穿心蓮內(nèi)酯通過下調(diào)PPARγ-C/EBPα抑制脂滴形成*

栗 茜 ，彭 莎 ，候 寧 ，劉 敏 ，李 晶 ，張宇昕 ，張 喬 ，王石峰 ，張燕玲 ，喬延江

穿心蓮內(nèi)酯為爵床科植物穿心蓮[Andrographis panicultata（Burm.f）Nees]中提取得到的二萜內(nèi)酯類化合物，是穿心蓮的主要活性成分之一。穿心蓮內(nèi)酯呈白色方棱形或片狀結(jié)晶，無臭，味苦[1]，在水中的溶解度非常小，易溶于油相，在甲醇中溶解度最高，化學(xué)成分見圖1。穿心蓮味苦，主要具有清熱解毒、涼血消腫等功能[2]。現(xiàn)代研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有解熱、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)機體免疫力、抗心肌缺血、保肝利膽和調(diào)節(jié)血糖等作用[3]。然而，穿心蓮調(diào)控脂代謝的活性物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機制并不明確。

肥胖形成的原因包括脂肪細胞數(shù)目增加和體積增大，前脂肪細胞增殖、分化和凋亡影響脂肪細胞數(shù)量，其體積主要取決于脂質(zhì)形成和脂質(zhì)水解的平衡[4]。脂肪堆積被認(rèn)為是肥胖發(fā)展的關(guān)鍵誘因，控制脂肪細胞分化和脂滴堆積能有效控制肥胖[5]。前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化受一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，它們控制著成熟脂肪細胞表型的各種蛋白表達[6]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）基因?qū)儆诤耸荏w超家族成員基因，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能啟動脂肪細胞分化[7]。CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族成員之一，在脂肪細胞分化和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，可激活眾多脂肪細胞分化及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達，促進脂滴的形成[8-9]。PPARγ和C/EBPα是脂肪細胞分化和生成的關(guān)鍵標(biāo)志物，共同調(diào)節(jié)脂肪細胞分化過程[10]。C/EBPβ、C/EBPα 和 PPARγ 參與脂肪形成過程中的級聯(lián)[11]，而C/EBPβ并不直接調(diào)節(jié)C/EBPα的表達，需要PPARγ參與[12]。通過對脂滴形成的各個階段進行干預(yù)和調(diào)控，能有效控制脂肪細胞數(shù)量和體積。本研究基于3T3-L1脂肪模型，采用高內(nèi)涵技術(shù)檢測脂肪細胞分化和脂滴形成，探討穿心蓮內(nèi)酯抑制脂肪細胞堆積的生物活性和分子作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑耗材 穿心蓮內(nèi)酯（CAS No．5508-58-7）購買于江西本草天工科技有限責(zé)任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購買于 Gibco公司；0．05%Trypsin/EDTA購買于Thermo公司；Hoechst 33342、Nile red、Rosiglitazone、IBMX、地塞米松、胰酶、Insulin Anti-rabbit FITC IgG和明膠購買于Sigma公司。Mouse anti-PPARγ來源于 Santa Cruz Biotechnology Inc；Rabbit anti-C/EBPα 來 源 于Epitomics Inc，乙醇購買于北京高華偉業(yè)食品添加劑有限公司，黑壁透明底96孔板購買于Greiner bio-one公司；60 mm細胞培養(yǎng)皿和T25細胞培養(yǎng)皿購買于Nest公司。

1.2 實驗儀器 本研究所使用的實驗儀器如下：ImagXpress Micro XLS（Molecular Devices）；Collomics ArrayScan VTI reader（Thermo Fisher Scientific)；超凈工作臺(上海智誠公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海西域公司；倒置相差顯微鏡（Olympus，Japan）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma）；高速低溫離心機（Eppendorf）。

1.3 3T3-L1細胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細胞購買于美國ATCC公司，細胞傳代至14代以內(nèi)。3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，另加入100U/mL硫酸鏈霉素和100μg/mL盤尼西林。細胞復(fù)蘇次日更換新鮮培養(yǎng)基，每2～3 d進行細胞傳代和換液，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行藥物活性評價。

1.4 脂肪細胞誘導(dǎo)分化及加藥處理 3T3-L1脂肪細胞以3 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)3 d至細胞生長融合時開始誘導(dǎo)分化。分化誘導(dǎo)液組成為：0．5 mmol/L IBMX、1 μg/mL 胰島素、0．25 μmol/L 地塞米松、2 μmol/L羅格列酮。分化第3天，將培養(yǎng)基更換為含1 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)48 h。分化第5天，使用DMEM完全培養(yǎng)基再連續(xù)培養(yǎng)48 h。將穿心蓮內(nèi)酯用二甲基亞砜（DMSO）溶解制備成儲存液，使用時用DMSO溶解成相應(yīng)濃度，使得DMSO終濃度為0．1%（初始濃度稀釋1 000倍）。從細胞誘導(dǎo)分化開始時加入待測藥物，以前脂肪細胞作為空白對照組，誘導(dǎo)分化細胞為陰性對照組。

實驗分為陰性對照組0．1%DMSO處理，陽性對照組加入鹽酸小檗堿（BBR）半數(shù)抑制濃度（IC50）為 1．01 μmol/L，實驗組將穿心蓮內(nèi)酯從濃度為30 μmol/L按照3倍梯度依次稀釋，加入到分化的3T3-L1脂肪細胞?；衔镞B續(xù)作用6 d后，采用高內(nèi)涵熒光成像方法分析脂滴熒光強度及脂滴數(shù)量。為了探討穿心蓮內(nèi)酯改善脂肪沉積的作用機制，以30 μmol/L、10 μmol/L 濃度分別作用于 3T3-L1 脂肪細胞，觀察PPARγ及C/EBPα的表達。

1.5 細胞固定及脂滴熒光染色分析 細胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽（PBS）緩沖液潤洗后，加入預(yù)熱的4%多聚甲醛溶液，在室溫放置20min使細胞被固定。以Nile red（200 μg/mL）作為脂滴的特異性熒光染料，在避光條件下，室溫孵育10 min，標(biāo)記細胞脂滴。棄去脂滴熒光染料，以PBS緩沖液潤洗3次，加入Hoechst 33342溶液，終濃度為10 μg/mL）。在避光條件下，室溫放置15min，標(biāo)記細胞核。棄去Hoechst33342溶液，加入PBS緩沖液潤洗3次。

采用Collomics ArrayScan VTI高內(nèi)涵熒光成像系統(tǒng)采集Hoechst 33342和Nile red熒光信息。采用10×物鏡，每孔掃描9個視野。細胞核信號采集的激發(fā)/發(fā)射波長為386/460 nm；脂滴熒光采用的激發(fā)/發(fā)射波長為488/525 nm。采用Spot Detector分析方法分析脂肪細胞數(shù)量、脂滴數(shù)量和脂滴熒光強度。

1.6 免疫熒光染色 用4%多聚甲醛溶液固定細胞，加入 100 μL 0．1%Toriton-X-100 使細胞通透30 min，結(jié)束后用PBS溶液潤洗3次。使用100 μL濃度為5%BSA溶液將細胞于室溫下孵育1 h，封閉細胞。5%BSA稀釋一抗溶液，50 μL/孔加到96孔板，于4℃環(huán)境過夜。次日，用PBST潤洗細胞3次，每次5 min。用5%BSA稀釋二抗，每孔50 μL，室溫孵育1．5 h，用PBS潤洗3次。避光條件下，采用Hoechst 33342（10 μg/mL）標(biāo)記細胞核，室溫孵育15 min。用PBS潤洗。鏡檢，采集熒光信息。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析 實驗至少重復(fù)3次以上，以0．1%DMSO為陰性對照組，對藥物處理組數(shù)據(jù)進行歸一化分析，數(shù)據(jù)表示方法為：x±SEM，n=3。采用Graphpad（Version5）數(shù)據(jù)分析軟件繪圖。不同處理組之間采用單因素方差檢驗（one-way ANOVA），P＜0．05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯抑制脂滴堆積作用 在30 μmol/L時，可觀察到視野內(nèi)脂滴數(shù)量顯著減少，濃度降低時抑制作用減弱（圖2a）。脂滴熒光強度分析顯示，30 μmol/L對脂滴的抑制率達到90%以上（圖2b），隨著濃度降低，抑制作用迅速減弱，3 μmol/L內(nèi)基本無明顯抑制作用。細胞數(shù)量分析顯示，穿心蓮內(nèi)酯在30 μmol/L時輕微降低脂肪細胞數(shù)量（圖2c），表明穿心蓮內(nèi)酯可抑制脂肪細胞分化和早期有絲分裂。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯劑量依賴降低3T3-L1脂肪細胞脂滴堆積Fig.2 Andrographolide dose-dependently decreased lipid droplet deposition in 3T3-L1 adipocytes

2.2 穿心蓮內(nèi)酯對3T3-L1脂肪細胞PPARγ表達的調(diào)節(jié)作用 為了探討穿心蓮內(nèi)酯改善脂肪沉積的作用機制，以30 μmol/L和10 μmol/L濃度分別作用于3T3-L1脂肪細胞，觀察PPARγ的表達。結(jié)果顯示，脂肪細胞誘導(dǎo)后PPARγ表達明顯增高，表明模型誘導(dǎo)成功（圖3a）。30 μmol/L時穿心蓮內(nèi)酯顯著降低PPARγ的陽性率（P＜0．01），由60%降低至20%；10 μmol/L時輕微降低PPARγ陽性率，但與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）（圖 3b）。熒光強度分析結(jié)果顯示，10 μmol/L與30 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯均能顯著降低PPARγ熒光強度，與陰性對照組比較均有顯著差異（P＜0．01）（圖 3c）。在所分析的濃度范圍內(nèi)，穿心蓮內(nèi)酯處理組的細胞數(shù)量與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）（圖 3d）。該研究表明，穿心蓮內(nèi)酯可以抑制PPARγ介導(dǎo)的細胞分化作用。

2.3 穿心蓮內(nèi)酯對3T3-L1細胞C/EBPα表達的調(diào)節(jié)作用 以30 μmol/L和10 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯分別作用于3T3-L1脂肪細胞，觀察C/EBPα表達。結(jié)果顯示，脂肪細胞誘導(dǎo)后C/EBPα表達明顯增高，表明模型誘導(dǎo)成功（圖4a）。30 μmol/L時穿心蓮內(nèi)酯顯著降低C/EBPα的陽性率，由40%降低至10%（P＜0．01）；10 μmol/L 時輕微降低 C/EBPα 陽性率，但與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（如圖4b）。熒光強度分析結(jié)果顯示，30 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯能顯著降低C/EBPα 表達的熒光強度（P＜0．01），10 μmol/L 時與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4c）。在所分析的濃度范圍內(nèi)，穿心蓮內(nèi)酯處理組的細胞數(shù)量與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4d）。該研究表明，穿心蓮內(nèi)酯可以抑制C/EBPα介導(dǎo)的細胞分化作用。

3 討論

圖3 穿心蓮內(nèi)酯對3T3-L1細胞PPARγ表達的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Effect of andrographolide on regulating PPARγ expression in 3T3-L1 adipocytes

圖4 穿心蓮內(nèi)酯對3T3-L1細胞C/EBPα表達的調(diào)節(jié)作用Fig.4 Effect of andrographolide on regulating C/EBPα expression in 3T3-L1 adipocytes

本研究確認(rèn)了穿心蓮內(nèi)酯抑制PPARγ-C/EBPα通路介導(dǎo)的脂肪細胞分化和抑制脂滴堆積活性，并觀察到穿心蓮內(nèi)酯顯著降低PPARγ和C/EBPα表達。Jin等[13]數(shù)據(jù)顯示穿心蓮內(nèi)酯主要抑制脂肪分化的早期階段，可能是通過調(diào)節(jié)PPARγ的表達，與本文的結(jié)果相符。Lefterova MI等[14]研究表明，PPARγ和C/EBPα已經(jīng)成為脂肪形成的主要調(diào)節(jié)劑，最近的全基因組研究表明其轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)中存在廣泛的重疊。Chen等[15]研究表明，穿心蓮內(nèi)酯與消耗細胞內(nèi)的谷膀氨肽（GPX1和GSH）有關(guān)，導(dǎo)致細胞內(nèi)的ROS累積，從而抑制脂肪細胞分化。此外，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）依賴的C/EBPβ也參與穿心蓮內(nèi)酯對脂肪細胞分化的抑制作用[16]。GSK-3β和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是脂肪細胞中調(diào)控脂肪細胞分化和脂生成的關(guān)鍵蛋白，通過上調(diào)TR4孤兒核受體表達作用[17]，而TR4可以促進游離脂肪酸的合成。馮麗娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以誘導(dǎo)3T3-L1細胞程序性死亡，可見高濃度時穿心蓮內(nèi)酯可能誘導(dǎo)細胞毒性作用，應(yīng)合理的控制使用劑量。

研究發(fā)現(xiàn)超重或肥胖可能增加多種疾病風(fēng)險，包括乳腺癌、冠心病、2型糖尿病、膽囊疾病、骨關(guān)節(jié)疾病、結(jié)腸癌、高血壓等病[19]。脂代謝綜合癥的發(fā)生也會引起機體內(nèi)的慢性炎癥，造成身體功能紊亂[20]。本研究顯示穿心蓮內(nèi)酯通過阻斷PPARγ-C/EBPα表達，抑制脂肪細胞分化，降低脂滴堆積，并確認(rèn)了其活性濃度范圍。本文的研究結(jié)果為天然植物功能因子干預(yù)肥胖的功效及作用機制的研究提供了一種思路和方法，為穿心蓮內(nèi)酯減肥降脂的應(yīng)用提供了前期的研究基礎(chǔ)，并揭示了其分子作用機制，為改善肥胖相關(guān)代謝疾病提供一種潛在的治療策略。此外，在體內(nèi)水平穿心蓮內(nèi)酯對肥胖的干預(yù)作用尚有待于進一步研究。

[1] 馬長沙，段成軍，馬靜潔，等.穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物藥理活性研究[J].吉林中醫(yī)藥，2014，34(1):77-81.

[2] 陳伶俐，王振華.穿心蓮內(nèi)酯基本理化性質(zhì)考察[J].今日藥學(xué)，2010，20(1):41-43．

[3] 呂巧莉，涂國剛，王嘉琦，等．穿心蓮內(nèi)酯的研究進展及臨床應(yīng)用[J]．南昌大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2013，58(1):83-86．

[4] Cristancho AG，Lazar MA．Forming functional fat:a growing understanding of adipocyte differentiation[J]．Nature Reviews Molecular Cell Biology，2011，12(11):722．

[5] Rosen ED，Spiegelman BM．Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis[J]．Nature,2006，444(7121):847-53．

[6] 黃家鑫．C/EBPβ在脂肪細胞分化過程中對自噬的調(diào)控及SCO1在肥胖相關(guān)代謝性疾病中的機制研究[D]．上海:上海復(fù)旦大學(xué)，2014．

[7] 蔣金航，馬 云，王新莊，等．PPARγ基因調(diào)控脂肪細胞分化的研究進展[J]．中國畜牧雜志，2014，62(9):91-95．

[8] Ohlsson E，Hasemann MS，Willer A，et al．Initiation of MLL-rearranged AML is dependent on C/EBPα [J]．Journal of Experimental Medicine，2014，211(1):5-13．

[9] Wang H，Zan LS，Wang HB，et al．Cloning，expression analysis and sequence prediction of the CCAAT/enhancer binding，protein alpha gene of Qinchuan cattle[J]．Genetics&Molecular Research Gmr，2012，11(2):1651．

[10]Auwerx J，Cock TA，Knouff C．PPAR-gamma:a thrifty transcription factor[J]．Nuclear Receptor Signaling，2002，1(1):e006．

[11]Tang QQ，Zhang JW，Daniel LM．Sequential gene promoter interactions of C/EBPbeta，C/EBPalpha，and PPARgamma during adipogenesis[J]．Biochemical&Biophysical Research Communications，2004，318(1):213-218．

[12]Zuo Y，Qiang L，F(xiàn)armer SR．Activation of CCAAT/enhancerbinding protein (C/EBP)alpha expression by C/EBP beta during adipogenesis requires a peroxisome proliferator-activated receptorgamma-associated repression of HDAC1 at the C/ebp alpha gene promoter[J]．Journal of Biological Chemistry，2006，281(12):7960-7967．

[13]Jin L，F(xiàn)ang W，Bo L，et al．Inhibitory effect of Andrographolide in 3T3-L1 adipocytes differentiation through the PPARγ pathway[J]．Molecular&Cellular Endocrinology，2012，358(1):81-87．

[14]Lefterova MI，Lazar MA．New developments in adipogenesis[J]．Trends in Endocrinology&Metabolism，2009，20(3):107-114．

[15]Chen W，Su H，F(xiàn)eng L，etal． Andrographolide suppresses preadipocytes proliferation through glutathione antioxidant systems abrogation[J]．Life Sciences，2016(156):21．

[16]Chen CC，Chuang WT，Lin AH，et al．Andrographolide inhibits adipogenesis of 3T3-L1 cells by suppressing C/EBPβ expression and activation[J]．Toxicology&Applied Pharmacology，2016(307):115．

[17]Park SS，Choi H，Kim SJ，et al．CREB/GSK-3β signaling pathway regulates the expression of TR4 orphan nuclear receptor gene[J]．Molecular&Cellular Endocrinology，2016(423):22-29．

[18]馮麗娜．穿心蓮內(nèi)酯對肥胖的干預(yù)作用及其機制研究[D]．杭州：浙江工商大學(xué)，2014．

[19]鄒大進．肥胖是一種疾病[J]．科學(xué)世界，2014,16(8):1．

[20]Hotamisligil GS．Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease．[J]．Cell，2010，140(6):900-917．