2 Hz電針對SNI誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)IRF8的作用*

王 英 江 茜 黃 誠

（1贛南醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，贛州341000；2贛南醫(yī)學院臨床護理教研室，贛州341000；3贛南醫(yī)學院生理教研室，贛州341000）

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是一種由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、功能障礙所致的慢性疼痛綜合征，以疼痛過敏、觸誘發(fā)痛和自發(fā)性疼痛為臨床特征。作為國際性難題的NP，在全世界有著高患病率，其中有 2/3 的病人藥物治療不能有效的的緩解癥狀，嚴重影響病人的生活質(zhì)量，同時給社會帶來巨大的壓力。NP的發(fā)病機制極其復(fù)雜且治療效果不佳。因此，對其發(fā)病機制的研究極其重要。而外周神經(jīng)背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 的損傷是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的主要原因之一。近年來，有大量文獻報道，外周神經(jīng)損傷后，可引起DRG內(nèi)一些致炎因子和分子的基因和蛋白表達的變化，從而誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[1,2]。

電針 (electroacupuncture, EA) 是由傳統(tǒng)針灸發(fā)展而來的，它作為一種輔助治療方法已廣泛應(yīng)用于臨床。2 Hz電針對神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于100 Hz電針[3]，大量實驗證實電針可通過作用于DRG來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[4,5]，但其作用機制尚不甚清楚。目前有學者認為，干擾素調(diào)節(jié)因子8 (transcription factors interferon regulatory factor 8, IRF8) 是啟動神經(jīng)病理性疼痛形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控脊髓小膠質(zhì)細胞的活化來啟動神經(jīng)病理性疼痛的形成[6]。有研究報道，對大鼠DRG進行脈沖射頻可降低脊髓小膠質(zhì)細胞IRF8的表達，從而緩解CCI模型誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛[7]。而關(guān)于IRF8在SNI模型中的表達情況尚未有研究，電針是否通過下調(diào)IRF8的表達，抑制小膠質(zhì)細胞的活化從而緩解神經(jīng)病理性疼痛也尚未有文獻報道?；诖?，我們提出電針通過抑制SNI模型大鼠DRG的IRF8表達抑制小膠質(zhì)細胞的活化，進而來緩解神經(jīng)病理性疼痛的假設(shè)，這就是本實驗所要解決的問題，以期進一步為電針應(yīng)用于臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論和實驗依據(jù)。

方 法

1.實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司 [動物中心許可證號：SCXK (湘) 2013-0004]。動物飼養(yǎng)環(huán)境為每天12小時光照/12小時黑暗，50 ± 5%濕度，25±1℃。實驗期間所有大鼠均自由飲食。大鼠實驗和飼養(yǎng)符合相關(guān)規(guī)定。

將符合實驗要求的大鼠隨機分為3組 (n = 16)：①Sham組；②SNI組；③SNI+EA組。在術(shù)后第1天開始，SNI+EA治療組大鼠給予雙側(cè)的足三里和三陰交穴位進行隔日電針治療21天，Sham組和SNI組大鼠則均給予上架不電針處理。于術(shù)前1 天和術(shù)后第3、7、10、14和21天分別測定其行為學變化。并于隔日電針的第3、7、14、21天，分別處死大鼠，立即取材。

2. 實驗試劑與儀器

IRF8多 克 隆 抗 體 (ab28696, Abcam)、anti-β-tublin抗體 (20160510, Solarbio)，CD11b (ab1211,Abcam)，HRP標 記 兔 二 抗 (7074, CST)，PVDF(Millipore)，A SYBR?Select Master Mix (4472908,Life technologies)，熒光二抗抗兔IgG (183967, Life technologies)。

華佗牌一次性針灸針（0.28 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司），韓氏多功能電針儀（北京華運安特科技有限公司），動態(tài)足底觸覺儀（意大利Ugo Basile），Western Blot（電泳、電轉(zhuǎn)移）系統(tǒng)（美國Bio-Rad），Lightcycler 480IIReal-Time PCR儀（瑞士Roche），MK3型酶標儀（美國Thermo），倒置熒光顯微鏡（日本 OLYMPUS） ZNHW-Ⅱ型恒溫電熱套（上海科靂儀器有限公司），SB-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）。

3.神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型制備

參照文獻[8]介紹的方法制備SNI模型。按35 mg/kg劑量給予大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，俯臥位固定于動物手術(shù)臺上，左腿消毒和鋪巾。于大腿股骨外緣凹陷中下部切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干。坐骨神經(jīng)干下1/3處分成腓總神經(jīng)、脛前神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。用玻璃棒分離3根神經(jīng)，并結(jié)扎腓總神經(jīng)和脛前神經(jīng)，剪斷，僅保留最細的進入腓腸肌的腓腸神經(jīng)，腹腔注射40萬單位青霉素液，肌肉和皮膚分兩層縫合。術(shù)畢放回原籠，單籠飼養(yǎng)。術(shù)后1天，進行機械痛敏測試，剔除出現(xiàn)運動功能障礙和未出現(xiàn)觸覺痛敏等不符合實驗要求的大鼠。Sham組只暴露坐骨神經(jīng)，不進行神經(jīng)結(jié)扎剪斷處理，其他手術(shù)操作同前。

4.電針的穴位與方法

根據(jù)文獻，電針穴位選取足三里（ST36，脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)2 mm）和三陰交（SP6，脛骨后、內(nèi)踝上部2 mm），于術(shù)后第一天參考大鼠穴位圖譜，分別垂直刺入足三里和三陰交兩穴，深7 mm、5 mm，將刺入穴位的針固定好，連接韓氏多功能電針儀給予大鼠給予“連續(xù)波”（2 Hz；波寬0.6 ms；電流起始強度為1 mA，每10 min遞增1 mA；時間30 min）治療。隨后隔日連續(xù)刺激，共 21天。

5. 機械縮足反射閾值（機械痛敏）的測定

采用動態(tài)足底觸覺儀（意大利Ugo Basile）測定大鼠機械痛敏。將大鼠置于透明的有機玻璃箱中，底為1 cm×1 cm的鐵絲網(wǎng)，實驗前先適應(yīng)15 min。采用測痛儀由下往上垂直刺激大鼠足底皮膚，逐漸加大刺激強度，記錄出現(xiàn)縮足反應(yīng)（如舔足、抬腿等）時的刺激強度為機械縮足反射閾值 (paw withdrawal threshold, PWT)，最大刺激強度不超過50 g，每只大鼠重復(fù)3次，每次間隔5 min，取平均值。

6. Western blot檢測

隔日電針3、7、14、21天后取材，快速取手術(shù)側(cè)L4、L5和L6DRG。提取總蛋白后，應(yīng)用BCA方法測量總蛋白濃度。將分裝的蛋白樣本 (30 μg) 進行SDS-PAGE (10%) 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉約1 h，按1:300 比例稀釋一抗孵育過夜；1:1 000比例稀釋與一抗對應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。最后，使用化學成像發(fā)光成像系統(tǒng)照相，通過Image tool圖像分析軟件讀取目的蛋白以及內(nèi)參條帶在PVDF膜上測得的光密度值，計算出目的蛋白表達量。

7. 取材及免疫組化切片制備

以1%戊巴比妥鈉腹腔注射 (100 mg/kg) 將大鼠麻醉，迅速開胸，經(jīng)左心室插管入主動脈升部，先用150 ml 預(yù)冷的生理鹽水快速灌流沖洗血液，然后給予200 ml 預(yù)冷的4%多聚甲醛（多聚甲醛溶于0.1 M PBS）緩慢灌流，直至大鼠身體變硬，大約2 h左右。取出手術(shù)側(cè)（本實驗為左側(cè)）L4-6節(jié)段DRG，放入4%多聚甲醛PFA溶液中外固定4～6 h，然后轉(zhuǎn)移到含20%、30%蔗糖中進行梯度脫水，直到組織沉底。將沉底的DRG組織取出后，用冷凍包埋劑(OCT)包埋，置于-80℃保存。切片時，-20℃冰凍切片機提前預(yù)冷，連續(xù)切片，DRG片厚10 μm，貼片于載玻片上，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

8. 免疫熒光染色

將已切好的DRG組織，用5% BSA封閉，37℃溫箱中孵育1 h；0.01 M PBS 漂洗，5 min ×3次，5% BSA按1:200比例稀釋一抗IRF8 (ab28696,Abcam)，CD11b (ab1211, Abcam) 4℃冰箱中過夜；0.0l M PBS漂洗5 min × 3次；按1:1 000加入熒光二抗，37℃溫箱中孵育1 h；0.0l M PBS 漂洗5 min × 3次；濾紙吸干，用抗熒光減弱劑封片；在熒光顯微鏡觀察IRF8的蛋白表達。

9. qPCR 檢測

各引物序列由上海生工生物工程公司合成。IRF8, Forward CCAGATCCTCCCTGACTGGT,Reverse TAAGGCTGAATGGTGTGCGT; GAPDH,Forward CAGCCGCATCTTCTTGTGC, Reverse GGTAACCAGGCGTCCGATA。 采 用 A SYBR? Select Master Mix試劑盒提取總RNA并配制20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：65℃，5 min；37℃，2 min；37℃，10 min；5個循環(huán)，70℃15 min。采用qPCR法進行擴增，PCR 擴增反應(yīng)條件為：預(yù)變性(95℃，10 min)；40個擴增循環(huán)，(95℃，10 s；61℃，20 s；72℃，25 s)；溶解(72℃～95℃，0.5℃，10 s/each)。每組重復(fù)檢測3次。采用2^-ΔΔCt法分析IRF8的mRNA表達水平。

10.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理并統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準誤(±SEM)表示，PWT的結(jié)果、qPCR和Western blot的結(jié)果采用two-way ANOVA檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1. 2 Hz電針對SNI模型大鼠機械縮足反射閾值(PWT) 的影響

實驗結(jié)果顯示：Sham組、SNI組和SNI+EA組在造模前的機械縮足反射閾值無差異(P ＞ 0.05)。與Sham組相比，SNI組在術(shù)后第3天即出現(xiàn)機械縮足反射閾值下降(P ＜ 0.001)，提示造模成功，且在觀察時間內(nèi)持續(xù)低于Sham組(P ＜ 0.001)。與SNI組相比，給予2 Hz電針干預(yù)后的第3、5、7、10、14和21天，機械縮足反射閾值顯著上升(P ＜ 0.05，見圖 1)。

2. 2 Hz電針對SNI模型大鼠DRG的IRF8 mRNA表達的影響

實驗結(jié)果顯示：與Sham 組比較，SNI組大鼠DRG中IRF8 的mRNA表達明顯增加 (P ＜ 0.01，P ＜ 0.001)；與SNI組比較，SNI+EA組大鼠DRG中IRF8 的mRNA表達顯著減少 (P ＜ 0.01，P ＜ 0.001，見圖2)。

3. 2 Hz電針對SNI模型大鼠DRG的IRF8蛋白表達的影響

實驗結(jié)果顯示：與Sham組相比，SNI組大鼠DRG中IRF8蛋白表達均明顯增加(P ＜ 0.05，P ＜ 0.01)；與SNI組相比，2 Hz EA治療21天后，DRG的IRF8蛋白表達顯著降低 (P ＜ 0.05，P ＜ 0.01，見圖3)。

圖1 2 Hz EA對 SNI 模型大鼠機械縮足反射閾值 (PWT)的影響(n = 8～16,±SEM)與 Sham 組比較：***P ＜ 0.001；與SNI 組比較：###P ＜ 0.001Fig.1 Effects of 2Hz EA on mechanical paw withdrawal threshold evoked by spared nerve injury in rats(n = 8～16,±SEM)***P ＜ 0.001, compared to Sham group, ###P ＜ 0.001,compared to SNI group.

圖2 2 Hz EA對SNI大鼠DRG中IRF8 mRNA表達的影響(n = 4,±SEM)與 Sham 組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與SNI 組比較，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001Fig.2 qPCR analysis of IRF8 mRNA expression in the L4-L6 DRG (n = 4,±SEM)**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001, compared to Sham group,##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001, compared to SNI group.

圖3 2 Hz EA對SNI大鼠DRG中IRF8蛋白表達的影響(n = 7,±SEM)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，與 Sham 組比較；#P ＜ 0.05，## P ＜ 0.01，與 SNI組比較Fig.3 Western blot analysis of IRF8 protein expression in the L4-6 DRG (n = 7,±SEM)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001, compared to Sham group, #P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01, compared to SNI group.

4. 2 Hz電針對SNI模型大鼠DRG的CD11b mRNA表達的影響

實驗結(jié)果顯示：與Sham組相比，SNI組大鼠DRG中CD11b mRNA表達均明顯增加 (P ＜ 0.05,P ＜ 0.001)；與SNI組相比，2 Hz EA治療21天后，DRG的CD11b mRNA表達顯著降低 (P ＜ 0.05,P ＜ 0.01, P ＜ 0.001，見圖 4)。

5. 2 Hz電針對SNI模型大鼠DRG的IRF8及CD11b蛋白表達分布的影響

免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與Sham組相比，SNI組大鼠DRG中IRF8及CD11b蛋白表達分布明顯增加；與SNI組相比，2 Hz EA治療7天后，大鼠DRG的IRF8及CD11b蛋白表達分布顯著降低（見圖5）。

圖4 2 Hz EA對SNI大鼠DRG中CD11b mRNA表達的影響(n = 4,±SEM)*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001，與Sham組比較；#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01, ###P ＜ 0.001，與 SNI組比較Fig.4 qPCR analysis of CD11b mRNA expression in the L4-6 DRG (n = 4,±SEM)*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001, compared to Sham group;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01, ## P ＜ 0.001, compared to SNI group.

討 論

神經(jīng)病理性疼痛是一種臨床常見的慢性病，其病因、發(fā)病機制及過程復(fù)雜。臨床治療方法效果不佳，嚴重影響病人的生活質(zhì)量。為此，闡明神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制及過程已刻不容緩，且可為臨床上治療神經(jīng)病理性疼痛提供新的治療途徑和方法。我們的實驗發(fā)現(xiàn)2 Hz電針可明顯緩解SNI所誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的機械痛敏，并顯著降低SNI模型大鼠DRG的IRF8基因和蛋白的表達水平。

本研究以選擇性坐骨神經(jīng)分支損傷 (SNI) 神經(jīng)病理性疼痛為實驗?zāi)Ｐ停琒NI模型與其他幾種模型相比較，具有疼痛發(fā)生時間早、維持時間長、損傷較小等特點，可減少傷口炎癥介質(zhì)所產(chǎn)生的疼痛，從而特異性的研究神經(jīng)病理痛。有研究表明，SNI模型對機械靈敏度以及熱反應(yīng)變化的長期性與臨床上的神經(jīng)病理性疼痛特征非常相似[8,9]。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，SNI模型大鼠術(shù)后的后肢足底和足背外側(cè)緣腓腸神經(jīng)的感受野出現(xiàn)明顯的機械痛敏，術(shù)后24小時內(nèi)開始出現(xiàn)，第14天達高峰，這與文獻報道的相一致[10]。給予2 Hz 電針隔日治療21天后PWT顯著上升，提示2 Hz 電針可緩解SNI所致的神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機械痛敏行為。這為我們進一步研究電針對SNI所致神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛機制提供了穩(wěn)定而可靠的大鼠模型。

IRF8是IRFs家族成員之一，在免疫和炎癥反應(yīng)、細胞周期和細胞凋亡等生物過程中起著關(guān)鍵作用。近期Masuda等發(fā)現(xiàn)，IRF8在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞中有特異性表達，提示IRF8在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的活化和基因表達中起著關(guān)鍵作用，并且與神經(jīng)病理性疼痛有著密切的相關(guān)性[11]。外周神經(jīng)損傷 (peripheral nerve injury, PNI) 后，脊髓小膠質(zhì)細胞的IRF8表達明顯上調(diào)[12]；在IRF8缺失小鼠，PNI術(shù)后誘導(dǎo)的觸覺異常性疼痛可得到緩解，但其基礎(chǔ)機械痛閾沒有變化；通過對PNI術(shù)后小鼠鞘內(nèi)注射IRF8的小干擾RNA (siRNA)，可抑制脊髓IRF8的上調(diào)表達，且可恢復(fù)PNI誘導(dǎo)的觸覺異常性疼痛[13]。以上研究表明IRF8通過激活并維持脊髓小膠質(zhì)細胞的活化參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和維持。證實了IRF8是啟動神經(jīng)病理性疼痛形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。但有關(guān)IRF8在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的作用研究甚少。

神經(jīng)病理性疼痛的形成和發(fā)展包含多因素相互的作用，其發(fā)病機制是由外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)共同調(diào)控的[14,15]。DRG是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中痛覺信息傳導(dǎo)的重要部位。比如，外周神經(jīng)損傷后，作為第一級神經(jīng)元的DRG接受外周疼痛信號的傳入進而將之傳送到脊髓背角及更高級中樞，通過阻斷DRG就可抑制外周痛覺信息向脊髓及上位中樞的傳遞，從而調(diào)控痛覺的發(fā)生發(fā)展。有研究報道，小膠質(zhì)細胞在DRG中有表達，且參與疼痛的調(diào)控[16]。為此，我們在實驗中觀察了IRF8在2 Hz電針對神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的作用，發(fā)現(xiàn)SNI大鼠術(shù)后第3、7、14和21天的DRG中IRF8的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高，提示在外周的IRF8可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的形成和發(fā)展；也發(fā)現(xiàn)SNI大鼠術(shù)后DRG中的小膠質(zhì)細胞的標志物CD11b的mRNA水平在第3、7、14和21天升高，而電針處理后IRF8的mRNA和蛋白表達水平、CD11b的mRNA水平均降低。為了證明IRF8與小膠質(zhì)細胞的關(guān)系，進一步的免疫熒光結(jié)果顯示，SNI術(shù)后7天，IRF8和CD11b的表達分布均明顯升高，且IRF8在DRG小膠質(zhì)細胞上表達，給予大鼠2 Hz 電針后可下調(diào)IRF8和CD11b的表達分布。以上結(jié)果提示2 Hz電針可能通過下調(diào)SNI大鼠DRG的IRF8基因和蛋白的表達，進而抑制DRG小膠質(zhì)細胞的活化, 來緩解神經(jīng)病理性疼痛的痛敏行為。

綜上所述，基于文獻報道和我們的實驗結(jié)果，提示2 Hz 電針作用于神經(jīng)病理性疼痛的可能鎮(zhèn)痛機制是通過下調(diào)DRG的IRF8表達來抑制DRG小膠質(zhì)細胞的活化，進而抑制神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，這也為電針治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新靶點，但本實驗未應(yīng)用IRF8拮抗劑進一步探討電針對SNI大鼠的鎮(zhèn)痛作用，鞘內(nèi)給予IRF8 siRNA或使用IRF8敲除大鼠，能進一步闡明電針對SNI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

圖5 2 Hz EA對SNI大鼠DRG中IRF8蛋白表達分布的影響 (n = 4, One-way ANOVA)***P ＜ 0.001，與 Sham 組比較；## P ＜ 0.01，與模型組比較Fig.5 Immunofluorescence analysis of IRF8 and CD11b protein expression in the L5 DRG of SNI rats (n = 4, Oneway ANOVA)Compared to sham group, marked up-regulation of DRG IRF8 and CD11b protein expression in SNI group. Compared to SNI group, significant down-regulation of DRG IRF8 and CD11b protein expression in SNI+EA group (double staining of IRF8 and CD11b in the DRG, Scale bar = 100 μm).***P ＜ 0.001,compared to Sham group; ##P ＜ 0.01,compared to SNI group.

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