酸奶生產(chǎn)中酵母菌分布及產(chǎn)品污染研究

柴艷兵，李興佳，張耀廣，李飛，屈雅莉，楊春杰

(君樂寶乳業(yè)集團(tuán)質(zhì)量管理中心石家莊050021)

0 引言

乳品中污染的微生物主要有霉菌、酵母菌和細(xì)菌。酸奶中較低的pH值能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但也為酵母菌的生長(zhǎng)提供了有利的條件，因此，酵母菌的污染成為引起酸奶變質(zhì)的主要菌群[1]。已有多名學(xué)者對(duì)酸奶中污染微生物進(jìn)行研究，表明酵母菌能夠很大程度上引起酸奶的脹包[2-5]。酵母菌的污染主要來源于車間的生產(chǎn)環(huán)境，但酵母菌在車間的具體分布情況，及產(chǎn)品中污染酵母菌的溯源，卻研究甚少。

26S rDNA D 1/D 2區(qū)域序列高度變異性的特點(diǎn)，使其成為有效的酵母菌種級(jí)水平鑒定方法[6-7]，許多學(xué)者利用26S rDNA D 1/D 2區(qū)域?qū)κ称分械慕湍妇M(jìn)行鑒定，從而確定優(yōu)勢(shì)菌群[8-11]。本文以酸奶生產(chǎn)車間和30℃保溫庫中的脹包酸奶為研究對(duì)象，通過利用空氣沉降法、表面涂抹法和劃線分離法，利用26S rDNA D 1/D 2基因序列，對(duì)分離出的酵母菌進(jìn)行分類鑒定，確定車間環(huán)境中酵母菌的分布及脹包產(chǎn)品中酵母菌的種類，通過溯源研究，為車間消毒殺菌的關(guān)鍵控制點(diǎn)提供理論依據(jù)，為產(chǎn)品中酵母菌污染的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

孟加拉紅培養(yǎng)基，麥芽浸粉肉湯，TIANam p Yeast DNA Kit酵母基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），Taq PCR M asterm ix，DNA M arkerⅢ，瓊脂糖凝膠，無水乙醇，溶菌酶，引物N L1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，N L4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

生化培養(yǎng)箱，電泳儀，PCR儀，壓力蒸汽滅菌器，恒溫水浴鍋，超凈工作臺(tái)，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸奶生產(chǎn)中酵母菌的分布研究

1.2.1.1 采樣時(shí)間：灌裝區(qū)每天進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)，其他區(qū)

域每周進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)周期為12個(gè)月。

1.2.1.2 采樣地點(diǎn)及方法

(1)采樣地點(diǎn)：配料區(qū)、熱處理間、巴殺區(qū)、接種區(qū)、發(fā)酵區(qū)、待裝區(qū)、灌裝區(qū)。

采樣方法：采用自然沉降法，將孟加拉紅瓊脂平板放置距離地面1m左右的監(jiān)測(cè)點(diǎn)，暴露15m in后合上蓋子，將平板倒置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。

(2)設(shè)備管路及表面：待裝罐內(nèi)壁、巴殺殺菌機(jī)出口管路內(nèi)壁、灌裝機(jī)成型器、灌注頭、膜軸。人員手部：測(cè)酸人員、灌裝機(jī)手、配料人員。

采樣方法：將滅菌的涂抹棒用滅菌的生理鹽水潤(rùn)濕，在被涂抹物表面迅速擦拭100 cm2，立即均勻的涂抹在孟加拉紅瓊脂平板上，將平板倒置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。

1.2.1.3 菌株的分離鑒定

收集所有的平板，挑取平板上不同形態(tài)的細(xì)菌菌落，接種于麥芽浸粉肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，根據(jù)酵母菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。

PCR反應(yīng)體系為：Taq PCR M asterm ix 25μL，正向引物N L1 1μL，反向引物N L4 1μL，DNA模板1μL，ddH2O 19μL。

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5 m in；30個(gè)循環(huán)，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s；72℃延伸10 m in；4℃保溫。擴(kuò)增完畢后，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選擇600 bp左右可見清晰條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

將測(cè)序序列在NCBI上Blast比對(duì)，獲取與所測(cè)序列相似度高的序列，確定菌株的分類地位。

1.2.2 產(chǎn)品中酵母菌的污染研究

收集30℃保溫庫中脹包的酸奶，從脹包中挑取一環(huán)劃線接種于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，將平板倒置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，按照1.2.1.3步驟進(jìn)行菌株的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶生產(chǎn)中酵母菌的分布

通過空氣沉降和設(shè)備涂抹法對(duì)酸奶生產(chǎn)中分離的酵母菌落進(jìn)行菌株鑒定，得到系統(tǒng)分類地位。由表1可以看出，空氣環(huán)境中共分離出132株酵母菌，共7個(gè)屬，分別為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)、紅酵母屬(Rhodotorula spp.)、囊酵母屬(Zygoascus spp.)、絲孢酵母屬(Trichosporon spp.)、鐵艾酵母屬(Tilletiopsis spp.)、隱球酵母屬(C ryptococcus spp.)。在設(shè)備表面及人員手部涂抹中，僅在灌裝機(jī)分離到一株酵母菌，為紅酵母屬(Rhodotorula spp.)，結(jié)果表明，酵母菌在設(shè)備表面上存在較少，大部分都存在在空氣中。因此，空氣的清潔度決定了酵母菌在車間的污染程度。

2.2 生產(chǎn)環(huán)境中不同酵母菌的污染比例

由圖1可知，在酸奶生產(chǎn)環(huán)境中，不同酵母菌的存在比例依次為：熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)（21.05%）、阿氏絲孢酵母(T richosporon asahii)（16.54%）、中間假絲酵母(Candida intermedia)（12.03%）、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)（8.27%）、葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)（8.27%）、擬平滑念珠菌(Candida orthopsilo-sis)（7.52%）、C ryptococcus friedmannii（7.52%）、Tilletiopsis albescens（6.77%）、C ryptococcus saitoi（3.76%）、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)（3.01%）、大隱球酵母(C ryptococcus magnus)（2.26%）、小紅酵母(Rhodotorula minuta)（1.50%）、Zygoascusmeyerae（0.75%）、T richosporon coremiiforme（0.75%）。假絲酵母屬(Candida spp.)占總數(shù)的48.87%，為空氣中酵母菌的優(yōu)勢(shì)菌群。

2.3 產(chǎn)品中酵母菌的污染研究

通過對(duì)32個(gè)脹包產(chǎn)品中污染的酵母菌進(jìn)行鑒定（表2），結(jié)果表明，引起產(chǎn)品脹包的酵母菌種類穩(wěn)定，主要為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)和W ickerhamomyces spp.。共分離得到5種酵母菌，分別為中間假絲酵母(Candida intermedia)、葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、異常威克漢姆酵母(W ickerhamomyces anomalus)，引起脹包比例為56.25%、15.63%、12.505%、9.38%、6.25%。

由表1可以看出，中間假絲酵母(Candida intermedia)存在于配料區(qū)、灌裝區(qū)、灌裝機(jī)膜倉(cāng)和包材間，葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)僅存在于灌裝區(qū)和包材間的空氣中，產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)存在于配料區(qū)、灌裝區(qū)和包材間空氣中，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)主要存在于灌裝區(qū)、灌裝機(jī)膜倉(cāng)和包材間的空氣中。4類污染酵母菌在灌裝區(qū)數(shù)量最多，其次為包材間，因此，產(chǎn)品中酵母主要是通過灌裝間的空氣和包材間的空氣污染的。加強(qiáng)灌裝間和包材間空氣質(zhì)量的消毒清潔，是防止酵母菌污染產(chǎn)品的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

引起產(chǎn)品污染的異常威克漢姆酵母(W ickerhamomycesanomalus)在車間環(huán)境中沒有分布，推測(cè)可能是由于包裝材料表面自身帶菌而引起產(chǎn)品的污染。因此，加強(qiáng)車間環(huán)境控制的同時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制包裝材料的微生物質(zhì)量，以杜絕由包材導(dǎo)致的產(chǎn)品問題。

3 結(jié)論與討論

引起酸奶脹包的主要微生物為大腸菌群和能夠發(fā)酵產(chǎn)氣的酵母菌。由于大腸菌群在較低的pH值環(huán)境下很難生長(zhǎng)，而酵母菌在3.0～7.5的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，其最適PH值為4.5～5.0，因此，酸奶中酵母菌的污染，受到所有企業(yè)的重點(diǎn)關(guān)注。本文通過對(duì)車間環(huán)境中酵母菌的分布和污染產(chǎn)品的酵母菌研究，建立酵母菌的關(guān)鍵污染途徑，為產(chǎn)品中酵母菌污染的防控措施提供重要的依據(jù)。

通過本文可知，空氣環(huán)境中存在的酵母菌共7個(gè)屬，分別為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)、紅酵母屬(Rhodotorula spp.)、囊酵母屬(Zygoascus spp.)、絲孢酵母屬(Trichosporon spp.)、鐵艾酵母屬 (Tilletiopsis spp.)、隱球酵母屬(C ryptococcus spp.)。污染產(chǎn)品的微生物主要為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)和W ickerhamomyces spp.，其中，假絲酵母屬(Candida spp.)污染比例高達(dá)78.13%，與車間酵母菌屬的分布比例相符，說明產(chǎn)品中大部分的污染微生物來自于車間的環(huán)境。

表1 車間環(huán)境中酵母菌的分布

圖1 生產(chǎn)環(huán)境中不同酵母菌的污染比例

表2 產(chǎn)品中污染酵母分類及比例

在5種污染酵母菌中，前4種分布在配料區(qū)、灌裝區(qū)、灌裝機(jī)膜倉(cāng)和包材間中，根據(jù)酸奶的生產(chǎn)工藝，配料完成后會(huì)進(jìn)入巴氏殺菌程序，因此，配料區(qū)存在的酵母菌不足以引起產(chǎn)品的污染，最主要的污染途徑有2種，一種是灌裝車間的空氣帶入的污染，一種是包裝車間的空氣間接引起的污染。由于包裝材料能直接接觸到產(chǎn)品，包材間的空氣質(zhì)量，也必須引起重視，不能疏忽。

食品生產(chǎn)車間常用的空氣消毒方法有空氣過濾、紫外線消毒、臭氧消毒、熏蒸消毒、雙氧水消毒、化學(xué)氣溶膠噴霧消毒、靜電吸附等，每種辦法都有其適用的范圍和使用的局限性[12]，因此選用合適的消毒方法對(duì)酵母菌的控制起到關(guān)鍵性作用。由于灌裝車間和包裝材料都會(huì)直接接觸產(chǎn)品，建議使用經(jīng)濟(jì)、安全、無害的消毒劑，如食品級(jí)雙氧水，不含有毒有害雜質(zhì)，用噴霧器將消毒溶液噴灑在空氣中，即可起到對(duì)生產(chǎn)空間消毒的效果[13]。同時(shí)加大對(duì)灌裝車間和包材間的消毒頻次，以降低酵母菌的擴(kuò)散與繁殖。

在對(duì)車間環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格管控的同時(shí)，已有部分學(xué)者開始尋找能夠有效抑制酸奶中霉菌和酵母菌的益生菌[14-16]。通過車間環(huán)境消毒和優(yōu)良菌種的篩選，可以有效的解決酸奶中酵母菌的污染問題。

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