替羅非班對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1表達(dá)的影響

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研究顯示，炎癥免疫在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，炎癥因子貫穿動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展乃至斑塊破裂的全過程[1-2]。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是AS形成中的一個重要因子，血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(LOX-1)是主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞上的ox-LDL特異受體。體內(nèi)LDL 在氧化應(yīng)激作用下形成ox-LDL，ox-LDL比低密度脂蛋白(LDL)有更強(qiáng)的毒性作用，與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體LOX-1 特異性結(jié)合后，引起內(nèi)皮功能失調(diào)和損傷，進(jìn)一步刺激平滑肌細(xì)胞增殖。LOX-1的激活與內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡有關(guān)，此過程是促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定和發(fā)生為急性冠脈綜合征的重要機(jī)制[3]。LOX-1 還是一種炎性因子，能刺激血小板等釋放黏附分子、趨化因子等，使平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等大量吞噬ox-LDL而形成泡沫細(xì)胞沉積在血管內(nèi)壁，同時觸發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，參與高血壓、血栓和AS 等的形成。Li等[4]觀察冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAECs)發(fā)現(xiàn)，在HCAECs上有LOX-1持續(xù)表達(dá)；將HCAECs和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)一起孵育，LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加。同時，AngⅡ促使HCAECs加速攝取I125標(biāo)記的ox-LDL，導(dǎo)致ox-LDL介導(dǎo)的細(xì)胞損害。替非羅班是抗血小板聚集的藥物，國外已有體外實驗證明，替羅非班能夠減少冠心病臨床事件及心血管病死亡，且所獲得的益處與抑制血小板聚集作用無關(guān)，提示這可能與改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊等作用有關(guān)[5]。本研究旨在體外觀察替羅非班對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1的表達(dá)是否存在抑制作用，進(jìn)一步分析替羅非班抗動脈硬化和抑制免疫炎癥的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康新生兒臍帶，邯鄲市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科提供；PDTC(美國Sigma公司)；兔抗人LOX-1多克隆抗體(美國Santa Cruz)；FITC-羊抗兔二抗(美國Santa Cruz)；兔抗人Ⅷ因子一抗(美國Santa Cruz)；SP免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑RPMI1640培養(yǎng)基、無脂蛋白血清、胰蛋白酶、 Trizol試劑為Gibco公司產(chǎn)品；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒及引物購自大連寶生物有限公司；PCR Marker由上海申工生物公司合成；焦磷酸二乙酯(DEPC)、瓊脂糖購自美國Sigma公司；替羅非班(欣維寧，武漢遠(yuǎn)大制藥)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌操作下取分娩4 h健康新生兒臍帶，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗干凈，以0.1%Ⅱ型膠原酶37 ℃消化10 min，終止消化后收集消化液，1 000 r/min離心8 min，棄上清液，加入RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)亞融合狀態(tài)時，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代。選擇生長良好的第2代～第5代細(xì)胞用于實驗。采用形態(tài)學(xué)及抗Ⅷ因子抗體免疫熒光染色行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定(熒光免疫組化方法)。具體方法如下：培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞融合成鋪路石狀單層時，將細(xì)胞消化下來，接種入預(yù)先用4%多聚賴氨酸浸泡后并經(jīng)無菌處理的蓋玻片上，置入6孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片，種板密度為1×105/mL，待細(xì)胞生長至適宜密度時，終止培養(yǎng)。

1.2.2 氧化低密度脂蛋白的準(zhǔn)備 低密度脂蛋白的分離是以單個不連續(xù)密度梯度 50 000 r/min超速離心而進(jìn)行的快速分離，低密度脂蛋白加入含10 μmol/L硫酸銅的磷酸鹽緩沖液氧化修飾24 h，在準(zhǔn)備后15 d內(nèi)進(jìn)行實驗。

1.2.3 實驗分組及方法 共分為3組。對照組：培養(yǎng)液不加干擾因素；ox-LDL組：ox-LDL 80 mg/L加入培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞中孵育12 h；ox-LDL+替羅非班組先加入ox-LDL(80 mg/L)孵育12 h，后加入固定濃度的替羅非班(替羅非班用量根據(jù)體重計算)分別作用12 h、24 h、36 h。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測定LOX-1mRNA表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，將RNA在-70 ℃保存待測[6]，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，紫外凝膠圖像分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以目的基因mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物的光密度值與內(nèi)參照GAPDHmRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物光密度值的比值作為mRNA表達(dá)的相對值。LOX-1及內(nèi)參GADPH的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 流式細(xì)胞儀間接免疫熒光法檢測LOX 采用流式細(xì)胞儀(EPICS-XL，美國Cuter公司)間接免疫熒光法檢測：接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板；37 ℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，從孵育箱內(nèi)取出細(xì)胞培養(yǎng)板；用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液；收集到離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min后，棄去上清液；1×PBS-BSA(0.1%BSA)緩沖液洗2次，加入1∶100兔抗人LOX-1抗體，4 ℃孵育 1 h，然后以1×PBS-BSA(0.1%BSA)緩沖液洗1次，除去未結(jié)合的一抗；加入標(biāo)記熒光素的羊抗兔IgG，工作濃度1∶100，4 ℃避光孵育1 h，1×PBS-BSA(0.1%BSA)緩沖液洗2次，加入PBS重懸細(xì)胞；使用流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)量變化，以標(biāo)記抗體呈陽性的細(xì)胞百分率作為表達(dá)LOX-1蛋白的計量標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 替羅非班對HUVECs LOX-1mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，ox-LDL組LOX-1mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；替羅非班抑制HUVECs LOX-1 mRNA的表達(dá)作用呈時間依賴性。與ox-LDL組比較，應(yīng)用替羅非班后12 h、24 h、36 h LOX-1mRNA表達(dá)降低了8%、64%和73%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1和表2。

1為對照組；2為ox-LDL組；3為替羅非班12 h組；4為替羅非班24 h組；5為替羅非班36 h組。

圖1 HUVECs細(xì)胞LOX-1mRNA表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄--聚合酶鏈反應(yīng)電泳圖

表2 替羅非班對HUVECs LOX-1mRNA表達(dá)的影響(±s)

2.2 替羅非班對HUVECs LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)的影響 與對照組比較，ox-LDL組HUVECs LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；固定濃度的替羅非班作用后HUVECs LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)量隨替羅非班的作用時間延長而減低，其作用呈時間依賴性。詳見表3。

表3 替羅非班對HUVECs LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)的影響(±s)

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是全身血管內(nèi)膜的屏障結(jié)構(gòu)，而且是一個重要的內(nèi)分泌器官，具有多方面的生理功能，主要為調(diào)節(jié)血管張力，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞在血管壁的黏附聚集，抑制血小板的過度激活和聚集，維持凝血和纖溶系統(tǒng)的活性平衡。盡管AS的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，但目前公認(rèn)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能障礙是AS發(fā)生的始動因素和中心環(huán)節(jié)。

ox-LDL是AS形成中的一個重要因子，ox- LDL 引起血管壁脂質(zhì)堆積、炎性變化和細(xì)胞凋亡。近年發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)血凝素樣LOX-1[7]，它可特異性地結(jié)合ox-LDL，并誘導(dǎo)單核巨噬泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)運到血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞，因此LOX-1可能在AS早期病理變化中起著關(guān)鍵作用。LOX-1屬于二型膜蛋白，在其氨基酸序列的N 端有一條短的胞漿尾鏈，而在其C 端有一條長的細(xì)胞外區(qū)域，因此，其結(jié)構(gòu)屬于C 類血凝素家族。小牛LOX- 1 的分子量接近50 kD，而人類的則接近40 kD。LOX- 1 與其他已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ox- LDL受體，包括A 類和B類清道夫受體以及CD68 都沒有任何結(jié)構(gòu)上的同源性[8]。通過克隆在人類內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的乙酰化LDL的清道夫受體，發(fā)現(xiàn)它也可以攝取ox-LDL，而LOX- 1只能與ox-LDL結(jié)合而不能與乙?；腖DL結(jié)合[9]。

LOX-1 不僅是ox-LDL的受體，同時也是一種細(xì)胞黏附分子，與激活的血小板和嗜中性細(xì)胞結(jié)合后，可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮素-1，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂，促進(jìn)AS進(jìn)程[10]。因此，LOX-1不僅通過結(jié)合ox-LDL，而且通過結(jié)合血小板和嗜中性白細(xì)胞來啟動和促進(jìn)AS 的進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL組HUVECs LOX-1表達(dá)顯著升高(P<0.05)，替非羅班可明顯抑制HUVECs LOX-1的表達(dá)，與對照組比較，應(yīng)用替羅非班后12 h、24 h、36 h LOX-1mRNA的表達(dá)降低了8%、64%和73%，呈時間依賴性。流式細(xì)胞術(shù)表明，替羅非班作用后HUVECs LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)量隨替羅非班的作用時間延長而減低，變化趨勢同LOX-1mRNA水平一致，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過實驗還發(fā)現(xiàn)，替羅非班作用后24 h與36 h后LOX-1表達(dá)下降最明顯。這表明，替羅非班作用的理想時間點在24 h～36 h。同時還發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)檢測LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)的下降較基因水平低，提示目前已經(jīng)分離出幾類不同的ox-LDL受體[11]，包括A類和B 類清道夫受體以及CD68，在細(xì)胞水平檢測受到相應(yīng)限制，導(dǎo)致LOX-1陽性細(xì)胞數(shù)的下降幅度降低。

LOX-1與其配體間的相互作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，對AS的發(fā)生發(fā)展及一些并發(fā)癥的產(chǎn)生有重要意義。替非羅班可明顯抑制HUVECs LOX-1的表達(dá)， 因此能抑制細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、黏附分子如E選擇素，單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等的激活，從而阻斷與炎癥有關(guān)的血管損傷，這為臨床治療心血管疾病提供了新的思路。

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