魚油對(duì)KKAy糖尿病小鼠糖代謝及PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

胡名媛，王 鋒，馬永建,2，孫桂菊,*

（1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009）

糖尿病已成為當(dāng)前威脅全球人類健康最重要的慢性非傳染性疾病之一，并在世界范圍內(nèi)呈流行趨勢(shì)[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，至2016年12月，全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)4.25億 人[2]。我國糖尿病患病率近幾年增長迅速。從1994年的2.5%[3]、2002年的2.7%[4]，增加至2013年的10.9%[5]，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者人數(shù)約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%～95%[6]。日益增長的糖尿病患病率給社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]，因此積極控制和治療T2DM具有極其重要的意義。

1978年Dyerberg等[8]發(fā)表流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)生活在格陵蘭島的愛斯基摩人攝入大量的海洋脂類物質(zhì)，但冠心病、心肌梗塞、血栓病等疾病發(fā)病率卻很低，自此關(guān)于ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA）的研究迅速發(fā)展，并成為目前T2DM營養(yǎng)干預(yù)研究的熱點(diǎn)。ω-3 PUFA主要包括α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic，DHA）。ALA在植物種子中含量豐富，EPA和DHA在魚類和貝殼類動(dòng)物中含量豐富。T2DM的病理生理機(jī)制主要包括胰島素分泌不足與胰島素抵抗（insulin resistance，IR），其中IR被認(rèn)為可能是T2DM發(fā)生的始動(dòng)因素[9]。而胰島素信號(hào)通路（磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路）在T2DM的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及IR有著密切的聯(lián)系[10]。本研究旨在對(duì)EPA、DHA含量豐富的魚油對(duì)糖代謝和PI3K/Akt胰島素信號(hào)通路的影響進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

40 只KKAy雄性小鼠，SPF級(jí)，8 周齡；10 只C57BL/6雄性小鼠，SPF級(jí)，8 周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2013-0037）。

實(shí)驗(yàn)用魚油由湯臣倍健公司按課題組要求生產(chǎn)（深海魚油膠囊，每粒1 g，含25.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）EPA和36.4% DHA）。

胰島素試劑盒、脂聯(lián)素試劑盒、瘦素試劑盒南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑 美國Thermo Fisher Scientific公司；Revertra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix試劑盒TOYOBO生物工程有限公司；胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）、PI3K、Akt、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）及內(nèi)參β-actin引物上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DxC800型全自動(dòng)生化分析儀 美國Beckman公司；ME203E型天平 上海梅特勒-托利多有限公司；酶標(biāo)儀美國BioTek Epoch公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5424R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀 德國Eppendorf 公司；全自動(dòng)樣品快速研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Step One Plus型熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組處理

設(shè)10 只C57BL/6小鼠為正常對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)。KKAy小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后給予高脂飼料喂養(yǎng)，4 周后斷尾采血，空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）不低于13.9 mmol/L者為T2DM合格模型小鼠。根據(jù)體質(zhì)量和血糖隨機(jī)分為4 組，分別為模型組和魚油低、中、高劑量組，每組10 只，入組時(shí)測(cè)定的血糖值如表1所示。KKAy小鼠給予高脂飼料并自由攝食和飲水，分別按照魚油低（0.67 g/kg）、中（1.33 g/kg）、高（2.00 g/kg）劑量給予灌胃。正常對(duì)照組和模型組給予5‰羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。連續(xù)灌胃12 周，對(duì)小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食量以及反應(yīng)狀態(tài)。12 周結(jié)束后禁食不禁水8 h，摘眼球取血，分離血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈蟮墓趋兰∮?80 ℃保存，以備檢測(cè)基因表達(dá)水平。

表1 入組時(shí)各組小鼠的血糖值Table 1 Blood glucose levels of mice in all groups before experiment

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

禁食8 h后用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖值，用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）濃度。應(yīng)用脂聯(lián)素、瘦素ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中脂聯(lián)素和瘦素的表達(dá)，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。根據(jù)公式（1）計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝臟中IRS-1、PI3K、Akt、GLUT-4 mRNA表達(dá)水平

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，使用TRIzol試劑提取骨骼肌組織中的RNA，利用Revertra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR Master Mix試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，體系為10 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，45 個(gè)循環(huán)，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。分析IRS-1、PI3K、Akt、GLUT-4 mRNA的表達(dá)水平，各基因的引物序列見表2。ΔΔCt＝（實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值）-（對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值），2–ΔΔCt可反映實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組基因表達(dá)的差異（倍數(shù)）。

表2 PCR引物序列及產(chǎn)物長度Table 2 PCR Primer sequences and product lengths

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用ˉx表示，結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較用最小顯著性差異法-t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 KKAy小鼠的狀態(tài)

表3 各組小鼠的體質(zhì)量Table 3 Body mass of mice in all groupsg

實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組小鼠一般狀態(tài)良好，毛色有光澤，飲食進(jìn)水量正常，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，無死亡。模型組小鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿等現(xiàn)象，對(duì)外界刺激不靈敏。魚油灌胃組小鼠的精神狀態(tài)有所改善。如表3所示，對(duì)實(shí)驗(yàn)期小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，與正常對(duì)照組相比，模型組和魚油各劑量組的小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)期魚油低、中、高劑量組的小鼠體質(zhì)量均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 魚油對(duì)KKAy小鼠血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)的影響

表4 各組小鼠的血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平Table 4 Blood glucose, insulin and HOMA-IR levels of mice in all groups

如表4所示，與正常對(duì)照組相比，模型組和魚油低、中、高劑量組的血糖值明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，魚油低劑量組血糖值極顯著降低（P＜0.01）；魚油中、高劑量組血糖值下降不明顯（P＞0.05）。與模型組相比，魚油低、中劑量組胰島素水平提高（P＜0.05，P＜0.01），魚油高劑量組胰島素水平升高不明顯。與正常對(duì)照組相比，模型組和魚油各劑量組的胰島素抵抗指數(shù)上升（P＜0.01），與模型組相比，魚油低劑量組的胰島素抵抗指數(shù)下降的趨勢(shì)較明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 魚油對(duì)KKAy小鼠脂肪細(xì)胞因子的影響

表5 各組小鼠的脂聯(lián)素和瘦素質(zhì)量濃度Table 5 Adiponection and leptin levels of mice in all groups

如表5所示，與正常對(duì)照組相比，模型組脂聯(lián)素質(zhì)量濃度有降低的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組相比，魚油低劑量組的脂聯(lián)素質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01），魚油中、高劑量組的脂聯(lián)素質(zhì)量濃度也有升高但差異不顯著（P＜0.05）。與正常對(duì)照組和模型組相比，魚油低、中、高劑量組的瘦素質(zhì)量濃度均無顯著性差異。與模型組相比，魚油低、中、高劑量組均可提高小鼠的脂聯(lián)素質(zhì)量濃度，其中魚油低劑量組提高脂聯(lián)素質(zhì)量濃度的作用更加明顯。

2.4 魚油對(duì)KKAy小鼠骨骼肌組織PI3K/Akt通路中相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

表6 各組小鼠骨骼肌相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平Table 6IRS-1, PI3K, Akt,GLUT-4 mRNA expression levels in skeletal muscle of mice in all groups

如表6所示，與正常對(duì)照組相比，模型組的IRS-1、PI3K、Akt基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05），GLUT-4基因表達(dá)有下降的趨勢(shì)但無顯著性差異。與模型組相比：魚油低、中劑量組IRS-1 mRNA表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05）；魚油高劑量組IRS-1 mRNA表達(dá)水平極顯著提高（P＜0.01）；魚油低、中、高劑量組的PI3K mRNA表達(dá)水平均極顯著提高（P＜0.01）；魚油低、中、高劑量組的Akt mRNA表達(dá)有上升的趨勢(shì)，但是差異無統(tǒng)計(jì)意義，其中魚油低劑量組的Akt mRNA表達(dá)上升趨勢(shì)更加明顯；魚油低劑量組GLUT-4 mRNA表達(dá)水平極顯著提高（P＜0.01）；魚油中、高劑量組GLUT-4 mRNA表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05）。

3 討 論

本研究選用KKAy小鼠模型，KKAy小鼠是在KK小鼠的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入突變毛色基因（Ay）而形成的，其Ay基因不僅影響小鼠毛色，而且還可引起代謝紊亂，并出現(xiàn)肥胖、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂和高胰島素血癥等代謝異常綜合征，故其發(fā)病是在遺傳易感的基礎(chǔ)上加上環(huán)境因素而誘發(fā)的[11-12]，因此這種動(dòng)物模型是廣泛應(yīng)用于研究IR及與IR相關(guān)的抗糖尿病藥物的較好模型。C57BL/6J小鼠呈黑色，因與KK小鼠具有基因同源性而作為正常對(duì)照組[13]。

魚油富含ω-3 PUFA[14]，是EPA和DHA的主要來源。Arai等[15]發(fā)現(xiàn)魚油能降低小鼠的血糖，減少脂肪滴，改善肝肥大和IR。中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)也指出，要強(qiáng)化包括飲食干預(yù)在內(nèi)的生活方式干預(yù)來預(yù)防T2DM的發(fā)生和發(fā)展，并建議T2DM患者適當(dāng)提高多不飽和脂肪酸的攝入，特別是ω-3 PUFA[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，魚油低劑量組能夠顯著降低KKAy糖尿病小鼠的血糖值，其胰島素抵抗指數(shù)也有下降的趨勢(shì)。

IR是T2DM的主要發(fā)病機(jī)制，表現(xiàn)為糖、脂代謝的紊亂[16-17]。脂肪組織是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官，它所分泌的多種脂肪細(xì)胞因子與IR相關(guān)，如脂聯(lián)素、瘦素[18-19]。脂聯(lián)素被認(rèn)為是最重要的脂肪細(xì)胞因子，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎癥、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)糖脂代謝及改善IR等作用[20-22]。生理?xiàng)l件下瘦素與胰島素存在著一種雙向的反饋環(huán)，一旦平衡被破壞，胰島素對(duì)瘦素的敏感性降低，即可導(dǎo)致IR[23]。本研究結(jié)果顯示，魚油灌胃組與模型組相比，脂聯(lián)素質(zhì)量濃度明顯升高（P＜0.05），其中魚油低劑量組脂聯(lián)素質(zhì)量濃度極顯著提高（P＜0.01）。各組之間的瘦素質(zhì)量濃度無顯著差異，可能與瘦素本身對(duì)IR的作用機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。魚油低劑量組脂聯(lián)素質(zhì)量濃度的顯著提高可能和魚油低劑量組胰島素抵抗水平降低有關(guān)，但本研究未能深入探討這兩者之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在偏差，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

骨骼肌是胰島素作用的主要靶器官，是糖代謝發(fā)生的重要場(chǎng)所，更是IR形成的主要部位。目前的研究證實(shí)，胰島素受體活性及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的變化是影響胰島素敏感性最重要的因素，這種變化可發(fā)生于所有的胰島素敏感組織如肌肉、脂肪和肝臟。胰島素刺激的葡萄糖攝取約有80%發(fā)生在骨骼肌組織中，因此骨骼肌在機(jī)體葡萄糖的攝取中占有重要地位[24]。胰島素受體后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前尚不十分清楚。IRS是胰島素信號(hào)傳遞的重要介質(zhì)，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中受體后蛋白水平的重要信號(hào)，其中IRS-1廣泛分布于骨骼肌，在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的利用[25]。有研究表明，胰島素的信號(hào)到達(dá)細(xì)胞膜后，通過胰島素受體基因編碼，促使IRS蛋白磷酸化，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游PI3K/Akt信號(hào)系統(tǒng)，PI3K誘導(dǎo)的Akt磷酸化能夠促進(jìn)葡萄糖的吸收（通過GLUT-4轉(zhuǎn)導(dǎo)）以及糖原的合成，進(jìn)而影響血糖的吸收與代謝，升高胰島素敏感性水平[26-27]。Akt是是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要因子[28]，在糖代謝等方面起著調(diào)節(jié)作用。GLUT-4是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白，主要在骨骼肌中表達(dá)，是在胰島素作用下葡萄糖通過細(xì)胞膜所必需的載體。Hu Shiwei等[29]研究發(fā)現(xiàn)從海參中提取的富含EPA的磷脂酰膽堿可以降低大鼠的血糖并顯著提高腓腸肌中IRS-1、PI3K、Akt和GLUT-4的基因表達(dá)。本研究對(duì)KKAy小鼠胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)（IRS-1、PI3K、Akt、GLUT-4）實(shí)施檢測(cè)，探討魚油對(duì)骨骼肌胰島素信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對(duì)照組與魚油各劑量組相比IRS-1、PI3K、Akt、GLUT-4 mRNA表達(dá)水平無明顯差異。與模型組相比，魚油各劑量組IRS-1、PI3K、Akt、GLUT-4 mRNA表達(dá)水平均升高，其中魚油低劑量組Akt mRNA表達(dá)水平上升趨勢(shì)明顯、GLUT-4 mRNA表達(dá)水平顯著升高。結(jié)合血糖和胰島素抵抗指數(shù)的測(cè)定結(jié)果，與模型組相比，魚油低劑量組降低血糖的作用明顯、胰島素抵抗指數(shù)下降趨勢(shì)也較明顯。因此，魚油低劑量組可能是通過調(diào)節(jié)胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt途徑，改善IRS-1、PI3K及Akt的mRNA表達(dá)，從而提高GLUT-4 mRNA的表達(dá)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了小鼠肌肉組織對(duì)葡萄糖的吸收和利用，從而促進(jìn)肌糖原的合成，調(diào)節(jié)血糖平衡。

在早期的人群研究中，有研究發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFA對(duì)T2DM患者有升糖作用，也有少部分研究發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFA對(duì)糖代謝沒有作用[30-31]。出現(xiàn)這樣結(jié)果可能是由于早期的實(shí)驗(yàn)劑量都比較大，多數(shù)集中于4～10 g/d。隨著研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)干預(yù)劑量的合理化調(diào)整，絕大多數(shù)干預(yù)劑量低于4 g/d，干預(yù)劑量的中位數(shù)大約在2.4 g/d[32]。Sarbolouki等[33]的研究結(jié)果表明，每天服用2 g EPA可降低研究對(duì)象的血糖和胰島素抵抗指數(shù)。有關(guān)魚油干預(yù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)魚油0.5 g/kg和1.0 g/kg劑量組可降低T2DM大鼠的血糖[34]，其干預(yù)劑量和本研究魚油低劑量組干預(yù)劑量接近。Yamazaki等[35]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明低劑量膳食補(bǔ)充魚油（1 g/（kg·d））能夠改善糖脂代謝以及胰島素敏感性。Andersen等[36]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充EPA和DHA（0.5 g/（kg·d））8 周后，Wistar大鼠的胰島素敏感性提高。本研究和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，發(fā)現(xiàn)低劑量魚油（0.67 g/kg）對(duì)于KKAy糖尿病小鼠的血糖調(diào)節(jié)作用更好，對(duì)于IR的改善作用也明顯優(yōu)于魚油中、高劑量組。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的魚油低劑量組和上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)置的研究劑量更加接近，研究結(jié)果也較一致，魚油中、高劑量組設(shè)置的干預(yù)劑量可能過高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不太理想。因此，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低劑量魚油對(duì)于糖代謝和IR的改善作用更加顯著，干預(yù)劑量過高對(duì)于T2DM的作用效果不明顯，甚至可能產(chǎn)生不利的影響，但仍需更多的人群和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，經(jīng)魚油干預(yù)后，不同劑量魚油灌胃的作用效果不同。魚油低劑量組降低血糖、提高脂聯(lián)素質(zhì)量濃度、提高骨骼肌PI3K/Akt胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的基因表達(dá)效果更加顯著。因此，綜合考慮所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示低劑量魚油能顯著改善T2DM小鼠糖代謝，其機(jī)制可能與改善胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子水平有關(guān)，但仍需對(duì)通路機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

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