飼養(yǎng)方式對宰后蘇尼特羊肉一磷酸腺苷激活的蛋白激酶活力及糖酵解的影響

侯艷茹，馬曉冰，蘇 琳，趙雅娟，羅玉龍，趙麗華，靳 燁*

（內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

蘇尼特羊是內蒙古地區(qū)優(yōu)秀的肉羊種群，其肉質具有細嫩、味美多汁、易消化等特點，受到廣大消費者的喜愛[1]。飼養(yǎng)方式是影響肉品品質的重要因素，F(xiàn)luharty等[2]的研究表明，合理的舍飼育肥能夠提高動物的生長育肥性能，還可以改善肉質。本團隊研究發(fā)現(xiàn)，放牧條件下蘇尼特羊肉的色澤和嫩度都優(yōu)于圈養(yǎng)條件，且營養(yǎng)成分更豐富[3-4]，這說明飼養(yǎng)方式對肉品品質有所影響。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是蛋白激酶級聯(lián)的下游組件，屬于代謝敏感的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其主要功能是根據機體的能量需求調節(jié)整個機體的能量平衡[5-6]。AMPK能夠調節(jié)機體的糖代謝，糖酵解是引起動物宰后肌肉pH值下降的主要原因，而動物宰后的pH值變化速度與幅度可以影響肌肉的色澤、嫩度、系水力、蒸煮損失等品質指標[7-9]，所以動物宰后糖酵解的程度直接影響肉質的好壞。飼養(yǎng)方式會對肉品品質產生影響，而AMPK能夠通過調節(jié)動物宰后糖酵解的程度而影響肉質。所以，研究飼養(yǎng)方式對動物宰后AMPK活性以及糖酵解指標的影響，通過調控AMPK的活性來改變糖酵解的進程進而影響肉質，無疑是改善肉品品質的新思路。

本研究以不同飼養(yǎng)條件下（放牧和圈養(yǎng)）12 月齡蘇尼特羊背最長肌為實驗材料，對AMPK活力、AMPK基因mRNA相對表達量以及糖酵解指標進行測定，并分析了AMPK與糖酵解指標之間的相關性，旨在為通過調控AMPK活性改善宰后肉品品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取來自內蒙古巴彥淖爾市海流圖鎮(zhèn)12 月齡蘇尼特羊放牧和圈養(yǎng)各10 只，其中每種飼養(yǎng)方式公母各半，體質量（43.56±6.24）kg，胴體質量（21.29±4.69）kg。宰后1 h內取背最長肌，切成100 mg小塊，立即放入無酶無菌凍存管中，投入液氮中冷凍保存，然后置于-80 ℃冰箱中，作為實驗用材料。

RNAiso Plus RNA提取裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM實時熒光定量試劑盒 大連寶生物工程有限公司；DNase/RNase-free無菌水 北京天根生物技術有限責任公司；綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、己糖激酶測定試劑盒、乳酸測定試劑盒、肌/肝糖原測定試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒（二喹啉甲酸比色法） 南京建成生物工程研究所；Tris-HCl緩沖液、D-甘露醇 美國Amresco公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA） 美國Sigma公司；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT） 德國Merck公司；氟化鈉、焦磷酸鈉 天津永大化學試劑廠；濃硫酸、氯化鈉國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pH-STAR型胴體pH值直測儀 德國Matthaus公司；TC-P2A全自動測色色差計 上海生物生化實驗儀器公司；CL-M嫩度儀 上海精密科學儀器有限公司；5417R低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf生物公司；CFX96TM實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；BG-power 3500型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平電泳槽北京百晶生物技術有限公司；PCR擴增儀 北京北方華奧貿易有限責任公司；TU-1810紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；XHF-DY高速分散器寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AMPK的活力測定

取保存于-80 ℃冰箱的樣品約0.3 g，按照1∶5（m/V）的比例加入保存于4 ℃冰箱的冷凍勻漿液（0.25 mol/L的D-甘露糖、5 mmol/L的焦磷酸鈉、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）、1 mmol/L的DTT、1 mmol/L的EGTA、1 mmol/L的EDTA、50 mmol/L的氟化鈉），在3 000 r/min的條件下冰浴勻漿。4 ℃、10 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液用于AMPK活力的測定。AMPK活力的測定步驟以及計算參照綿羊p-AMPK酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進行。

1.3.2 AMPK基因相對表達量的測定

1.3.2.1 總RNA的提取及檢測

依據RNAiso Plus試劑盒的說明書對肌肉中總RNA進行提取[10]。將提取的總RNA置于核酸蛋白分析儀上檢測其質量濃度和純度（A260nm/A280nm）。并用1%（質量分數，下同）的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA的完整性。

1.3.2.2 反轉錄

按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄操作，將合成的cDNA質量濃度稀釋至50 ng/μL。將反轉錄得到的產物置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.2.3 引物序列來源及合成

PRKAA1、PRKAA2、PRKAG3以及GAPDH（內參基因）基因引物序列參照馬曉冰的設計[12]，由華大科技基因有限公司合成（表1）。

表1 實時熒光PCR引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.2.4 實時熒光PCR擴增

本實驗按照CFX96TM實時熒光PCR檢測系統(tǒng)的二步法進行操作。以1.3.2.2節(jié)所合成的cDNA為模板，使用實時熒光定量試劑盒進行實時熒光PCR擴增[11]。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq II（2×）12.5 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL；DNA模板（50 ng/μL）2.0 μL；dH2O 8.5 μL；共25.0 μL。實時熒光PCR條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10min。產物保存于4 ℃冰箱。

1.3.2.5 實時熒光PCR產物檢測

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在120 V的電壓下進行電泳檢測，使用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.2.6 基因相對表達量的計算

本實驗采用2?ΔΔCt計算法對實時熒光定量PCR數據進行處理和分析，2?ΔΔCt為相對表達量，ΔΔCt＝（處理組目的基因Ct值-處理組內參基因Ct值）-（未處理組目的基因Ct值-未處理組內參基因Ct值）[13]。

1.3.3 糖酵解指標的測定

己糖激酶活力的測定按照己糖激酶測定試劑盒的說明書進行操作；乳酸含量的測定按照乳酸測定試劑盒的說明書進行操作；肌糖原含量測定按照肝/肌糖原測定試劑盒的說明書進行操作。

1.3.4 肉品品質相關指標的測定

1.3.4.1 pH值的測定

在屠宰后45 min時，使用胴體直測式pH計測胴體初pH值，記為pH1；靜置排酸24 h后測胴體最終pH值，記為pH24。

1.3.4.2 色澤的測定

使用TC-P2A全自動色差儀對肉色進行測定，L*值表示亮度，b*值為黃度，a*值表示紅度。每個樣品選取3 個位置，重復測定后取平均值。

1.3.4.3 嫩度的測定

沿肌肉方向取2.5 cm×3.0 cm×5.0 cm的肌肉塊，用自封袋密封后水浴加熱（75 ℃、45 min），冷卻至室溫后沿著肌纖維的方向將肉塊切成3 cm×1 cm×1 cm的條狀，使用CLM-3型嫩度儀對剪切力值進行測定。

1.4 數據統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0數據分析軟件進行統(tǒng)計分析，所有數值以表示。以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼養(yǎng)方式對肉質指標的影響

表2 不同飼養(yǎng)方式下的肉質指標（n＝10）Table 2 Meat traits under different feeding conditions (n= 10)

由表2可知，放牧條件下蘇尼特羊背最長肌的剪切力值顯著大于圈養(yǎng)條件（P＜0.05），這可能與不同飼養(yǎng)方式下骨骼肌肌纖維的發(fā)育、肌肉脂肪的含量以及水分含量有關[3,14]。放牧條件下蘇尼特羊背最長肌的L*值、a*值以及b*值均大于圈養(yǎng)條件，其中L*值和b*值差異顯著（P＜0.05）。兩種飼養(yǎng)方式的pH1值和pH24值差異不顯著（P＞0.05），研究表明不同飼養(yǎng)方式下18 月齡衛(wèi)山羊羯羊的pH24值差異不顯著[15]，與本實驗結果一致，這可能是因為pH值還受到其他因素的共同影響。

2.2 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊AMPK活力和基因相對表達量的影響

2.2.1 飼養(yǎng)方式對AMPK活力的影響

本實驗用AMPK磷酸化水平代表AMPK活力，不同飼養(yǎng)方式12 月齡蘇尼特羊背最長肌的AMPK活力分別為：放牧條件（8.83±1.07）ng/mL、圈養(yǎng)條件（9.51±1.30）ng/mL。結果表明，放牧條件下蘇尼特羊AMPK活力低于圈養(yǎng)條件下，但兩種飼養(yǎng)方式差異不顯著。AMPK活力會受到運動、缺氧、缺血、應激等多種因素的影響[16-18]，圈養(yǎng)條件下，蘇尼特羊背最長肌AMPK活力高于放牧條件，推測原因可能是由于圈養(yǎng)的羊和放牧的羊相比，宰前應激反應比較大，導致AMPK的活力升高。但兩種飼養(yǎng)方式AMPK活力差異不顯著（P＞0.05），說明飼養(yǎng)方式對AMPK活力影響較小。

2.2.2 AMPK基因相對表達量測定結果

2.2.2.1 總RNA提取結果

背最長肌肌肉組織中提取的總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像結果如圖1所示（以其中3 個樣品為例）。

圖1 總RNA電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

如圖1所示，提取的總RNA 3 條條帶（28S、18S、5S）完整且清晰明亮，說明所提取的總RNA并無降解。經核酸蛋白分析儀檢測，A260nm/A280nm均在1.8～2.1之間，說明提取的總RNA的純度高，并未被污染，可用于后續(xù)的反轉錄實驗。

2.2.2.2 實時熒光PCR產物結果

圖2 各基因PCR產物電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of the genes

內參基因和各目的基因經實時熒光PCR反應后，得到大量擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像結果如圖2所示。圖中4 個基因的條帶單一且清晰明亮，說明經PCR反應后得到的擴增產物單一，沒有引物二聚體和非特異性產物，將目的基因的片段與DL1000 DNA Marker比較，其條帶大小與所設計的引物目的產物片段大小相一致，說明所設計的引物反應性能良好，符合實時熒光PCR實驗要求，經實時熒光PCR后的產物為本實驗所需產物。

2.2.2.3 AMPK基因表達規(guī)律

AMPK以異源三聚體的形式存在于生物體中，由α、β、γ3 種亞基構成，其中α是催化亞基，β和γ是調節(jié)亞基[19]。每個亞基又存在不同的亞型，如α1和α2，β1和β2，γ1、γ2和γ3[20]。由于α是催化亞基，所以目前對AMPK α1和α2這兩個亞基的功能等方面的相關研究比較多，因為γ3亞基在骨骼肌中具有高表達[21]，且有研究表明PRKAG3基因與糖代謝有關[22-23]，所以本實驗選擇分別編碼α1、α2和γ3亞基的PRKAA1、PRKAA2和PRKAG3基因來分析AMPK的mRNA相對表達量。不同飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊的PRKAA1、PRKAA2以及PRKAG3基因相對表達量如圖3所示。

圖3 AMPK部分亞基基因表達水平Fig. 3 Gene expression of some subunits of AMPK

如圖3所示，不同飼養(yǎng)條件下，蘇尼特羊PRKAA1和PRKAG3基因的相對表達量均為圈養(yǎng)條件高于放牧條件，且差異顯著（P＜0.05），而PRKAA2基因相對表達量為放牧條件顯著大于圈養(yǎng)條件（P＜0.05）。AMPK α1亞基主要在脂肪細胞中表達[24]，由于圈養(yǎng)蘇尼特羊比放牧蘇尼特羊含有更多的脂肪組織，這可能導致編碼AMPK α1亞基的PRKAA1的相對表達量增高。研究表明耐力訓練會導致AMPK α2亞基蛋白和基因相對表達量顯著增加[25]。較圈養(yǎng)羊而言，放牧的蘇尼特羊處于長期運動的生長狀況下，可能會導致編碼AMPK α2亞基的PRKAA2基因相對表達量顯著增加。放牧條件PRKAG3基因相對表達量顯著小于圈養(yǎng)條件，可能是由于PRKAG3基因在ⅡB型肌纖維中表達量較高[26]，而圈養(yǎng)條件下蘇尼特羊背最長肌的ⅡB型肌纖維數量要高于放牧條件[3]。以上結果表明，飼養(yǎng)方式對AMPK的基因相對表達量有顯著影響。

2.3 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊宰后糖酵解指標的影響

表3 不同飼養(yǎng)方式糖酵解指標（n＝10）Table 3 Glycolysis indicators under different feeding conditions (n= 10)

不同飼養(yǎng)條件下蘇尼特羊背最長肌宰后糖酵解指標測定結果如表3所示，蘇尼特羊背最長肌己糖激酶的活力為圈養(yǎng)條件高于放牧條件，但兩種飼養(yǎng)方式差異不顯著（P＞0.05）；乳酸含量也為圈養(yǎng)條件大于放牧條件，且差異顯著（P＜0.05）；放牧條件下肌糖原含量高于圈養(yǎng)條件，但差異不顯著（P＞0.05）。不同飼養(yǎng)方式會對AMPK的活力以及基因相對表達量有所影響，研究表明AMPK活力會進一步影響糖酵解指標[27]，這就造成了糖酵解指標在不同飼養(yǎng)方式下的差異。

2.4 AMPK與糖酵解指標及肉品品質的相關性

2.4.1 AMPK活力與糖酵解指標及肉品品質的相關性

表4 AMPK活力與糖酵解指標及肉品質的相關性Table 4 Correlation coefficients between relative AMPK activity and glycolysis indices and meat quality

由表4可知，AMPK活力與己糖激酶活力以及乳酸含量均呈顯著正相關（P＜0.05），與肌糖原含量相關程度很低（P＞0.05），與剪切力、色澤以及pH值均呈負相關（P＜0.05）。Shen Qingwu W.等[28]向小鼠體內腹腔注射AMPK的抑制劑——復合物C，研究顯示復合物C抑制了宰后小鼠背最長肌中AMPK的活力以及糖酵解進程。這說明AMPK可以調控宰后動物肌肉的糖酵解。

2.4.2 AMPK基因相對表達量與AMPK活力、糖酵解指標以及肉品品質的相關性

表5 AMPK基因相對表達量與AMPK活力、糖酵解指標及肉品質的相關性Table 5 Correlation coefficients between relative expression of AMPK gene and AMPK activity, glycolysis and meat quality

由表5可知，PRKAA1、PRKAA2和PRKAG3基因相對表達量均與AMPK活力呈正相關，其中PRKAG3基因相對表達量均與AMPK活力呈顯著正相關（P＜0.05），說明這3 個基因的相對表達量與AMPK活力變化趨勢相一致。PRKAA1和PRKAG3基因相對表達量與己糖激酶活力呈正相關，其中PRKAG3基因相對表達量與己糖激酶活力呈顯著正相關（P＜0.05），而PRKAA2基因相對表達量與己糖激酶活力呈負相關，但相關程度較低。PRKAA1和PRKAG3基因相對表達量均與乳酸含量呈顯著正相關（P＜0.05）。3 個基因的相對表達量與肌糖原含量均呈負相關，但相關程度較低。PRKAG3基因相對表達量與剪切力呈顯著負相關（P＜0.05），有研究對PRKAG3基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）關聯(lián)性進行分析，表明T2885C這個SNP與剪切力有密切的聯(lián)系，可以作為未來肉牛選育的輔助標記[29]，這說明PRKAG3基因的相對表達量對肌肉的嫩度有所影響。

以上結果表明，PRKAA1和PRKAG3基因的相對表達量對糖酵解指標有一定的影響，而PRKAA2基因的相對表達量對糖酵解指標影響較小，即AMPK α1亞基和AMPK γ3亞基在機體內相對表達量高時，AMPK活力增加，AMPK活化后促使糖酵解的關鍵酶己糖激酶的活力增加，從而加速動物宰后糖酵解的進程，使得乳酸大量堆積。乳酸是影響動物宰后pH值的重要因素，pH值又是影響肉品品質的關鍵指標，這說明AMPK可以通過調控動物宰后糖酵解的進程從而對肉品品質產生影響。也有相關研究表明不同條件下肉質會發(fā)生改變，可能是由于AMPK對糖酵解的關鍵酶己糖激酶、果膠酯酶和乳酸脫氫酶活力的調節(jié)，進而改變了糖酵解的速率和程度，最終對肉品品質產生影響[30-31]。

3 結 論

通過對蘇尼特羊放牧和圈養(yǎng)兩種方式下AMPK活力、AMPK mRNA相對表達量以及糖酵解指標進行測定，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)條件下PRKAA1以及PRKAG3基因表達均顯著高于放牧條件，并且AMPK的活力、己糖激酶活力和乳酸含量也高于放牧條件。說明PRKAA1以及PRKAG3基因相對表達量升高會使AMPK的活力增加，AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路中的關鍵酶己糖激酶，使己糖激酶活力增加，從而促進糖酵解進程，產生大量乳酸，導致宰后動物肌肉的pH值下降，對肉品品質產生一定影響。因此，未來可通過調控AMPK的活力以改善不同飼養(yǎng)方式下的肉質。

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