碘化丙啶(2%)和40 μL吖啶橙(0.1%)?；旌暇鶆蚝笤谑覝睾诎禇l件下放置5 min進(jìn)行染色。染色完成后，10 000×g離心5 min。再用100 μL的無(wú)菌水沖洗菌懸液。將染色液完全洗凈后，取10 μL樣品，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。激發(fā)光波長(zhǎng)為450～490 nm。計(jì)算活細(xì)胞的百分率。

2.4 尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參照牛津杯法[9]，測(cè)定黃花蒿葉甲醇粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響，具體實(shí)驗(yàn)步驟按2.3的牛津杯方法。測(cè)量菌落直徑采用“十字交叉法”，每24 h測(cè)量1次，直至第8 d。用折線圖表示尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)曲線。

2.5 尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢量測(cè)定

按2.4方法，測(cè)定菌落直徑后，加入10 mL無(wú)菌水到培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)將培養(yǎng)基中的菌絲和孢子輕輕刮下，再用布氏漏斗過(guò)濾，用10 mL的無(wú)菌水清洗漏斗，最后定容到30 mL，在雙目生物顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子的產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)率

圖1結(jié)果表明，黃花蒿葉甲醇提取物在一定程度上能抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)，隨著黃花蒿葉甲醇提取物濃度的增加，其對(duì)孢子萌發(fā)率的抑制作用顯著增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，當(dāng)質(zhì)量濃度為3.66、5.13 mg·mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)率沒(méi)有明顯差異。當(dāng)質(zhì)量濃度為8.55、25.65 mg·mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)率分別是63.32%、58.42%，相比對(duì)照顯著降低。

3.2 尖孢鐮刀菌的孢子活力

用吖啶橙-碘化丙啶對(duì)孢子進(jìn)行染色后在熒光顯微鏡下觀察尖孢鐮刀菌孢子狀態(tài)。吖啶橙能透過(guò)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，將活細(xì)胞染成綠色。碘化丙啶則可進(jìn)入死細(xì)胞，與DNA結(jié)合，將細(xì)胞染成紅色。圖1和圖2的結(jié)果表明，當(dāng)黃花蒿葉甲醇提取物質(zhì)量濃度為3.66 mg·mL-1時(shí)，尖孢鐮刀菌孢子活力為71.6%，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度增加到25.65 mg·mL-1時(shí)，與對(duì)照組相比，孢子的活力降低了12.5%。因此，尖孢鐮刀菌的孢子活力隨著黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度的增加顯著降低。

3.3 尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)曲線

圖3的結(jié)果表明，從第3天開(kāi)始，各處理組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，黃花蒿葉甲醇提取物質(zhì)量濃度增大，其對(duì)尖孢鐮刀菌的菌落生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)。在第8天時(shí)，與對(duì)照組相比，菌落直徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3為培養(yǎng)8 d的尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)曲線，隨著黃花蒿葉甲醇提取物濃度的增加，菌落的直徑顯著降低。圖4的結(jié)果顯示，第8天時(shí)，對(duì)照組的菌落直徑為78.0 mm，當(dāng)黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度增加到25.65 mg·mL-1時(shí)，菌落直徑最小為36.5 mm。上述結(jié)果表明，隨著黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度的增加，對(duì)尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用顯著增強(qiáng)。

注：同系列不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同系列相同字母表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖1 黃花蒿葉甲醇提物粗提物對(duì)孢子萌發(fā)率、孢子活力的影響

注：A.對(duì)照；B.3.66 mg·mL-1；C.5.13 mg·mL-1；D.8.55 mg·mL-1；E.25.65 mg·mL-1。圖2 不同質(zhì)量濃度黃花蒿葉甲醇粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌孢子活力的抑制作用

圖3 不同質(zhì)量濃度黃花蒿葉甲醇粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌菌落生長(zhǎng)的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度黃花蒿葉甲醇粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的抑制作用

3.4 尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量

圖5結(jié)果表明，黃花蒿葉甲醇提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量有顯著抑制作用，各處理組與對(duì)照相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度的增加，尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量顯著降低。對(duì)照組的產(chǎn)孢量為1.91×107個(gè)·mL-1，而當(dāng)黃花蒿葉甲醇粗提物質(zhì)量濃度增加到25.65 mg·mL-1時(shí)，尖孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量最低，為1.79×106個(gè)·mL-1，與對(duì)照組相比降低了90.61%。

注：圖中不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相同字母表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖5 黃花蒿葉甲醇粗提物對(duì)尖孢鐮刀菌孢子產(chǎn)量的影響

4 討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程，根腐病是一種毀滅性病害。三七根腐病有多種表現(xiàn)癥狀，包括莖基干枯型、干裂型、髓爛型、黃腐型、濕腐型和急性青枯型等，其中較常見(jiàn)的是黃腐型，在三七生長(zhǎng)的不同年限里均可發(fā)生。三七的根腐病制約著三七的產(chǎn)量和質(zhì)量，阻礙了三七產(chǎn)業(yè)的持久發(fā)展。目前，對(duì)三七根腐病的防治主要是生物防治、化學(xué)防治和輪作。生物防治在一定程度上可以促進(jìn)三七種子的出苗，但是對(duì)于三七根腐病的防治卻沒(méi)有達(dá)到理想的效果。輪作雖然可以緩解根腐病的發(fā)生，但因其年限較長(zhǎng)，而不能夠大面積推廣?；瘜W(xué)防治雖然能夠在一定程度上緩解三七的根腐病，但不能夠完全控制，而且會(huì)降低藥材的質(zhì)量并對(duì)土壤有一定的污染。三七根腐病的病原菌具有多樣性，不但真菌可侵染，細(xì)菌和線蟲(chóng)亦可侵染致病，其中以真菌為主。根據(jù)不同的病原菌引起的根腐病進(jìn)行系統(tǒng)、全面的研究，才能有效揭示根腐病的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)過(guò)程，從而為三七根腐病的防治研究提供理論基礎(chǔ)[11]。

尖孢鐮刀菌在土壤中生存能力較強(qiáng)，是一種土壤習(xí)居菌，其產(chǎn)生的厚垣孢子可在土壤中存活10年之久。病原菌從植株的根系侵染植株，并產(chǎn)生分生孢子，以小型分生孢子的形態(tài)隨蒸騰流運(yùn)輸?shù)街仓甑厣喜?，繼而定殖于根系和上部莖，導(dǎo)致植株地上部發(fā)病。在運(yùn)輸過(guò)程中，尖孢鐮刀菌會(huì)產(chǎn)生對(duì)植株有害的次生代謝產(chǎn)物，即鐮刀菌酸，對(duì)植株的生長(zhǎng)也有一定的破壞作用。本研究結(jié)果表明，黃花蒿葉的甲醇提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。不同濃度的黃花蒿葉甲醇提取物抑菌效果不同，并且抑菌效果隨質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)。當(dāng)黃花蒿葉甲醇粗提物的質(zhì)量濃度為25.65 mg·mL-1時(shí)，尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)率較對(duì)照組顯著降低(見(jiàn)圖1)；從而導(dǎo)致孢子活力的降低和孢子產(chǎn)量的減少(見(jiàn)圖1、圖5)；病原菌菌絲的生長(zhǎng)受到抑制(見(jiàn)圖3、圖4)。

初步研究表明，植物中的活性成分對(duì)真菌的作用機(jī)制較復(fù)雜，目前此方面的研究主要是植物的粗提液對(duì)病原菌的直接抑制作用。主要表現(xiàn)形式為抑制附著孢子的形成、孢子的游動(dòng)、菌絲體的生長(zhǎng)及體外鈍化效果等。尖孢鐮刀菌侵染三七植株，主要通過(guò)病原菌產(chǎn)生的孢子、菌絲附著在三七的根部，進(jìn)而導(dǎo)致三七的根部變黃腐爛，在本實(shí)驗(yàn)中，制得黃花蒿葉甲醇提取物對(duì)尖孢鐮刀菌的孢子活力、孢子萌發(fā)及菌絲的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，進(jìn)而可從源頭上抑制三七根腐病的發(fā)生。黃花蒿提取物的作用范圍廣泛，對(duì)不同的菌類(lèi)都有一定的抑制作用。相關(guān)研究表明，黃花蒿不同溶劑得到的提取物，對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、單核增多性李氏桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌均有不同程度的抑菌作用[12-13]。另有一些研究結(jié)果表明黃花蒿有機(jī)溶劑提取物對(duì)許多植物性病原菌如黑曲霉、黃曲霉、青霉、毛霉等真菌也具有顯著的抑制作用[14-17]。

本研究主要針對(duì)黃花蒿葉甲醇提取物對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)行分析，但對(duì)于具體成分未進(jìn)行深入的研究，黃花蒿能否與三七間作從而解決三七連作問(wèn)題也待進(jìn)一步觀察。今后，可對(duì)黃花蒿葉甲醇提取物的成分進(jìn)一步研究，找出其抑制土傳病害病原菌的主要活性成分，為綠色農(nóng)藥的生產(chǎn)及生物制藥開(kāi)辟新的道路。黃花蒿在我國(guó)分布廣、產(chǎn)量大，若能以其為原料對(duì)黃花蒿資源進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，尋求病蟲(chóng)害防治的新途徑，將具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義。

[1] Guo H B，Cui X M，Nan N，et al.Sanchi ginseng(Panaxnotoginseng(Burkill)F.H.Chen)in China：distribution，cultivation and variations[J].Genet Resour Crop Evol，2010，57(3)：453-460.

[2] 劉莉，劉大會(huì)，金航.三七連作障礙的研究進(jìn)展[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2011，30(1)：70-75.

[3] Miao C P，Mi Q L，Qiao X G，et al.Rhizospheric fungi ofPanaxnotoginseng：diversity and antagonism to host phytopathogens[J].J Ginseng Res，2015，21(2)：127-134.

[4] 繆作清，李世東，劉杏忠，等.三七根腐病病原研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(7)：1371-1378.

[5] 譚勇，崔尹贍，季秀玲，等.三七連作的根際、根內(nèi)微生物變化與生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].中草藥，2017，48(2)：391-399.

[6] 智亞楠，陳月華，馬宇明，等.河南省黃花蒿揮發(fā)油的組分分析及抑菌作用測(cè)定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45(12)：105-109.

[7] 趙雅萌，馬玉楠，陳傳嬌，等.黃花蒿葉水提物對(duì)三七根際尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的抑制作用[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2018，30(3)：373-378.

[8] 方中達(dá).植病研究方法[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：142-156.

[9] 張建華，李敏，張波，等.八種單體多酚對(duì)葡萄酒微生物的抑菌活性比較[J].食品與發(fā)酵工程，2016，42(2)：101-106.

[10] Karina M，Valencia M，Valdés-Santiago L，et al.Naphthalene acetic acid potassium salt(NAA-K+)affects conidial germination，sporulation，mycelial growth，cell surface morphology and viability ofFusariumoxysporumf.sp radici-lycopersici andF.oxysporumf.sp cubenseinvitro[J].J Agric Food Chem，2016，64(44)：8315-8323.

[11] 毛忠順，龍?jiān)戮?，朱?shū)生，等.三七根腐病研究進(jìn)展[J].中藥材，2013，36(12)：2051-2054.

[12] 張佳，王瑩，張峰，等.濾紙片法測(cè)定黃花蒿提取物對(duì)霉菌的抑制活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(5)：1153-1154.

[13] 張佳，張峰.黃花蒿葉中抑菌成分提取方法的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(3)：138-139.

[14] 吳靜，丁偉，張永強(qiáng)，等.黃花蒿(Artemisiaannua)提取物對(duì)兩種病原真菌的生物活性[J].農(nóng)藥，2007，6(10)：713-715，718.

[15] 劉芳.青蒿揮發(fā)油抗植物病原真菌活性的研究[J].白城師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，23(6)：26-28.

[16] 韓小冰，馬玲，馬偉，等.不同方法提取蒿屬植物有效物質(zhì)的抑菌活性研究[J].森林工程，2008，24(3)：13-16.

[17] 高志玲，陳艷，謝英輝.黃花蒿揮發(fā)油的體外抑菌活性研究[J].食品科學(xué)，2010，31(19)：209-211.