超聲協(xié)同誘導(dǎo)劑對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢致死的作用

陶 瑞，史智佳*，貢 慧，楊 震，劉 夢(mèng)

（中國(guó)肉類(lèi)食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

殺菌是保障食品質(zhì)量安全、延長(zhǎng)貨架期、維護(hù)市場(chǎng)穩(wěn)定的重要手段。21世紀(jì)以來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高，綠色、安全、有效的殺菌工藝成為食品工業(yè)發(fā)展的重要方向之一[1]。根據(jù)作用方式不同，殺菌可以分為化學(xué)殺菌和物理殺菌兩種，化學(xué)殺菌主要采用山梨酸、苯甲酸、亞硝酸鹽等抑菌劑或殺菌劑，雖然效果好，卻容易對(duì)消費(fèi)者造成急性或慢性的潛在危害。物理殺菌又分為熱殺菌和非熱殺菌，前者主要采用65～120 ℃溫度處理殺死細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體，在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛[2-3]，但是過(guò)高的溫度可能會(huì)對(duì)食品品質(zhì)和風(fēng)味造成影響；后者則主要采用輻照、微波、超聲波、高密度二氧化碳等方法使細(xì)胞破裂或蛋白質(zhì)變性，達(dá)到殺菌的目的，具有方便快捷、安全無(wú)污染等特點(diǎn)，是目前食品殺菌的研究重點(diǎn)[4]。

化學(xué)和非熱物理殺菌都可以實(shí)現(xiàn)永久性滅活食品中細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體和繁殖體，但對(duì)抗逆性極強(qiáng)的芽孢則效果較差。芽孢是細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育后期為應(yīng)對(duì)惡劣生存環(huán)境而形成的一種休眠體，具有極強(qiáng)的抗熱（營(yíng)養(yǎng)體的104倍）、抗輻射（營(yíng)養(yǎng)體的103倍）和抗酸堿等能力[5-6]。普通方法無(wú)法完全殺滅芽孢，不利條件消除后其可重新成為營(yíng)養(yǎng)體，這是導(dǎo)致非高溫滅菌食品腐敗的主要原因。因此，如何有效殺滅細(xì)菌芽孢是食品保質(zhì)保鮮的重要課題。已有研究表明，芽孢萌發(fā)后其抗性能力立即消失，可被常規(guī)手段殺滅，因此，促進(jìn)芽孢萌發(fā)，降低抗逆性是目前殺滅芽孢、保障食品安全的有效途徑[7]。超聲作為一種非熱殺菌技術(shù)，具有能耗低、食品品質(zhì)損傷小、綠色友好等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)快速發(fā)展的殺菌技術(shù)之一。它主要是借助超聲過(guò)程中的空化效應(yīng)[8]，使受體某一區(qū)域形成局部負(fù)壓區(qū)，并產(chǎn)生空穴或氣泡，當(dāng)這些空穴或氣泡突然閉合時(shí)產(chǎn)生激波，在局部微小區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生巨大的壓強(qiáng)，導(dǎo)致一系列物理和化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，從而達(dá)到殺菌的目的[9-10]。眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者都證實(shí)了超聲技術(shù)良好的殺菌效果[11-15]，但是將超聲技術(shù)用于芽孢萌發(fā)與殺滅的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，研究超聲和熱處理、化學(xué)誘導(dǎo)劑等對(duì)芽孢萌發(fā)和殺滅的協(xié)同作用，旨在探究非高溫條件下芽孢滅活的新方法，以期降低熱殺菌溫度，減少化學(xué)防腐劑的添加，為食品殺菌工藝的發(fā)展提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（凍干菌種，編號(hào)：20622） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；L-丙氨酸 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；肌苷國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,6-吡啶二羧酸（2,6-pyridinedicarboxylic acid，DPA） 北京伊諾凱科技有限公司；溶菌酶 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；大蒜、生姜精油 天津春發(fā)生物科技有限公司；乳酸鏈球菌素（Nisin） 洛陽(yáng)奇泓生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基（在上述普通胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基中加入一定量的MnCl2，使培養(yǎng)基中Mn2+的質(zhì)量濃度為50 mg/L，調(diào)整pH 7.0～7.2，滅菌，備用）。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-ⅡDN型超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；GI54DWS全自動(dòng)高壓滅菌鍋 美國(guó)致微公司；KBF115恒溫恒濕箱 德國(guó)賓德公司；AB2-6S1型生物安全柜 新加坡藝斯高科技有限公司；Sorvall LYNX 4000高速落地離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌芽孢培養(yǎng)和懸液制備

1.3.2 單一因素對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅作用

將1.3.1節(jié)制備得到的芽孢懸液稀釋到1.0×107CFU/mL，參照文獻(xiàn)[17-19]的方法，按照表1所示的添加水平對(duì)芽孢懸液進(jìn)行處理，探究不同單一因素用于芽孢萌發(fā)時(shí)的最適水平，比較不同方式對(duì)芽孢萌發(fā)的影響。

表1 單一因素對(duì)芽孢誘導(dǎo)殺滅的作用條件Table 1 Effect of single factors on the induction and inactivation of spores

1.3.3 超聲協(xié)同熱處理對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅作用

分別在40、60 ℃和80 ℃條件下，對(duì)稀釋過(guò)的芽孢懸液（1.0×107CFU/mL）施加頻率25 kHz，功率100、300、600 W和900 W的超聲處理。時(shí)間15 min，期間每工作2 s停歇1 s，探究超聲協(xié)同熱處理對(duì)芽孢的誘導(dǎo)作用。

1.3.4 超聲協(xié)同誘導(dǎo)劑對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅作用

試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，分別探究超聲與DPA、L-丙氨酸+肌苷、AGFK、溶菌酶的協(xié)同作用。其中，DPA的添加濃度為6 mmol/L，L-丙氨酸和肌苷的添加濃度分別為50 mmol/L和6 mmol/L，溶菌酶的添加濃度為10 mmol/L，AGFK的添加濃度分別為L(zhǎng)-天冬酰胺10 mmol/L、D-葡萄糖10 mmol/L、D-果糖10 mmol/L和KCl 50 mmol/L。溫度60 ℃，超聲時(shí)間15 min，期間每工作2 s停歇1 s，探究超聲協(xié)同誘導(dǎo)劑對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅作用。

2013年，安全監(jiān)督工作深入貫徹落實(shí)黨的十八大精神和部黨組的決策，開(kāi)展水利安全生產(chǎn)考核以及安全生產(chǎn)檢查和隱患排查治理工作，全年未發(fā)生重特大生產(chǎn)安全事故。地方自主稽察全面展開(kāi)，稽察項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)區(qū)域和項(xiàng)目類(lèi)型全覆蓋，保障了大規(guī)模水利建設(shè)的有序進(jìn)行。日前，本刊記者專(zhuān)訪(fǎng)了水利部安全監(jiān)督司司長(zhǎng)武國(guó)堂。

表2 超聲與誘導(dǎo)劑協(xié)同作用對(duì)芽孢誘導(dǎo)殺滅的作用條件Table 2 Synergistic effect of ultrasound and inducer on the germination and inactivation of spores

1.3.5 超聲功率梯度式變化對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅作用

調(diào)整超聲功率的變化梯度，探究不同梯度模式下超聲對(duì)芽孢萌發(fā)和殺滅的作用效果。試驗(yàn)條件如表3所示，其中，L-丙氨酸和肌苷的濃度分別為50 mmol/L和6 mmol/L，溫度60 ℃，各功率條件下均處理3 min，每工作2 s停歇1 s。

表3 超聲功率變化對(duì)芽孢誘導(dǎo)殺滅的作用條件Table 3 Decreasing gradients of ultrasonic power for spore germination and inactivation

1.3.6 芽孢的誘導(dǎo)殺滅效果評(píng)價(jià)

將處理后的芽孢懸液立即置于（80±1）℃水浴中保溫15 min，隨后移入冰水浴中迅速冷卻，用移液槍分別吸取1 mL芽孢懸液，加入平板培養(yǎng)皿中，傾注約15～20 mL的培養(yǎng)基，搖勻，37 ℃下培養(yǎng)48 h[20]。以芽孢萌發(fā)率表示不同處理下的誘導(dǎo)殺滅效果，按下式計(jì)算。

式中：N0為未經(jīng)任何處理的菌濃度/（CFU/mL）；N為經(jīng)過(guò)超聲或誘導(dǎo)劑處理后，芽孢懸液經(jīng)過(guò)80 ℃水浴殺死萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)體后，在平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的可見(jiàn)菌濃度/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2010和SAS/PC（9.2）軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果等進(jìn)行均值差異顯著性檢驗(yàn)，方差分析中的多重比較項(xiàng)采用新復(fù)極差法（S-N-K）法，分組顯著性水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一因素對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅效果比較

圖1 不同誘導(dǎo)方法芽孢萌發(fā)效果Fig. 1 Effects of different induction methods on spore germination

由圖1可知，熱處理、L-丙氨酸+肌苷、AGFK、Nisin和生姜精油等用于芽孢誘導(dǎo)時(shí)，芽孢萌發(fā)率均小于30%，說(shuō)明這些誘導(dǎo)方法并無(wú)明顯誘導(dǎo)作用，無(wú)法刺激芽孢大量萌發(fā)。而溶菌酶、大蒜精油對(duì)芽孢有一定的誘導(dǎo)作用，其中溶菌酶的最適添加水平為10 mmol/L，對(duì)應(yīng)的芽孢萌發(fā)率為52.17%；大蒜精油的最適添加水平為20 mmol/L，對(duì)應(yīng)的芽孢萌發(fā)率為45.63%。兩種方法的萌發(fā)率都沒(méi)有超過(guò)60%，說(shuō)明這些方法雖然可以實(shí)現(xiàn)芽孢的部分萌發(fā)，但仍不能滿(mǎn)足大量萌發(fā)的需要，無(wú)法得到有效的殺菌效果。超聲或添加DPA則得到了較好的誘導(dǎo)效果，其中，超聲功率的最佳水平為600 W，可以殺滅62.94%的芽孢；而DPA的最適添加水平為12 mmol/L，芽孢萌發(fā)能夠達(dá)到99.45%，可以實(shí)現(xiàn)體系內(nèi)大部分芽孢的萌發(fā)和殺滅工作。但是，考慮到食品的可食性和安全性，本研究選擇以超聲為基礎(chǔ)，輔以其他誘導(dǎo)劑協(xié)同作用，進(jìn)一步探究中溫環(huán)境下提升芽孢萌發(fā)率的方法，實(shí)現(xiàn)殺滅大量芽孢的需要，延長(zhǎng)食品貨架期的同時(shí)避免對(duì)食品安全和品質(zhì)造成負(fù)面影響。

2.2 超聲協(xié)同不同誘導(dǎo)方法對(duì)芽孢的致死效果

經(jīng)過(guò)以上不同方法的單一誘導(dǎo)研究，確定了以超聲技術(shù)為基礎(chǔ)的芽孢殺滅方法。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)比較了超聲技術(shù)和熱處理、超聲技術(shù)和不同誘導(dǎo)劑組合以及超聲功率的不同變化等對(duì)芽孢萌發(fā)效果的影響，尋找不同條件下超聲技術(shù)用于芽孢誘導(dǎo)殺滅的最佳效果。

2.2.1 超聲協(xié)同熱處理對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅效果

熱處理溫度設(shè)置為40、60、80 ℃，探究不同溫度下超聲功率的變化對(duì)芽孢致死率的影響，結(jié)果如圖2所示。3 種溫度處理下的芽孢萌發(fā)率均隨著超聲功率的提高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其中，40 ℃處理時(shí)，在600 W達(dá)到最高，最高萌發(fā)率為59.85%；60 ℃和80 ℃處理時(shí)均在300 W達(dá)到最高，最高萌發(fā)率分別為64.24%和63.12%。整體上，實(shí)驗(yàn)得到的3 種最佳條件下的殺菌率并無(wú)顯著差異（P＞0.05），且均未超過(guò)65%，但是可以證明超聲和熱處理協(xié)同作用下對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢有一定的殺滅作用，對(duì)比之下選擇60 ℃作為芽孢萌發(fā)誘導(dǎo)的熱處理?xiàng)l件。

圖2 超聲和不同溫度協(xié)同作用對(duì)芽孢萌發(fā)率的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power combined with different temperatures on spore germination

2.2.2 超聲協(xié)同不同誘導(dǎo)劑對(duì)芽孢的誘導(dǎo)殺滅效果

在上述研究的基礎(chǔ)上，將超聲技術(shù)與常用的芽孢萌發(fā)誘導(dǎo)劑DPA、L-丙氨酸+肌苷、AGFK和溶菌酶復(fù)合使用，設(shè)定功率分別為100、300、600 W和900 W，頻率25 kHz，溫度60 ℃，處理時(shí)間15 min，工作2 s，停歇1 s。探究不同的使用功率下，超聲與不同誘導(dǎo)劑協(xié)同作用的效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲功率和不同誘導(dǎo)劑協(xié)同作用對(duì)芽孢萌發(fā)率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power combined with different inducers on spore germination

超聲技術(shù)與DPA共同作用時(shí)，雖然芽孢萌發(fā)率很高，但是超聲功率的變化對(duì)萌發(fā)率并無(wú)顯著影響（P＞0.05）；超聲技術(shù)與L-丙氨酸+肌苷協(xié)同作用時(shí)，隨著超聲功率的提高，芽孢萌發(fā)率有著顯著的升高（P＜0.05），尤其功率大于300 W以后，芽孢的萌發(fā)率超過(guò)了95%，最高達(dá)到了98.23%；與AGFK或溶菌酶協(xié)同作用時(shí)，芽孢萌發(fā)率隨著功率的提升也有改善，但是都沒(méi)有超過(guò)85%，與AGFK協(xié)同作用最高為84.67%；而與溶菌酶協(xié)同作用時(shí)最高為77.71%。

經(jīng)過(guò)不同方法的對(duì)比與篩選，最終確定超聲處理和L-丙氨酸+肌苷的復(fù)合作用誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)能獲得不錯(cuò)的效果，其萌發(fā)率能夠達(dá)到98%以上，且不同于傳統(tǒng)采用DPA為誘導(dǎo)劑，超聲聯(lián)合丙氨酸和肌苷共同作用不僅能夠有效實(shí)現(xiàn)芽孢萌發(fā)，降低熱致死溫度，而且對(duì)食物安全和風(fēng)味影響較小，可以有效延長(zhǎng)食品貨架期，實(shí)現(xiàn)非高溫殺菌產(chǎn)品的長(zhǎng)時(shí)間貯存。

2.3 超聲處理模式對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢的誘導(dǎo)殺滅效果

采用溫度60 ℃，L-丙氨酸+肌苷為誘導(dǎo)劑，對(duì)芽孢懸液進(jìn)行梯度式超聲處理，探究不同超聲處理模式對(duì)芽孢萌發(fā)的影響，處理結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲功率的梯度變化對(duì)芽孢萌發(fā)的影響Fig. 4 Effect of variation in ultrasonic power on spore germination

100 W-300 W-600 W-900 W的功率遞增模式與功率恒定模式相比，芽孢萌發(fā)并無(wú)改善，其得到的萌發(fā)率為80.25%；采用600 W-100 W-300 W-900 W和300 W-600 W-100 W-900 W的超聲模式，相比遞增模式效果較好，芽孢萌發(fā)率分別為85.94%和87.40%；而采用900 W-600 W-300 W-100 W的遞減功率則有最好的誘導(dǎo)效果，芽孢萌發(fā)率可以達(dá)到94.86%，可以實(shí)現(xiàn)芽孢的大量萌發(fā)。對(duì)比不同的超聲模式可知，相比其他模式，采用超聲功率由高到低的遞減模式具有更好的促萌發(fā)效果，可以有效用于體系內(nèi)芽孢的殺滅工作。

3 討 論

不同方法在誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)時(shí)的效果有很大差異，這主要與誘導(dǎo)劑對(duì)芽孢的作用位點(diǎn)和受體敏感度有關(guān)。通常情況下細(xì)菌的基因組有多個(gè)受體操縱子，這些能形成孢子的細(xì)菌往往通過(guò)多種受體響應(yīng)不同類(lèi)型的萌發(fā)劑。如枯草芽孢桿菌中g(shù)erA是產(chǎn)芽孢細(xì)菌類(lèi)中第一個(gè)被描述的操縱子，其同源基因編碼孢子膜上有3 個(gè)相關(guān)蛋白：GerAA、GerAB、GerAC，這3 個(gè)蛋白在芽孢中相互作用并形成一個(gè)受體復(fù)合物GerA，是L-丙氨酸的受體之一，這3 個(gè)蛋白中任何一個(gè)組分的失活都會(huì)影響整個(gè)受體的功能。同理，由gerB和gerK編碼的GerB和GerK等則是AGFK和葡萄糖的受體[21-22]。正是這些誘導(dǎo)劑對(duì)應(yīng)著不同的芽孢受體，所以在芽孢萌發(fā)過(guò)程中，受限于誘導(dǎo)劑的類(lèi)型、穿過(guò)孢子衣時(shí)的信號(hào)強(qiáng)弱以及受體的種類(lèi)和完整性等，不同誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果會(huì)有很大差異。王一曉[23]在實(shí)驗(yàn)中嘗試比較了L-丙氨酸、肌苷、D-葡萄糖和十二銨等不同類(lèi)型的誘導(dǎo)劑對(duì)芽孢萌發(fā)的誘導(dǎo)效果，結(jié)果表明，DPA的誘導(dǎo)效果較好，L-丙氨酸和肌苷次之，葡萄糖等效果最差，這與武玉艷[24]、Corthouts[25]等的研究結(jié)果相近。從本研究中不同誘導(dǎo)方法的殺滅效果也可發(fā)現(xiàn)：L-丙氨酸+肌苷、AGFK、大蒜精油、生姜精油的誘導(dǎo)效果較差，原因可能是僅僅靠自身的分子運(yùn)動(dòng)，單一的營(yíng)養(yǎng)素誘導(dǎo)劑難以通過(guò)芽孢衣和皮層達(dá)到對(duì)應(yīng)的受體位點(diǎn)，加上受體位點(diǎn)少或缺失，致使芽孢萌發(fā)率很低。而溶菌酶、DPA促進(jìn)芽孢萌發(fā)是非生理性的，尤其DPA是芽孢萌發(fā)時(shí)自身釋放的重要成分，對(duì)于引起后續(xù)折光性消失，促進(jìn)皮層水解和水分進(jìn)入起到重要作用；因此外源添加DPA是目前效果最好的芽孢誘導(dǎo)方法。溶菌酶則是通過(guò)水解芽孢衣和皮層，促進(jìn)水分子進(jìn)入引導(dǎo)芽孢萌發(fā)，因而受到芽孢抗性、酶活力和添加量影響較大，效果并不穩(wěn)定。

超聲殺菌主要是借助聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)，在受體局部區(qū)域形成反差巨大的正負(fù)壓區(qū)，巨大的壓強(qiáng)變化產(chǎn)生一系列物理和化學(xué)反應(yīng)，能夠有效殺滅一般細(xì)菌。Ha[26]、Khanal[27]、譚海剛[28]等分別在實(shí)驗(yàn)中探究了超聲技術(shù)用于大米、牛乳以及菌懸液等環(huán)境下的殺菌效果，但是只有少數(shù)人將超聲用于食品體系中芽孢的萌發(fā)與殺滅，并取得較好的效果。其中Khanal等[27]采用5 000 W、20 kHz的超聲條件結(jié)合巴氏殺菌（63 ℃，30 min）收到了較好的結(jié)果，芽孢的殺滅率達(dá)到了6 個(gè)數(shù)量級(jí)。而本研究中，借助超聲頻繁的壓力變化改變芽孢內(nèi)膜蛋白的理化性質(zhì)，影響膜的通透性，從而使水分子進(jìn)入，同時(shí)破壞芽孢衣的結(jié)構(gòu)，增加受體蛋白與營(yíng)養(yǎng)素的接觸幾率，促進(jìn)萌發(fā)機(jī)制啟動(dòng)，達(dá)到殺滅芽孢的目的，這與Rao Lei[29]、Spilimbergo[30]、Aouadhi[31]等的研究理論相近。通過(guò)本研究中超聲和不同誘導(dǎo)劑協(xié)同作用結(jié)果也可以看出，L-丙氨酸+肌苷、AGFK和溶菌酶在超聲作用下，都能使芽孢萌發(fā)率得到顯著提升，這是超聲作用改變內(nèi)膜通透性，增加了誘導(dǎo)劑與受體位點(diǎn)的接觸機(jī)會(huì)帶來(lái)的結(jié)果。而探究超聲與熱處理復(fù)合作用時(shí)，同一溫度下，芽孢的萌發(fā)率隨著超聲功率的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，原因可能是一定功率下，超聲作用產(chǎn)生的物化反應(yīng)促進(jìn)了芽孢內(nèi)膜的變化，促進(jìn)了芽孢的萌發(fā)，但當(dāng)功率過(guò)大時(shí)則會(huì)形成大量的空穴或氣泡，既不利于熱量和水分的傳遞，也會(huì)使芽孢產(chǎn)生局部聚集，耐受性增強(qiáng)，因而降低了芽孢的萌發(fā)效率。因此通過(guò)圖3所示的模式篩選，調(diào)整超聲功率的輸出模式，開(kāi)始采用大功率超聲，有效提升體系溫度，并快速改變芽孢內(nèi)膜的通透性，隨后逐漸降低輸出功率，適當(dāng)減少空穴和氣泡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)素誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高其與芽孢內(nèi)膜的接觸機(jī)會(huì)，達(dá)到了提升萌發(fā)率的效果。

4 結(jié) 論

本研究以枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，探究超聲、熱處理和不同誘導(dǎo)劑促進(jìn)芽孢萌發(fā)的最適條件。結(jié)果表明：1）通過(guò)不同方法的對(duì)比分析，確定超聲處理和DPA為最佳的誘導(dǎo)處理方法，考慮到實(shí)際應(yīng)用時(shí)的安全性和可食性，確定超聲為基礎(chǔ)、輔以其他方法的誘導(dǎo)模式。2）比較超聲與熱處理、誘導(dǎo)劑等協(xié)同作用于芽孢的誘導(dǎo)結(jié)果，最終確定采用超聲功率600 W、L-丙氨酸和肌苷濃度分別為50 mmol/L和6 mmol/L、溫度60 ℃的復(fù)合誘導(dǎo)模式，芽孢萌發(fā)率能夠達(dá)到98.23%，實(shí)現(xiàn)芽孢的大量萌發(fā)和殺滅；3）進(jìn)一步對(duì)比不同超聲模式，確定采用功率遞減的900 W-600 W-300 W-100 W的處理方法能夠有效提高芽孢萌發(fā)時(shí)的處理效率，為減少熱損傷和化學(xué)試劑的使用、延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期、保障食品安全和食用品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

[1] 徐娟, 張昭寰, 肖莉莉, 等. 食品工業(yè)中新型殺菌技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(16): 378-383. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.069.

[2] 李迎楠, 劉文營(yíng), 賈曉云, 等. 殺菌溫度對(duì)清醬肉色澤和風(fēng)味品質(zhì)的影響[J]. 肉類(lèi)研究, 2017, 31(5): 34-40. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201705007.

[3] 李云龍, 冀德君, 甘宗輝, 等. 巴氏殺菌奶不同處理溫度和貯存期內(nèi)脂肪酸變化規(guī)律研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(13): 29-33.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201313007.

[4] 夏文水, 鐘秋平. 食品冷殺菌技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2003, 15(6): 539-544. DOI:10.13590/j.cjfh.2003.06.022.

[5] TRUNET C, CARLIN F, COROLLER L. Investigating germination and outgrowth of bacterial spores at several scales[J]. Trends in Food Science & Technology, 2017, 64: 60-68. DOI:10.1016/j.tifs.2017.03.008.

[6] 項(xiàng)豐娟. 肉毒梭狀芽孢桿菌芽孢萌發(fā)條件及雞肉罐頭低溫殺菌方法的研究[D]. 新鄉(xiāng): 河南科技學(xué)院, 2015: 1-4.

[7] OLGUíN-ARANEDA V, BANAWAS S, SARKER M R, et al.Recent advances in germination of Clostridium spores[J].Research in Microbiology, 2015, 166(4): 236-243. DOI:10.1016/j.resmic.2014.07.017.

[8] 馮中營(yíng), 吳勝舉, 周鳳梅, 等. 超聲及其聯(lián)用技術(shù)的殺菌效果[J]. 聲學(xué)技術(shù), 2007, 26(5): 882-886.

[9] 周麗珍, 李冰, 李琳, 等. 超聲非熱處理因素對(duì)細(xì)菌殺菌效果的影響[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 54-57.

[10] LI X, FARID M. A review on recent development in non-conventional food sterilization technologies[J]. Journal of Food Engineering, 2016,182: 33-45. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2016.02.026.

[11] ORDO?EZ J A, SANZ B, HEMANDES P E, et al. A note on the eあect of combined ultrasonic and heat treatments on the survival of thermoduric streptococci[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1984,56(1): 175-177.

[12] ANSARI J A, ISMAIL M, FARID M. Investigation of the use of ultrasonication followed by heat for spore inactivation[J]. Food and Bioproducts Processing, 2017, 104: 32-39. DOI:10.1016/j.fbp.2017.04.005.

[13] KHANAL S N, ANAND S, MUTHUKUMARAPPAN K. Evaluation of high-intensity ultrasonication for the inactivation of endospores of 3 bacillus species in nonfat milk[J]. Journal of Dairy Science, 2014,97(10): 5952-5963. DOI:10.3168/jds.2014-7950.

[14] 黃瑞, 余小林, 胡卓炎, 等. 超聲對(duì)荔枝汁中TAB的殺菌效果研究[J].食品與機(jī)械, 2014, 30(3): 214-217; 243.

[15] 李申, 馬亞琴, 李楠楠, 等. 基于聲化學(xué)效應(yīng)探究低頻超聲處理對(duì)溫州蜜柑汁殺菌及其品質(zhì)的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2017, 43(5):106-114. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705018.

[16] 章中, 孫靜, 杜文斌, 等. 超高壓結(jié)合化學(xué)萌發(fā)誘導(dǎo)劑對(duì)枯草桿菌芽孢的滅活作用[J]. 食品科技, 2016, 41(4): 319-323. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.04.062.

[17] 李曼, 侯利華, 曹曉梅, 等. 乳酸鏈球菌素對(duì)蠟樣桿菌芽孢作用的初步研究[J]. 中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2009, 26(2): 126-128.

[18] 白艷紅, 趙電波, 楊公明, 等. 蛋清溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(11): 213-216.

[19] 張寶善, 王君, 陳錦屏, 等. 大蒜汁對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用的研究[J].西北植物學(xué)報(bào), 2009, 29(6): 1269-1275.

[20] 高媛, 周先漢, 曾慶梅, 等. 高壓CO2處理對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢殺滅及協(xié)同作用的影響[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(11): 64-68.

[21] 程琴, 黃庶識(shí), 陳麗梅. 芽孢桿菌孢子萌發(fā)機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2010, 22(9): 878-885. DOI:10.13376/j.cbls/2010.09.002.

[22] HORNSTRA L M, TER BEEK A, SMELT J P, et al. On the origin of heterogeneity in (preservation) resistance of Bacillus spores: input for a ‘systems’ analysis approach of bacterial spore outgrowth[J].International Journal of Food Microbiology, 2009, 134: 9-15.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.02.011.

[23] 王一曉. 熱和化學(xué)物質(zhì)最佳誘導(dǎo)枯草桿菌芽孢萌發(fā)條件的研究[D].銀川: 寧夏大學(xué), 2016: 8-18.

[24] 武玉艷, 李汴生. 添加營(yíng)養(yǎng)發(fā)芽誘導(dǎo)因子和抑制因子對(duì)壓力誘導(dǎo)芽孢發(fā)芽的影響的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 11-14.DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2009.09.013.

[25] CORTHOUTS J, MICHIELS C W. Inhibition of nutrient- and high pressure-induced germination of Bacillus cereus spores by plant essential oils[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2016, 34: 250-258. DOI:10.1016/j.ifset.2016.02.011.

[26] HA J H, KIM H J, HA S D. Effect of combined radiation and NaOCl/ultrasonication on reduction of Bacillus cereus spores in rice[J]. Radiation Physics and Chemistry, 2012, 81(8): 1177-1180.DOI:10.1016/j.radphyschem.2012.01.026.

[27] KHANAL S N, ANAND S, MUTHUKUMARAPPAN K, et al.Inactivation of thermoduric aerobic sporeformers in milk by ultrasonication[J]. Food Control, 2014, 37: 232-239. DOI:10.1016/j.foodcont.2013.09.022.

[28] 譚海剛, 李靜, 孫超. 超聲波對(duì)原料乳滅菌效果的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2013, 41(6): 59-61.

[29] RAO Lei, XU Zhenzhen, WANG Yongtao, et al. Inactivation of Bacillus subtilis spores by high pressure CO2with high temperature[J].International Journal of Food Microbiology, 2015, 205: 73-80.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.04.012.

[30] SPILIMBERGO S, BERTUCCOA A, LAURO F M, et al. Inactivation of Bacillus subtilis spores by supercritical CO2treatment[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2003, 4(2): 161-165.

[31] AOUADHI C, SIMONIN H, MAAROUFI A, et al. Optimization of nutrient-induced germination of Bacillus sporothermodurans spores using response surface methodology[J]. Food Microbiology, 2013,36(2): 320-326. DOI:10.1016/j.fm.2013.06.021.