超高壓對雞肉肌原纖維蛋白-MgCl2凝膠特性的影響

潘 杰，周 穎，王 昱，代顯卓，李沛軍，陳從貴*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉中重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)群，包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白、肌鈣蛋白等；是形成肉凝膠的主要成分，與肉制品的質(zhì)構(gòu)、保水、流變等特性密切相關(guān)[1-2]。眾所周知，高鹽（鈉鹽）飲食危害人體健康；有數(shù)據(jù)顯示，肉和肉制品貢獻了食物中16%～25%的鈉鹽攝入量[3]。因此實現(xiàn)肉制品的低鹽化，對推動健康飲食具有重要的作用。

在低鹽肉制品開發(fā)研究中，鈉鹽替代鹽、超高壓處理（high pressure processing，HPP）及兩者的結(jié)合已受到關(guān)注[4-5]。MgCl2作為典型的二價鹽，當(dāng)其濃度低于5 mmol/L時，可提高雞胸肉MP的熱凝膠強度；而高于10 mmol/L時，則會減弱凝膠強度[6]。MgCl2部分替代鈉鹽，能增加豬肉MP的溶解度，提高MP乳化凝膠的黏彈性，并降低汁液流失[7]。HPP作為一種非熱加工技術(shù)，可在保留肉制品營養(yǎng)成分的前提下，有效殺滅微生物，延長貨架期[8]；可提高肉蛋白凝膠的功能特性，改善肉制品的品質(zhì)[9]；HPP后的肌動球蛋白，在高、低離子強度的溶液中都有較強的熱凝膠能力[10]；300 MPa的HPP可使低鹽（質(zhì)量分數(shù)0.3% NaCl）魚糜凝膠的機械性能和感官性能達到與高鹽（3% NaCl）凝膠相當(dāng)?shù)乃絒11]。此外，食鹽與HPP之間還具有一定的互補效應(yīng)[12]?？梢姡琀PP在肉制品減鹽加工中具有應(yīng)用潛力。但HPP對MP-MgCl2混合體系凝膠特性的影響如何，尚鮮見文獻報道。

本研究考察了MP-MgCl2凝膠硬度和保水性（water holding capacity，WHC）對HPP的響應(yīng)規(guī)律，并通過混合溶膠流變特性分析及凝膠橫向弛豫時間與微結(jié)構(gòu)分析，探討HPP混合體系凝膠特性的變化機制，以期為低鹽肉制品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉購于合肥家樂福，冰箱中冷藏（約4 ℃）。

無水氯化鎂（MgCl2純度≥99.9%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP600 MPa/0.6 L超高壓處理裝置 包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；BC/BD-241GS冷藏柜 青島Haier集團公司；Kertone labmini4 UV超純水機 湖南科爾頓水務(wù)有限公司；DS-1組織搗碎機 上海越磁電子科技有限公司；RCT Basic磁力攪拌器 德國IKA公司；FA25高剪切乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；CT-14RD冷凍離心機 上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；GL-21M高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；HR-3 Discovery流變儀 美國TA公司；NMI20-015V-I核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；JSM 6490LV掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、JFC-1600噴金儀 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

剔除新鮮雞胸肉中的可見脂肪和結(jié)締組織，切碎、稱質(zhì)量。參考Park[13]和Westphalen[14]等的方法提取MP，提取過程在0～4 ℃低溫環(huán)境下進行；經(jīng)離心所得的最終MP沉淀，用0.4 mol/L NaCl磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）將MP質(zhì)量濃度調(diào)整至40 mg/mL。

1.3.2 MP-MgCl2溶膠制備

取上述MP溶液900 g，向其中添加質(zhì)量分數(shù)0.3%的MgCl2；將所得混合溶液在冰浴中緩慢攪拌20 min，使MP與MgCl2充分混勻，即得MP-MgCl2混合溶膠。

1.3.3 超高壓處理

參照Ma Fei等[15]的方法。將上述MP-MgCl2混合溶膠沿袋壁注入聚乙烯袋內(nèi)，真空包裝；在室溫下（20～25 ℃），水作為傳壓介質(zhì)，壓力水平設(shè)為100、200、300、400 MPa，保壓時間10 min。樣品加壓前后均保存在冰浴中，受壓后的樣品在5 h內(nèi)完成隨后的熱凝膠化處理及流變學(xué)分析。

1.3.4 MP-MgCl2凝膠制備

將受壓MP-MgCl2樣品倒入規(guī)格為Φ 27 mm×35 mm（供凝膠硬度測定）和Φ 23 mm×37 mm（供凝膠WHC測定）的10 mL小燒杯中，放入20 ℃水浴鍋中平衡10 min；20 ℃升溫至80 ℃后（約30 min），于80 ℃保溫30 min；然后取出，冰水浴冷卻10 min，4 ℃靜置12 h，供檢測。非受壓樣品作為對照。

1.3.5 凝膠硬度測定

參照Zhou Yanzi等[16]的方法。利用TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀GMIA程序測定。參數(shù)為：P/0.5探頭，探頭下降速率1.50 mm/s，測試速率1.00 mm/s，測試距離4 mm，探頭回升速率1.00 mm/s，感應(yīng)力5 g。檢測的平行實驗7 次。

1.3.6 WHC測定

參照Zhou Yanzi等[16]的離心方法。在4 ℃、1 000×g條件下離心10 min。WHC為離心后樣品質(zhì)量占離心前樣品質(zhì)量的百分比。平行實驗5 次。

1.3.7 溶膠流變特性測定

參照Verbeken等[17]的方法。選用流變儀的振蕩模式，具體參數(shù)為：平板直徑40 mm，狹縫550 μm，應(yīng)變2%，頻率0.1 Hz。測定分為升溫和降溫兩個過程，升溫速率2 ℃/min，溫度變化范圍20～80 ℃；降溫速率4 ℃/min，溫度變化范圍80～20 ℃。

1.3.8 橫向弛豫時間

參照Han Minyi等[18]的低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）方法。將2～4 g凝膠樣品放入直徑25 mm核磁管中，采用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill（CPMG）序列進行測量。測量參數(shù)：共振頻率21 MHz，回波時間TE0.6 ms，等待時間TW6 000 ms，重復(fù)掃描32 次，得到指數(shù)衰減圖形，使用SIRT算法反演擬合得到T2譜圖。平行實驗3 次，每個平行試樣重復(fù)檢測2 次。

1.3.9 SEM觀察

參照Ma Fei等[15]的方法。將混合體系凝膠切片，用體積分數(shù)4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）固定，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗，不同濃度梯度乙醇脫水、丙酮脫水，冷風(fēng)除去易揮發(fā)的有機溶劑，真空冷凍干燥15 h，噴金，觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)利用Excel 2007軟件計算，結(jié)果以表示，用Statistix 8軟件和t-檢驗進行顯著性分析，差異顯著性水平取P＜0.05；采用Origin 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPP對MP-MgCl2混合體系凝膠品質(zhì)特性的影響

2.1.1 HPP對MP-MgCl2凝膠硬度的影響

圖1 HPP對MP-MgCl2凝膠硬度的影響Fig. 1 Effect of HPP on gel hardness of MP-MgCl2 gels

如圖1所示，HPP對MP-MgCl2凝膠硬度的影響呈先升后降的趨勢。與未受壓組（0.1 MPa）相比，壓力從100 MPa升至300 MPa，受壓凝膠的硬度依次顯著提高（P＜0.05）；而壓力增至400 MPa時，凝膠硬度反而顯著下降（P＜0.05）。提高MP-MgCl2凝膠硬度的合適壓力約為300 MPa。

HPP影響蛋白凝膠硬度的原因有很多。Sikes等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HPP可以促進蛋白質(zhì)的伸展，使受壓過程的蛋白質(zhì)暴露出更多的可與鹽離子作用的基團，增加含鹽聚合物的數(shù)量，進而改善低鹽混合體系凝膠的硬度。Zheng Haibo等[20]觀察到，與單純加熱所形成的粗糙凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相比，HPP能夠促進雞肉糜加熱前的凝膠化過程，使得加熱后形成的凝膠呈現(xiàn)細致光滑的結(jié)構(gòu)，且凝膠硬度顯著提高。還有研究指出，在溫和的壓力水平下（100～400 MPa），HPP可增強魚糜蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用，利于凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，進而提高凝膠的彈性和強度[21]；但較高的壓力會加劇蛋白質(zhì)的變性速率，減小蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致MP交聯(lián)度降低而不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而形成弱凝膠。這些結(jié)果都可能影響受壓MP-MgCl2的凝膠硬度。

2.1.2 HPP對MP-MgCl2凝膠WHC的影響

圖2 HPP對MP-MgCl2凝膠WHC的影響Fig. 2 Effect of HPP on WHC of MP-MgCl2 gels

從圖2可以看出，HPP（100～400 MPa）可顯著提高MP-MgCl2凝膠的WHC（P＜0.05），而100 MPa與200 MPa之間、300 MPa與400 MPa之間，MP-MgCl2凝膠的WHC沒有顯著差異（P＞0.05）。

Tabilo等[22]指出，適當(dāng)?shù)膲毫梢源龠M蛋白質(zhì)的解聚，提高蛋白質(zhì)的溶解性，增強自由水與蛋白質(zhì)之間的水化作用，進而提高蛋白質(zhì)凝膠的保水性。HPP通過靜電相互作用破壞了二價陽離子與蛋白質(zhì)分子之間的作用力，并在卸壓期間降低了蛋白復(fù)合體中鹽橋重新形成的概率，從而影響了凝膠的保水性[23]。曹瑩瑩等[24]研究發(fā)現(xiàn)，HPP能改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子折疊或者無規(guī)卷曲時，分子有更多的空隙，能夠容納更多的水分。同時，蛋白凝膠的持水性還與凝膠的微觀結(jié)構(gòu)、水分分布及流動性等密切相關(guān)。Ma Xingsheng等[21]報道，適當(dāng)?shù)膲毫λ剑?00～400 MPa）可以促進魚糜蛋白的伸展和交聯(lián)，有利于高保水性網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)（致密均勻、多層次化）的形成。本研究中，HPP也可能通過改變MP混合體系凝膠中水分的流動性，進而改善凝膠的保水性。

2.2 HPP對MP-MgCl2溶膠流變特性的影響

儲能模量（G’）代表流體中的彈性部分，反映凝膠形成過程中儲存的能量及凝膠強度[25]。如圖3A所示，未受壓的MP-MgCl2體系在45～60 ℃溫度范圍內(nèi)出現(xiàn)一個明顯的熱變性峰。45～50 ℃為“凝膠形成”階段，G’線性增大，與蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的初步形成有關(guān)；而50～58 ℃為“凝膠減弱”階段，G’急劇降低，這是由于加熱誘導(dǎo)部分氫鍵斷裂，進而促使蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[26-27]。溫度大于60 ℃時為“凝膠增強”階段，G’持續(xù)增加，表明更多的蛋白質(zhì)通過交聯(lián)形成良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27]。與未加壓組相比，HPP后的樣品G’在未加熱（20 ℃）時都有所增加，表明HPP可促進MP凝膠化，并提高了混合體系的強度；且在20～45 ℃范圍內(nèi)G’呈現(xiàn)出下降趨勢，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在Cando等[11]的報道中。在加熱終點（80 ℃），隨著壓力的增加（100～300 MPa），G’也逐漸增加，但壓力為400 MPa時，G’降低，這與圖1中MP-MgCl2混合體系凝膠硬度的變化結(jié)果一致。100～200 MPa并未改變MP-MgCl2的變性溫度峰；而300～400 MPa時，較高的壓力促使蛋白質(zhì)充分展開且伴隨著聚集現(xiàn)象，從而導(dǎo)致MP-MgCl2在隨后加熱過程中G’曲線特征峰的消失。400 MPa導(dǎo)致G’的明顯下降，可能是因為HPP抑制了蛋白質(zhì)在隨后加熱過程中的變性和聚集，且不利于密實凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，最終引起凝膠強度的下降。由圖3B可知，受壓MP-MgCl2體系G’的變化趨勢與未受壓組相同，均隨溫度的降低而增加，表明在冷卻過程中凝膠彈性增加，形成穩(wěn)定的蛋白凝膠結(jié)構(gòu)。

圖3 HPP對MP-MgCl2混合體系升溫（A）和降溫（B）過程中儲能模量（G’）的影響Fig. 3 Effect of HPP on storage modulus (G’) of MP-MgCl2 gels during heating (A) and cooling (B)

圖4 HPP對MP-MgCl2混合體系升溫過程中tan δ的影響Fig. 4 Effect of HPP on tan δ of MP-MgCl2 gels during heating

如圖4所示，HPP顯著改變了升溫過程中MP-MgCl2體系的tan δ。在加熱初期，與未受壓組（0.1 MPa）相比，各水平HPP均能不同程度地降低樣品的黏性特征；且受壓組的曲線特征基本一致。在38～48 ℃范圍內(nèi)tan δ值急劇下降，表明蛋白體系的彈性增強，這也說明，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化以及蛋白之間產(chǎn)生了相互作用[28]。較小的tan δ值表明MP-MgCl2形成了具有彈性的凝膠結(jié)構(gòu)。

2.3 橫向弛豫時間的結(jié)果與分析

LF-NMR技術(shù)是一種快速、無損、非侵入式的檢測手段，多用于測定樣品中水質(zhì)子的移動性和水分分布狀態(tài)[29]。而自旋-自旋弛豫時間（T2）常用來預(yù)測肉及肉制品的保水性；T2值越小表明這部分水分的流動性越差，產(chǎn)品的保水性越好。

圖5 HPP對MP-MgCl2凝膠自旋-自旋弛豫時間（T2）分布的影響Fig. 5 Effect of HPP on T2 relaxation time distribution of MP-MgCl2 gels

表1 HPP對MP-MgCl2凝膠自旋-自旋弛豫時間（T22和T23）的影響Table 1 Effect of HPP on spin-spin relaxation time (T22 and T23) of MP-MgCl2 gels

由圖5可見，MP-MgCl2凝膠的T2在0～10 000 ms的弛豫時間分布上出現(xiàn)3 個峰，分別對應(yīng)于結(jié)合水T21（0～20 ms）、不易流動水T22（30～400 ms）和自由水T23（400～3 000 ms）。從不同狀態(tài)的水對應(yīng)的峰面積來看，凝膠中不易流動水和自由水相比于結(jié)合水含量較高，因此可以選擇弛豫時間T22、T23來分析MP-MgCl2凝膠中水分的流動特性。隨著壓力（100～400 MPa）的升高，T22和T23對應(yīng)的峰值位置均向低弛豫時間偏移。T22和T23的數(shù)據(jù)分析（表1）發(fā)現(xiàn)，壓力升高，T22顯著減小（P＜0.05）；雖然在0.1～200 MPa范圍內(nèi)，T23無顯著變化（P＞0.05），但壓力為300 MPa時，T23也顯著降低（P＜0.05）。可見，HPP可縮短MP-MgCl2凝膠的橫向弛豫時間。

Grossi等[30]發(fā)現(xiàn)，較低的壓力水平（≤400 MPa）利于提高MP的水合作用，從而影響蛋白質(zhì)與水之間的相互作用。Zhang Ziye等[31]指出，HPP改變了T2弛豫時間，且隨著壓力的上升（0.1～500 MPa），更多的自由水附著在蛋白質(zhì)周圍或被束縛在凝膠結(jié)構(gòu)中，轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合水或不易流動水。Chen Xing等[32]研究發(fā)現(xiàn)，HPP可顯著降低T22，減弱了凝膠內(nèi)部水分的移動性，從而提高了肌球蛋白體系的WHC。HPP同樣也可以顯著縮短MP-MgCl2凝膠的橫向弛豫時間T22和T23，表明凝膠體系中水分子的流動性減弱，從而提高了凝膠WHC（圖2）。

2.4 HPP對MP-MgCl2凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6 HPP對MP-MgCl2凝膠微觀結(jié)構(gòu)影響的SEM圖Fig. 6 SEM images showing the effect of HPP on microstructure of MP-MgCl2 gels

如圖6A所示，未受壓（0.1 MPa）的MP-MgCl2凝膠微觀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)內(nèi)部孔隙小而多、質(zhì)地相對均勻的特點；而HPP（100～400 MPa）可以促進蛋白質(zhì)間的聚集，形成局部更為致密、相互交聯(lián)的多孔結(jié)構(gòu)（圖6B～E），尤其以300 MPa處理組最為明顯（圖6D）。

蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化與其質(zhì)構(gòu)和持水性密切相關(guān)。凝膠呈多孔狀的微觀結(jié)構(gòu)有利于提高其WHC，這一現(xiàn)象也與自旋弛豫時間T2的降低有關(guān)[18]。而蛋白質(zhì)變性和聚集的相對速率決定著蛋白質(zhì)凝膠微結(jié)構(gòu)的變化[33]。從上述流變特性的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，HPP（100～300 MPa）可以提高MP-MgCl2的熱凝膠能力，利于MP-MgCl2混合溶膠在熱凝膠化過程中的變性和聚集，從而形成致密、相互交聯(lián)的多孔微結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致體系凝膠硬度的增強和WHC的提高（圖1～2）。

3 結(jié) 論

HPP（100～400 MPa）能夠通過改變MP-MgCl2混合體系的儲能模量（G’），縮短凝膠內(nèi)部水分的自旋-自旋弛豫時間T22和T23，促進交聯(lián)、密實凝膠多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，進而顯著提高MP-MgCl2混合體系的凝膠硬度和WHC（P＜0.05），且300 MPa是改善其凝膠硬度的合適壓力。研究結(jié)果可為肉制品的低鹽化加工提供理論支持。

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