植物乳桿菌胞外多糖的分離純化及其抗氧化性研究

楊晨璐，馬林，周蕊，饒晴，邱朝坤，凌潔玉

（1.武漢設(shè)計工程學院，食品與生物科技學院，武漢430205；2.武漢科技大學醫(yī)學院，武漢430065；3.蒙牛乳制品武漢有限責任公司，武漢430040）

0 引言

乳酸菌胞外多糖（Exopo lysaccharides,EPS）是乳酸菌在生長代謝中分泌到細胞壁外的黏液多糖和莢膜多糖的總稱[1]。乳酸菌是公認的益生菌，與其他菌相比安全性更高。乳酸菌的EPS已作為增稠劑、穩(wěn)定劑等應(yīng)用到一些食品中[2]，可以顯著改善或增強乳制品的口感和流變學特性[3]，且大量研究證明其具有抗氧化、抑制腫瘤、增強人體免疫力等多種生理功能[3]，被公認為安全而有效的食品添加劑。本研究前期從湖北特色發(fā)酵食品鲊辣椒中分離出一株植物乳桿菌，并證實其能夠有效發(fā)酵乳制品與泡菜。本研究對其胞外多糖進行提取純化，并研究各胞外多糖組分的抗氧化活性，為將該菌開發(fā)為乳制品及其他發(fā)酵食品的益生菌種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），由本研究室前期從湖北宜昌某農(nóng)家自制鲊辣椒中分離。

DEAE Cellulose DE-52，分析純，東京化成工業(yè)株式會社；胃蛋白酶、胰蛋白酶，分析純，Biosharp；SephadexG-200，分析純，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；葡聚糖2 000、葡聚糖T 10、T 20、T 40、T 70、DPPH，分析純，上海金穗生物科技有限公司；鐵氰化鉀、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、鄰二氮菲，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722型可見分光光度計，天津市普瑞斯儀器有限公司；754PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌胞外多糖的提取

采用前期優(yōu)化的提取方法。取植物乳桿菌菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 h，活化3代。取發(fā)酵液離心，將上清液50℃減壓濃縮至10～20 m L，調(diào)節(jié)pH值為6.0，加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿：正丁醇=4∶1），震蕩30 m in后，4 000 r/m in離心15 m in，收集上層水相溶液，重復(fù)以上操作至兩相之間無蛋白質(zhì)層為止。隨后按體積比1∶3加入90%的乙醇，4℃沉淀14 h，5 000 r/m in離心30 m in，沉淀用丙酮洗滌脫水兩次，冷凍干燥得白色粉末即為胞外粗多糖。

1.3.2 胞外多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線，以標準葡萄糖含量（μg）為橫坐標，吸光度值（A490）為縱坐標作圖，得回歸方程為y=0.007x-0.0156，R2=0.9994。吸取定容后的樣品液0.1 m L，同標曲的操作，將測得的吸光度值代入標準曲線，計算樣品中的多糖含量。

1.3.3 胞外多糖的純化

將胞外粗多糖先采用DEAE Cellu lose DE-52分離純化，分離條件為：上樣濃度2 m g/m L，上樣體積10m L，先用雙蒸餾水洗脫，再用0.5 m ol/L N aC l溶液洗脫，流速為1 m L/m in，每4 m in收集一管，各收集16管。在波長490 nm處以苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測，以號管為橫坐標，吸光值為縱坐標做洗脫曲線。分別收集雙蒸餾水與N aC l洗脫液下的洗脫峰組分，采用SephadexG-200進一步純化。用0.1 m ol/LN aC l溶液洗脫，流速為1 m L/m in，每4 m in收集一管，各收集20管。在波長490 nm處以苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測，分別收集洗脫峰組分，PBS透析過夜，冷凍干燥得白色粉末即為純化后的胞外多糖。

取純化的中性多糖和酸性多糖分別配成1 m g/m L的溶液，將紫外分光光度計的波長設(shè)定在200～400 nm處進行掃描，觀察吸收峰的位置。

1.3.4 胞外多糖分子量測定

釆用葡聚糖凝膠過濾法，將藍色葡聚糖2 000配制的3 m g/m L溶液，上樣SephadexG-200凝膠柱，0.1 m oL/L N aC l洗脫，控制流速為1 m L/m in，每5 m in收集一管，共收集20管，在波長490 nm處以苯酚-濃硫酸法跟蹤檢測，準確測定洗脫體積V0；將葡聚糖標準品T 10、T 20、T 40、T 70配制成3 m g/m L濃度的溶液，分別上樣，準確測定其洗脫體積V e。并以V e/V0和相對分子量的對數(shù)lgMW作圖，獲得標準曲線。將未知分子量的多糖樣品在相同條件下層析，根據(jù)洗脫體積在標準曲線上求得其相對分子質(zhì)量。

1.3.5 胞外多糖體外抗氧化性研究

1.3.5.1 羥自由基（·OH）清除能力測定

取0.75 mm ol/L鄰二氮菲1 m L于試管中，加入2 m L pH 7.4的PBS，1 m L蒸餾水，充分混勻，加入0.75 mm ol/L的 FeSO41 m L，再加 20 mm o l/LH2O21 m L，37℃水浴90 m in，536 nm處測其吸光度，記為Ap；用1 m L蒸餾水代替1 m LH2O2進行上述反應(yīng)和測定，記為Ab；用樣品代替1m L蒸餾水，為As。羥自由基的清除率按式（1）計算：

1.3.5.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

試管中加入4.5 m LT ris-HC l緩沖溶液（50 mm ol/L）與4.5 m L蒸餾水，混勻后在37℃水浴中保溫20 m in，隨后立即加入37℃預(yù)熱過的鄰苯三酚（3 mm ol/L）0.5 m L，迅速混勻后導(dǎo)入比色皿中，在波長325 nm處每隔30 s測定一次吸光度，以10 mm o l/LHC l溶液配制空白對照組。計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加。樣品管在加入鄰苯三酚前，先加入0.5 m L樣品液，蒸餾水相應(yīng)減少0.5 m L，其余同前。超氧陰離子自由基清除率按式（2）計算。

超氧陰離子自由基清除率/%

其中，ΔA 1/ΔA t為鄰苯三酚自氧化時的反應(yīng)速率；ΔA 2/ΔA t為加入樣品后鄰苯三酚自氧化時的反應(yīng)速率。

1.3.5.3 DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定

取2 m L樣品溶液與2 m L 0.2 mm o l/L的DPPH甲醇溶液混合，室溫下避光反應(yīng)30 m in，517 nm處測定吸光值A(chǔ)i；空白組以等體積甲醇代替DPPH溶液，為A j；對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液；為A0。DPPH自由基的清除率按式（3）計算。

1.3.5.4 還原能力測定

采用鐵氰化鉀法。取1 m L樣品于試管中，加入0.2 m o l/L pH 6.6的PBS及1%的鐵氰化鉀溶液各1 m L，混勻。50℃水浴反應(yīng)20 m in，驟冷。再加入1 m L5%三氯乙酸，4 000 r/m in離心5 m in，取上清液2.5 m L，加入蒸餾水2.5 m L，0.1%三氯化鐵0.5 m L，搖勻，靜置反應(yīng)10m in后，于700 nm處測吸光值。A700nm值越大，代表還原能力越強。

1.3.6 模擬胃腸道環(huán)境對胞外多糖抗氧化活性的影響

5.0 g/L的N aC l溶液1 000 m L，加入10 g胃蛋白酶，采用濃HC l調(diào)節(jié)pH至1.3，即為人工模擬胃液[4]。5.0 g/L的N aC l溶液1 000 m L，加入10 g胰蛋白酶、1.5 g膽鹽及1.5 gα-淀粉酶，用0.1 m o l/L的N aOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，即為人工模擬腸液[4]。

取1.3.5中抗氧化性最好的胞外多糖組分，配制成0.04mg/m L的溶液，分別與上述模擬胃腸液在37℃作用一定時間，每隔1 h取樣一次，測定其抗氧化性指標。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖的提取純化

采用上述優(yōu)化方法提取植物乳桿菌的胞外多糖，多糖得率為0.279 m g/m L。對提取的粗多糖采用DEAE Cellulose DE-52和Sephadex G-200色譜柱進行分離，結(jié)果見圖1-圖4。

圖1 DEAECellulose DE-52柱純化雙蒸水洗脫曲線

圖2 DEAECellulose DE-52柱純化NaCl洗脫曲線

圖3 中性多糖Sephadex G-200色譜柱洗脫曲線

圖4 酸性多糖ephadex G-200色譜柱洗脫曲線

由圖1可知，在DEAE-52分離柱中，利用雙蒸水洗脫得到一種中性多糖組分，出現(xiàn)在第1-6管，得率為14.62%。將此中性多糖采用SephadexG-200繼續(xù)分離，如圖3所示，依然得到一個組分，但峰型對稱性并不好，有拖尾現(xiàn)象，提示可能并非是單一組分的糖。收集G-200分離后7-10管洗脫液，透析過夜，冷凍干燥即為純化的中性多糖，命名為EPS-1。

對DEAE Cellulose DE-52色譜柱利用0.1m oL/L的N aC l溶液洗脫，如圖2所示，得到兩種酸性多糖組分，分別出現(xiàn)在1-4管及8-10管。收集含量較高的酸性多糖組分（1-4管），得率為4.18%，采用SephadexG-200繼續(xù)分離，如圖4所示，得到一個峰值，且峰型對稱性良好，說明得到的酸性多糖純度較高。收集G-200分離后9-11管洗脫液，透析過夜，冷凍干燥即為純化的酸性多糖，命名為EPS-2。

將純化所得EPS-1與EPS-2在200～400 nm處進行紫外掃描，如圖5、圖6所示。在260 nm、280 nm、320 nm波長處均未見吸收峰，表明純化后的胞外多糖中不含蛋白質(zhì)、核酸和色素等雜質(zhì)。

圖5 中性多糖紫外掃描

圖6 酸性多糖紫外掃描

2.2 胞外多糖的相對分子質(zhì)量測定

以Ve/V0對相對分子量的對數(shù)lgMW作圖，可獲得標準曲線見圖7。根據(jù)曲線計算回歸方程為：y=-0.54x+5.64，R2=0.9918。將中性多糖EPS-1與酸性多糖EPS-2以同樣條件上樣和洗脫，測得EPS-1洗脫體積為30 m L，EPS-2洗脫體積為25m L，根據(jù)上式計算可得EPS-1相對分子質(zhì)量為1.26×105，EPS-2相對分子質(zhì)量為6.76×104。

2.3 各組分胞外多糖體外抗氧化性研究

對純化的中性多糖EPS-1、酸性多糖EPS-2及未純化的胞外粗多糖進行自由基清除能力及還原能力測定，結(jié)果如圖8～圖11所示。分析可知，第一，隨著濃度增高，三種多糖對各自由基的清除能力及還原能力均呈上升趨勢，在0.02～0.1 m g/m L范圍內(nèi)，濃度與抗氧化性正相關(guān)，其中濃度對·OH的清除能力影響最明顯。研究表明，胞外多糖清除·OH是通過多糖提供氫原子，與·OH結(jié)合生成水而實現(xiàn)[4]，故清除能力強弱與多糖濃度相關(guān)性大。

圖7 多糖相對分子質(zhì)量標準曲線

圖8 多糖組分對羥自由基清除能力測定

圖9 多糖組分對超氧陰離子自由基清除能力測定

圖10 多糖組分對DPPH自由基清除能力測定

圖11 多糖組分還原能力測定

第二，對于三種自由基的清除能力以及還原能力，酸性多糖EPS-2均表現(xiàn)出最強，而粗多糖均表現(xiàn)出最弱。已有多項研究表明，乳酸菌的胞外多糖，其酸性多糖較中性多糖具有更高抗氧化活性[5]，本研究得到結(jié)果與之一致。分析其原因可能與多糖所含糖醛酸數(shù)量相關(guān)，酸性多糖含有更多的糖醛酸組分，使得分子帶有更多的負電荷，使分子形態(tài)伸展，降低了自由基攻擊分子時的空間位阻，進而加快自由基的猝滅[4]，后續(xù)需進一步對該酸性多糖進行結(jié)構(gòu)鑒定以確證。粗多糖因為未經(jīng)純化，含有較多雜質(zhì)，阻礙了其抗氧化活性的發(fā)揮。故選擇酸性多糖EPS-2進行后續(xù)模擬胃腸道的研究。

第三，對于體外抗氧化指標的選擇性，三種多糖表現(xiàn)出一致性，即對O2-·及DPPH·清除能力最強，最低值即達到94%以上，最高可達98.94%；對·OH的清除能力屬于中等，與多糖濃度關(guān)系較大；而還原能力表現(xiàn)最弱。已有研究表明，DPPH·是一類較為穩(wěn)定的自由基，若能將其清除，則表明受試物質(zhì)具有較強的自由基清除能力，可清除其它自由基如過氧化氫、烷自由基等[4]。本研究中，三種多糖對DPPH·的清除率都可達到90%以上，較目前報道的一些乳酸菌菌株的胞外多糖[6-7]，自由基清除能力更強。還原能力是評價抗氧化性的另一個重要指標，本研究表明，該植物乳桿菌的胞外多糖抗氧化活性主要通過清除自由基而實現(xiàn)。故在后續(xù)模擬胃腸道研究中，只測定自由基清除的三項指標。

2.4 模擬胃腸道對胞外多糖抗氧化活性的影響

發(fā)酵食品中乳酸菌分泌的胞外多糖，隨食品一起進入人體胃腸道，要使其能在人體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，首先其必須對胃液和腸液有較強耐受性。本研究制備人工胃液及腸液，測定模擬胃腸道環(huán)境對酸性多糖EPS-2抗氧化性的影響。

2.4.1 人工胃液對EPS-2抗氧化性的影響

由圖12可知，酸性多糖EPS-2在人工胃液中作用4 h內(nèi)，其對DPPH·的清除能力保持穩(wěn)定，對·OH及O2-·的清除能力隨著時間延長而有一定的增加，其中對O2-清除活性增加更為顯著。這說明模擬胃液對多糖清除自由基能力具有一定的促進作用。分析其原因，胃液中不含有水解糖類的酶，但是胃液中的酸性環(huán)境會導(dǎo)致多糖分子一定程度的水解，水解后的小分子糖空間位阻小，更容易與自由基反應(yīng)而使之猝滅。有研究表明，多糖經(jīng)水解或輻射后得到的小分子多糖，其抗氧化活性明顯提高[8]。

圖12 人工胃液對EPS-2抗氧化性的影響

2.4.2 人工腸液對EPS-2抗氧化性的影響

由圖13可知，酸性多糖EPS-2在與人工腸液作用5 h內(nèi)，其DPPH·的清除能力保持穩(wěn)定，而對·OH及O2-·的清除能力隨作用時間延長有一定量增加，其中對·OH清除活性增加更為顯著。腸道中含有α-淀粉酶，推測該酶能對該酸性多糖EPS-2產(chǎn)生部分水解，生成一些小分子的多糖，更容易與自由基發(fā)生反應(yīng)，特別是能提供更多的氫原子，與·OH結(jié)合而實現(xiàn)對其的清除。腸道是受氧化損傷較嚴重的部位，由研究可以推測，該酸性多糖可以停留于腸道中，并且在腸道中進行一定分解，從而較好發(fā)揮其抗氧化作用，保護腸道黏膜。

圖13 人工腸液對EPS-2抗氧化性的影響

3 結(jié)論

本研究對一株分離自鲊辣椒的植物乳桿菌進行胞外多糖的提取純化，得到一種中性多糖EPS-1和一種酸性多糖EPS-2，測得其相對分子質(zhì)量分別為1.26×105、6.76×104。

體外抗氧化實驗表明：無論對于·OH、O2-·及DPPH·自由基的清除能力，還是還原能力，酸性多糖EPS-2均表現(xiàn)出最高活性，而粗多糖均表現(xiàn)出最低活性；三種多糖對O2-·及DPPH·清除能力相對較強，對·OH的清除能力中等，而還原能力均較低；隨著三種胞外多糖濃度的增大，其抗氧化性也隨之增加，濃度對·OH的清除活性影響最大。

采用酸性多糖EPS-2進行人工模擬胃腸道實驗，結(jié)果表明，EPS-2對DPPH·的清除能力在人工胃液及人工腸液中均保持穩(wěn)定；對·OH及O2-·的清除能力隨著人工胃液及腸液作用時間延長，均有一定增強。

總體而言，相比已經(jīng)報道的大多數(shù)乳酸菌胞外多糖，該株植物乳桿菌的胞外多糖具有更高的自由基清除能力，且其酸性多糖不被人體消化道所消化，而只在胃腸道有一定降解，形成更多具有較好抗氧化活性的小分子多糖，發(fā)揮其抗氧化作用而保護胃腸道黏膜，具有良好生物學活性。本研究為將此株植物乳桿菌開發(fā)為乳制品及其他發(fā)酵食品的益生菌種奠定了基礎(chǔ)。

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