響應(yīng)面法優(yōu)化胡蘿卜乳酸飲料的生產(chǎn)工藝及對DPPH的清除作用

劉治心，張婉瀅，李湘利，劉靜

（濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜273155）

0 引言

乳酸飲料主要以牛奶、果蔬等為原料，利用乳酸發(fā)酵作用制備的富含活性乳酸菌及代謝物的飲料[1-2]，具有調(diào)節(jié)人體微生態(tài)平衡、延緩衰老、降低膽固醇和提高機體免疫力等功效[3]。含有功效成分的果蔬原料進(jìn)行乳酸發(fā)酵可進(jìn)一步提高營養(yǎng)價值，具有廣闊市場前景[4]。現(xiàn)有研究表明[5]，自由基可引起癌癥、動脈粥樣硬化和老年癡呆等100余種疾病，是導(dǎo)致衰老的主要因素。具有自由基清除能力的天然抗氧化劑與合成抗氧化劑已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點[6-7]。

胡蘿卜（Daucus carota L.），又稱紅蘿卜或甘荀，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分及β-胡蘿卜素、鈣、鐵、鋅等元素[8]，具有防癌抗癌、降壓降脂、抗衰老、清除自由基、降低腫瘤發(fā)生率、增加免疫力等功效，是一種對人體健康極為有益的果蔬原料[9]。為開發(fā)乳酸飲料的適宜果蔬種類，制備一種具有較強DPPH自由基清除作用的果蔬飲料，本研究以胡蘿卜、牛奶為主要原料，應(yīng)用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，以期獲得一種口味極佳、風(fēng)味獨特、具有較強抗氧化作用的新型胡蘿卜乳酸飲料。

1 實驗

1.1 材料與試劑

胡蘿卜，牛奶，白砂糖，果膠酶（酶活性＞32 000 U/g），乳酸菌（保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌=1∶1），羧甲基纖維素鈉（CMC）、黃原膠、海藻酸鈉等，食品添加劑級；DPPH·，Sigm a分裝；其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JM-50膠體磨，TD 6低速離心機，DH 6000II恒溫培養(yǎng)箱，SCBX-1000蔬菜保險柜，723PC可見分光光度計，F(xiàn)A 2004N電子天平，30-6 S高壓均質(zhì)機。

1.3 方法

1.3.1 胡蘿卜乳酸飲料的制備

胡蘿卜經(jīng)清洗去污，沸水熱燙4～6 m in，冷卻后按一定料液比榨汁。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%檸檬酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的Vc（按胡蘿卜質(zhì)量計）護(hù)色，用0.04%的果膠酶在45℃酶解90 m in。在胡蘿卜汁中加入牛奶、白砂糖和穩(wěn)定劑，加熱至50～60℃于15～20 M Pa均質(zhì)，在90～95℃殺菌5 m in，冷卻至45℃后接種乳酸菌發(fā)酵、0～4℃冷藏即得胡蘿卜乳酸飲料[10]。

1.3.2 單因素實驗

考察胡蘿卜與水的比例（料液比）、加奶量、加糖量、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對胡蘿卜乳酸飲料發(fā)酵酸度、感官評分和DPPH清除率的影響。乳酸發(fā)酵基本條件為料液比1∶3，加奶量15%，加糖量6%，接種量0.015%，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵時間8 h。其中，料水比設(shè)定為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5；加奶量設(shè)定為10.0%，12.5%，15.0%，17.5%，20.0%；加糖量設(shè)定為4%，5%，6%，7%，8%；接種量設(shè)定為0.005%，0.010%，0.015%，0.020%，0.025%；發(fā)酵溫度設(shè)定為38，40，42，44，46℃；發(fā)酵時間設(shè)定為4，6，8，10，12 h。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取加糖量（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、接種量（X3）、發(fā)酵時間（X4）四個對胡蘿卜乳酸飲料影響較大的因素為自變量，以感官評分為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理[11]，采用Design-Expert V 8.0.6軟件對所得結(jié)果進(jìn)行分析，獲得最佳制備工藝條件。實驗因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平

1.3.4 穩(wěn)定性實驗

以CM C（羧甲基纖維素）-黃原膠、CM C-海藻酸鈉、黃原膠-海藻酸鈉為穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑添加量為0.3%，于所得最佳條件下制備乳酸飲料，冷藏靜置30 d后測定飲料穩(wěn)定性[12]。

1.3.5酸度的測定

采用GB5413.34-2010測定，用吉爾涅爾度（°T）表示[13]。

1.3.6感官評價方法

由10人組成感官評定小組，對乳酸飲料顏色、香味、組織狀態(tài)和口感進(jìn)行評定[14]，標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

1.3.7 DPPH清除率的測定

參照李湘利等[15]的方法略調(diào)整。用無水乙醇配制濃度為0.2 mm o l/L的DPPH溶液，移取2 m L乳酸飲料（經(jīng)3 000 r/m in離心10 m in得上清液）于10 m L試管中，加入DPPH溶液2m L，室溫反應(yīng)30m in，于517 nm測吸光值（A1），測定同體積飲料和無水乙醇混勻后的吸光值（A2）及無水乙醇和DPPH混勻后的吸光值

表2 胡蘿卜乳酸飲料的感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.8 穩(wěn)定性的測定

離心管洗凈并稱其質(zhì)量（M1），取10 m L飲料于離心管中，在3 000 r/m in離心20 m in，棄去上清液后倒置10 m in，稱取沉淀物和離心管的質(zhì)量（M2），計算沉淀率[12]，即

1.3.9成品指標(biāo)的測定

蛋白質(zhì)測定采用凱氏定氮法，總糖測定采用直接滴定法，可溶性固形物測定采用手持折光儀法[16]；微生物指標(biāo)測定參照文獻(xiàn)[17]的方法。

1.3.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用軟件IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行單因素結(jié)果分析，應(yīng)用軟件Design Expert 8.0.7建立數(shù)學(xué)模型和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比的確定

由表3可以看出，料水比為1∶3時，所得乳酸飲料的顏色、香味、組織狀態(tài)及口感均較好，感官評分為87分，高于其他處理（P＜0.01）。因此，確定料水比1∶3進(jìn)行單因素實驗和響應(yīng)面實驗研究。

2.2 單因素實驗結(jié)果

由圖1可知，隨加奶量（圖1a）增加和發(fā)酵時間（圖1e）延長，感官評分和DPPH清除率先增大后減小，酸度逐漸上升；隨加糖量（圖1b）增加，酸度略有下降，感官評分和DPPH清除率呈先升后降的趨勢；隨接種量（圖1c）增大和發(fā)酵溫度（圖1d）升高，酸度、感官評分和DPPH清除率均呈先增大后減小的變化趨勢。考慮到技術(shù)與經(jīng)濟(jì)因素，選擇加奶量15%、加糖量6%、接種量0.010%、發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時間7 h為較優(yōu)工藝參數(shù)，為突出胡蘿卜乳酸飲料特性，固定加奶量15%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

以X1（加糖量）、X2（發(fā)酵溫度）、X3（接種量）、X4（發(fā)酵時間）為變量，以乳酸飲料感官評分為響應(yīng)值，根據(jù)BoX-Behnken中心組合實驗原理設(shè)計響應(yīng)面實驗，結(jié)果如表4所示。

表3 料水比對飲料感官品質(zhì)的影響

圖1 各單因素對酸度、感官評分及DPPH清除率的影響

表4 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

2.3.1回歸模型的建立與分析

利用軟件Design-Expert 8.0.6對表4的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到乳酸飲料感官評分（Y）與各因素之間的回歸方程：Y=-989.48+12.84X1+43.18X2+4397.00X3+26.89X4+0.038X1X2-5.00X1X3+0.42X1X4-75.00X2X3-0.18X2X4-40.00X3X4-1.32X12-0.49X22-50933.33X32-1.57X42。

對所得實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面回歸模型方差分析

由表5可知，失擬項不顯著（P=0.2652＞0.05），而模型極顯著（P＜0.0001），模型確定系數(shù)R2=0.9100，調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.8200，這表明實驗?zāi)Ｐ湍茌^好的反應(yīng)各因素與響應(yīng)值間的變化關(guān)系，可預(yù)測乳酸飲料的實際得分。方差分析還表明，X2，X12，X22，X32，X42對感官評分影響極顯著（P＜0.01），X3和X4影響顯著（P＜0.05），其他項不顯著（P＞0.05），各因素對感官評分的影響順序是X2＞X4＞X3＞X1，即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞接種量＞加糖量。在α=0.05水平上剔除不顯著項，得到簡化方程：Y=–989.48+43.18X2+4397.00X3+26.89X4–1.32X12–0.49X22–50933.33X32–1.57X42。

2.3.2 響應(yīng)面分析

由圖2可知，響應(yīng)面的開口向下，而且當(dāng)固定一個變量時，感官評分都會隨著另一個變量的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，響應(yīng)曲面圖越陡，說明所對應(yīng)的實驗因素對響應(yīng)值的影響也越顯著[18-19]，這與方差分析的實驗結(jié)果一致。各因素在所選范圍內(nèi)均有最佳響應(yīng)值，這說明實驗因素所選范圍是合理的。

2.3.3 最佳組合的確定與驗證

圖2 各因素交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果分析，得到胡蘿卜乳酸飲料的最佳工藝條件：加糖量6.55%，發(fā)酵溫度42.66℃，接種量0.01%，發(fā)酵溫度6.95 h，感官評分預(yù)測值為86.0142?？紤]到實際可操作性，將配方調(diào)整為加糖量6.5%，發(fā)酵溫度42.5℃，接種量0.010%，發(fā)酵溫度7 h。為驗證模型可靠性，于最佳條件下進(jìn)行三次驗證性實驗，所得飲料的酸度為36.78°T、感官評分為88.79分，DPPH清除率為95.97%。

2.4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由表6可知，當(dāng)CMC∶黃原膠=1∶2時，乳酸飲料的沉淀率最小，穩(wěn)定性最高，優(yōu)于CMC∶海藻酸鈉、黃原膠∶海藻酸鈉的各處理（P＜0.01），故選擇CM C與黃原膠比例1∶2的復(fù)合穩(wěn)定劑。為改善產(chǎn)品風(fēng)味，添加0.06%的檸檬酸進(jìn)行調(diào)配，于最適條件下制備胡蘿卜乳酸飲料，其酸度為37.85°T，感官評分95.05分，DPPH清除率96.32%。

2.5 產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)

2.5.1 感官指標(biāo)

色澤呈淺橘黃色，質(zhì)地均勻、無分層和雜質(zhì)、流動性好，有濃厚的胡蘿卜香和輕微乳香、香氣協(xié)調(diào)，口感細(xì)膩，滋味純正，酸甜適口。

2.5.2 理化指標(biāo)

蛋白質(zhì)0.7%，總糖7.0%，可溶性固形物12.8%，酸度37.85°T。

表6 復(fù)合穩(wěn)定劑添加比例對胡蘿卜乳酸飲料穩(wěn)定性的影響

2.5.3 微生物指標(biāo)

乳酸菌≥106CFU/m L，大腸菌群≤1 CFU/m L，致病菌符合GB29921-2013[20]限量要求。

3 結(jié)論

以胡蘿卜和牛奶為原料，制備了一種具有較強DPPH清除效果的胡蘿卜乳酸飲料，所得最佳工藝參數(shù)為料水比（胡蘿卜∶水）為1∶3，胡蘿卜汁添加量85%，牛奶添加量15%，加糖量6.5%，乳酸菌接種量0.010%，發(fā)酵溫度42.5℃，發(fā)酵時間7 h；最佳穩(wěn)定劑組合是CMC∶黃原膠1∶2，添加量0.3%；檸檬酸添加量0.06%。所得乳酸飲料色澤呈淺橘黃色，具有濃厚胡蘿卜香和輕微乳香，口感細(xì)膩、甜酸適口、滋味純正。該飲料對DPPH自由基的清除率為96.32%，蛋白質(zhì)含量為0.7%，總糖7.0%，可溶性固形物12.8%，酸度37.85°T。

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