輻照處理對魔芋葡甘聚糖腸道益生作用的影響

李美英，馮觀萍，徐振林，孫遠明*

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是天南星植物科魔芋屬多年生草本植物魔芋的主要獨特成分，其主鏈由D-葡萄糖和D-甘露糖以物質(zhì)的量比為1∶1.5～1∶1.6（花魔芋）或1∶1.69（白魔芋）連結(jié)而成，主鏈上的甘露糖的C3位鍵上有以β-1,3鍵結(jié)合的支鏈結(jié)構(gòu)，每隔19 個糖殘基存在一個乙?；鶊F[1-2]。KGM主鏈以β-1,4糖苷鍵連結(jié)，不能被機體消化酶水解吸收，具備水溶性膳食纖維特性，對腸道健康具有突出的保健功能[3]。KGM吸水性強，能夠增大糞便體積，促進腸蠕動及糞便排泄，減少有毒物吸收，發(fā)揮腸道清道夫作用[4]。KGM到達結(jié)腸部位后，在腸道微生物作用下發(fā)酵產(chǎn)酸，生成乙酸、丙酸、丁酸等多種短鏈脂肪酸，同時促進腸道雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌增殖，抑制有害菌生長，調(diào)節(jié)腸道菌群，具有良好的腸道益生元作用[5-6]。近年來許多報道證實KGM的腸道益生元作用是其發(fā)揮減肥降脂[7-8]、調(diào)節(jié)免疫力[9]、抵御氧化損傷[10-11]、預防結(jié)腸癌[12]等生物學作用的重要途徑，因此評價各類KGM及衍生物的腸道益生性對預估KGM生物學活性具有重要意義。

KGM具有良好的流變學及凝膠特性，1994年被美國食品藥品監(jiān)督局認定為食品添加劑，作為穩(wěn)定劑及擴散劑廣泛應用于各類食品及飲料中[13]。天然KGM相對分子質(zhì)量非常高，水溶液黏度大，流變性能差，使其在食品工業(yè)中的應用受到限制[14]。目前，常采用物理或化學手段對KGM進行改性，改善其物理、化學、生物學性能，以期拓展其在食品領域的應用[15-17]。γ射線是一種具有高能量、長射程和強穿透力的離子流，常用于高聚物的改性。采用γ射線進行輻照改性，較好保持了食品外觀性質(zhì)和風味，同時避免了化學改性過程中有毒物質(zhì)殘留及對環(huán)境的污染，已成為魔芋改性研究的一大熱點[18]。以往研究多關注γ射線輻照后KGM理化性質(zhì)、加工性能的變化，對KGM生物學活性的影響尚不明確。本課題組前期開展了KGM輻照改性的系列研究，發(fā)現(xiàn)KGM經(jīng)γ射線輻照改性分子質(zhì)量下降，黏度降低，生成羰基或雙鍵，晶體結(jié)構(gòu)受到部分破壞，有助于提高酶解效率[19-22]。低聚糖的益生元特性受其理化性質(zhì)及分子微觀結(jié)構(gòu)的影響[23]。輻照改性所帶來的以上理化性質(zhì)的改變，對其腸道益生性會產(chǎn)生怎樣的影響，有待進一步研究。本研究以60Co為輻射源制備不同輻照劑量KGM樣品，采用健康志愿者糞便體外厭氧發(fā)酵，比較KGM輻照樣品發(fā)酵液pH值、短鏈脂肪酸產(chǎn)生量的變化趨勢及益生元指數(shù)（prebiotic index，PI）的差異，探討輻照劑量對KGM腸道益生性的影響，為KGM加工過程的輻照改性提供直接的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KGM由湖北十堰花仙子魔芋制品有限公司提供，采用輻照劑量分別為0、10、20、30 kGy的60Co-γ射線室溫下進行輻照后密封保存。

乙酸、丙酸、丁酸（色譜純） 德國CNW公司；膽汁酸鹽、氯化血紅素 合肥博美生物科技有限責任公司；EMB大腸桿菌培養(yǎng)基、SPS產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基、MRS乳酸桿菌培養(yǎng)基、BS雙歧桿菌培養(yǎng)基、GAM腸道群菌培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限責任公司。

1.2 儀器與設備

CTO-10AS液相色譜儀 日本島津公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱 培英實驗儀器有限公司；厭氧培養(yǎng)箱美國Sheldon Manufacturing公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；5417R小型臺式冷凍型離心機 德國Eppendorf公司；ME104/02電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 健康人糞便提取液制備及基本發(fā)酵液制備

收集健康志愿者的新鮮糞便，志愿者年齡介于21～25 歲，身體健康，未患有消化系統(tǒng)疾病，至少3 個月未服用或注射過抗生素類藥物，糞便收集過程盡量保持無菌，將收集的糞便立即用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（1 mmol/L，pH 7.0）按照1∶10（m/V）的比例稀釋，充分混勻，過濾即得糞便提取液。糞便樣品的采集與提取液制備的整個過程于30 min內(nèi)完成，即用即配。

靜置發(fā)酵培養(yǎng)基的配制在Rycroft等[24]方法的基礎上進行改動，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為6.7，后期發(fā)酵過程中不再控制調(diào)節(jié)，調(diào)配完成的培養(yǎng)基裝入錐形瓶中高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）后保存待用。

1.3.2 體外發(fā)酵

稱取葡萄糖及KGM樣品各0.2 g于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液糖質(zhì)量濃度為10 g/L，以葡萄糖作為實驗陽性對照組，空白對照組無碳源。接種新鮮糞便提取液至發(fā)酵液，搖勻置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別厭氧發(fā)酵0、6、12、18、24 h，每個樣品做3 個平行實驗。取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液，以20 g/L CuSO475 μL終止發(fā)酵，振蕩混勻后13 000 r/min離心10 min去除菌體和沉淀物，測定上清液pH值；另取部分上清液用0.22 μm濾膜過濾，用于測定短鏈脂肪酸。

1.3.3 短鏈脂肪酸含量測定

參考張萍[25]、譚力[26]等的方法并做適當修改，采用液相色譜測定發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸的含量，將三者之和作為總酸含量。液相色譜條件：色譜柱為Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1 mL/min，檢測波長為215 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL；流動相：PBS（pH 2.7）-乙腈（90∶10，V/V），等濃度洗脫。

1.3.4 發(fā)酵液菌落計數(shù)及益生性評價

取0 h及24 h發(fā)酵液各1 mL，用生理鹽水以1∶9（V/V）依次連續(xù)稀釋至各種菌適宜的計數(shù)濃度，每個稀釋度分別接種100 μL于各培養(yǎng)板上，大腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基，腸道群菌采用GAM培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后計數(shù)；產(chǎn)氣莢膜梭菌采用SPS培養(yǎng)基，乳酸桿菌采用MRS培養(yǎng)基，雙歧桿菌采用BS培養(yǎng)基，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計數(shù)，記錄各菌群的數(shù)量，結(jié)果以lg（CFU/mL）表示。依據(jù)Palframan等[27]的方法計算PI，作為評價KGM樣品益生性的指標，按下式計算。

式中：Bif、Esc、Lac、Clos分別表示靜置發(fā)酵一段時間后雙歧桿菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)與對應初始菌數(shù)之比；Total表示靜置發(fā)酵一段時間后總菌數(shù)與初始總菌數(shù)之比。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，結(jié)果以表示，兩兩比較采用最小差異法，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液pH值的變化

圖1 不同發(fā)酵液pH值的變化Fig. 1 Changes in pH in different samples during fermentation

寡糖在結(jié)腸部位經(jīng)微生物作用，發(fā)酵產(chǎn)酸，改變腸道pH值，維持腸道酸性環(huán)境。圖1為各種發(fā)酵液pH值變化趨勢圖，從圖中可看出，發(fā)酵時間在0～12 h之間，除空白對照組外，各組KGM樣品pH值均發(fā)生了明顯下降，其中陽性對照組的pH值下降趨勢最明顯，其次為30、20、10 kGy和0 kGy KGM，12 h后30 kGy和20 kGy KGM的pH值改變趨于平緩，而10 kGy和0 kGy KGM的pH值依然持續(xù)下降。發(fā)酵液pH值的高低可間接反映發(fā)酵過程有機酸的生成情況，與腸道微生物作用發(fā)酵樣品的速度和程度有關[28]。葡萄糖糖鏈較短，最易被腸道微生物充分利用，發(fā)酵初期產(chǎn)酸明顯，pH值下降顯著。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)KGM經(jīng)輻照改性后分子鏈發(fā)生斷裂裂解，輻照劑量越大，分子質(zhì)量下降越明顯[22]，被腸道微生物充分利用所需時間越短，發(fā)酵產(chǎn)酸更充分，故高輻照劑量KGM較早到達低pH值平臺期值，且pH值下降幅度最明顯。

2.2 短鏈脂肪酸生成量的變化

圖2 不同發(fā)酵液短鏈脂肪酸生成量的變化Fig. 2 Changes in short chain fatty acid concentration in different samples during fermentation

從圖2中可看出，KGM的發(fā)酵產(chǎn)物中以乙酸的生成量最多，其次丙酸，丁酸最少。隨著發(fā)酵時間的延長，KGM樣品發(fā)酵液中的乙酸、丙酸和丁酸生成量隨之增加，到24 h，0、10、20、30 kGy KGM的短鏈脂肪酸總生成量較發(fā)酵0 h時分別增加了17.7、25.89、29.87、31.24 mmol/L；與陽性對照葡萄糖相比，0、10、20、30 kGy KGM發(fā)酵液24 h短鏈脂肪酸總生成量分別是陽性對照組的1.8、2.6、3.0、3.1 倍。從這些對比數(shù)據(jù)可看出，輻照劑量越大，KGM發(fā)酵液短鏈脂肪酸的生成量越高，與圖1中各樣品發(fā)酵液的pH值變化曲線基本一致。膳食纖維在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵，其短鏈脂肪酸生成情況與膳食纖維理化性質(zhì)密切相關，Nilsson等[29]發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸的生成受其單糖組成及連接方式、分子質(zhì)量、聚合度、溶解度等多種因素影響。通常來說，分子質(zhì)量及聚合度較低、溶解度較高的多糖在結(jié)腸發(fā)酵中其短鏈脂肪酸總生成量更高。以往研究發(fā)現(xiàn)，輻照處理能提高KGM在水中的溶解度，同時導致KGM分子質(zhì)量及聚合度下降[21-22,30]。本研究中KGM經(jīng)輻照后短鏈脂肪酸生成量增加可能與輻照改性使KGM糖苷鍵及雙鍵發(fā)生斷裂裂解，其溶解度增加，使其更容易被腸道微生物利用有關[31]。

2.3 發(fā)酵液微生物數(shù)量的變化

人體結(jié)腸內(nèi)定植著大量腸道菌群，包含有益菌及有害菌，兩者相互制約，平衡生長。本研究選擇雙歧桿菌和乳桿菌作為腸道菌群有益菌的典型代表，大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌作為潛在有害菌的代表。

表1 發(fā)酵液微生物數(shù)量變化Table 1 Changes in bacterial populations in different samples during fermentation lg（CFU/mL）

從表1可知，與0 h相比，各KGM樣品發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中雙歧桿菌與乳酸桿菌數(shù)量增加，大腸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量下降，說明KGM能促進有益菌增殖，抑制有害菌生長，顯示了其潛在的益生性能，這與以往研究結(jié)果一致[5]。比較不同輻照劑量的菌群數(shù)量變化，10、20、30 kGy KGM發(fā)酵液雙歧桿菌數(shù)目較0 kGy KGM高（P＜0.05），其余菌種不同輻照劑量KGM組間差異不明顯（P＞0.05）。微生物增殖與結(jié)腸微環(huán)境密切關聯(lián)，不同膳食纖維對腸道微環(huán)境影響不盡相同，KGM經(jīng)輻照后，其腸道pH值下降（圖1），各種短鏈脂肪酸生成量增加（圖2），腸道微環(huán)境發(fā)生變化，促使其微生物構(gòu)成發(fā)生相應改變。

2.4 B/E值的變化

荷蘭學者van der Waaij等[32]將腸道內(nèi)雙歧桿菌和腸桿菌數(shù)量對數(shù)值的比值（B/E值）作為腸道菌群定植抗力的指標，反映腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖3 不同發(fā)酵液的B/E值Fig. 3 B/E values of different samples during fermentation

由圖3可知，各KGM樣品的B/E值較空白組高，反映KGM可改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，有利腸道有益菌定植。不同輻照劑量KGM的B/E值結(jié)果顯示，0、10、20、30 kGy KGM的B/E值分別是1.25、1.40、1.49、1.47?？煽闯鲈?～20 kGy輻照范圍內(nèi)，隨輻射劑量增大，KGM的B/E值隨之增大，30 kGy KGM的B/E值較20 kGy KGM稍有下降，但差異不明顯。說明輻照改性有助于KGM促進腸道有益菌定植，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

2.5 益生元指數(shù)的變化

PI是Palframan等[27]提出的體外模型中衡量低聚果糖益生元作用的指標，它可以避免因取樣接種不均衡、初始菌量和總菌數(shù)目不一致所導致的結(jié)果偏差。通過比較PI的大小，可定量描述各類低聚糖的益生元作用。

圖4 不同發(fā)酵液的PIFig. 4 PI values of different samples during fermentation

本實驗引入PI值評價不同輻照劑量KGM的益生元作用，由圖4可知，0、10、20、30 kGy KGM的PI分別為0.48、0.61、0.76、0.78，是陽性組PI的2.1、2.7、3.3、3.4 倍，體現(xiàn)了KGM經(jīng)小劑量輻照改性后具有更佳的腸道益生作用；20 kGy輻照可顯著提高KGM的PI，20 kGy與30 kGy KGM的PI差異并不明顯，表明輻照劑量達到一定程度后，對KGM腸道益生性的影響有限。腸道發(fā)酵過程復雜，腸道菌群結(jié)構(gòu)受眾多因素共同作用。KGM分子質(zhì)量大、黏度高，經(jīng)輻照后，其分子質(zhì)量變小、黏度降低、溶解度增大，更易于被腸道微生物利用，發(fā)酵產(chǎn)酸，調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，促進有益菌增殖，腸道益生性作用增強。

3 結(jié) 論

本實驗采用健康志愿者糞便體外厭氧發(fā)酵，研究了不同輻照劑量KGM的腸道益生作用，結(jié)果表明，與陽性對照葡萄糖相比，KGM具有更好的益生元特性，表現(xiàn)為促進乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸生成，顯著降低pH值，促進雙歧桿菌及乳桿菌等有益菌增殖，抑制腸桿菌等有害菌生長，顯著提高B/E值及PI，此結(jié)果進一步證實KGM具有顯著的腸道益生作用，有助于促進腸道健康。不同輻照KGM腸道益生性的評價結(jié)果顯示，在0～30 kGy的輻照范圍內(nèi)，隨輻照劑量的增大，KGM發(fā)酵液pH值下降顯著，短鏈脂肪酸生成量增加，同時PI隨之增加，0、10、20、30 kGy KGM的PI值分別為0.48、0.61、0.76、0.78，說明KGM經(jīng)小劑量輻照改性后具有更佳的腸道益生作用。對比輻照劑量增值對短鏈脂肪酸、B/E值及PI的影響幅度可發(fā)現(xiàn)，輻照劑量20 kGy以上時，輻照劑量的增加對腸道益生性的影響幅度明顯變小，綜合考慮輻照效率，可將20 kGy作為KGM輻照改性的適宜輻照劑量。

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