南極磷蝦抗凍蛋白熱滯活性的差示掃描量熱法評(píng)價(jià)

馬慶保，劉志東*

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

生活于低溫環(huán)境的生物體，為了抵御低溫脅迫，會(huì)適應(yīng)性地產(chǎn)生一種具有抗凍活性的特殊蛋白質(zhì)——抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs），亦稱為冰結(jié)合蛋白或冰結(jié)構(gòu)蛋白。AFPs是一類以非依數(shù)性形式降低體系冰點(diǎn)、改變冰晶形態(tài)、抑制冰晶生長、防止冰晶對(duì)生物體細(xì)胞造成的損傷和致死的特殊蛋白質(zhì)[1]。AFPs能夠降低體系的冰點(diǎn)，但對(duì)體系的融點(diǎn)卻影響較小；因此，導(dǎo)致了體系的融點(diǎn)和冰點(diǎn)出現(xiàn)差值，這個(gè)差值稱為熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）[2]。

THA是評(píng)價(jià)AFP抗凍活性的重要指標(biāo)，目前評(píng)價(jià)THA的方法主要有毛細(xì)管單晶生長觀察法，納升滲透壓法和差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法等。毛細(xì)管單晶生長觀察法是最早用于THA測(cè)定的方法，該法不需要大型的儀器設(shè)備，但操作過程較復(fù)雜、耗時(shí)長，而且人為誤差較大[3-4]。納升滲透壓法主要基于珀?duì)柼韺?shí)現(xiàn)控溫[5-8]，但該法依然依靠人工觀察完成，容易出現(xiàn)誤差，溫度的變化速率和波動(dòng)也無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的控制[4]。DSC法主要是基于樣品結(jié)晶過程中吸熱和放熱的變化，檢測(cè)體系發(fā)生的物理變化，精確迅速測(cè)定熱容和熱焓，從而確定真實(shí)的結(jié)晶起始溫度，進(jìn)而獲得樣品的THA，并能精確測(cè)定體系的冰晶含量[9]。DSC法能夠精確測(cè)定體系的吸熱和放熱，反映AFPs特殊的相變和熱力學(xué)行為。DSC法因其穩(wěn)定性和精確性，得到了越來越廣泛的應(yīng)用[10-11]。

南極磷蝦（Euphausia superba Dana）是一種生活在南極海域的小型浮游類海洋動(dòng)物，生物量巨大（約為6.5億～10.0億 t）[12-15]。因此，南極磷蝦己經(jīng)成為近年來食品科學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)[16]。南極磷蝦生活于南極海域冰冷的海水中（水溫約為-1.9 ℃）[17]，研究表明南極磷蝦主要依靠AFPs應(yīng)對(duì)南極海域的低溫脅迫[17-18]。作為一種潛在、廣泛的天然AFPs來源，南極磷蝦AFPs具有重要的應(yīng)用前景；對(duì)于提高南極磷蝦附加值也具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以純化的南極磷蝦AFPs為研究對(duì)象，采用DSC法評(píng)價(jià)其THA；重點(diǎn)考察了升降溫速率、南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度、冰晶含量、緩沖體系等參數(shù)對(duì)THA的影響，以為AFPs的評(píng)價(jià)研究及抗凍機(jī)理提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦由上海開創(chuàng)遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司2016年11月于南極設(shè)得蘭群島海域捕獲，冷藏運(yùn)回國內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃貯藏備用；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone真空冷凍干燥機(jī) 美國LABCONCO公司；204 F1 DSC儀 德國NETZSCH公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦AFPs的提取

以南極磷蝦蛋白為原料提取南極磷蝦AFPs，參照Kuiper等[19]方法構(gòu)建特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFPs，將提取的南極磷蝦AFPs進(jìn)行真空冷凍干燥。采用pH 7.8的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）分別配制不同質(zhì)量濃度的AFPs溶液和BSA溶液。

1.3.2 南極磷蝦AFPs的SDS-PAGE電泳

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行南極磷蝦AFPs的純度鑒定，按照5∶1（V/V）的比例將樣品與上樣緩沖液混合，置于沸水中煮沸5 min，取15 μL樣品上樣，12.5%分離膠和4.0%濃縮膠，樣品在120 V恒壓條件下進(jìn)行電泳。電泳完畢后，將凝膠置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的考馬斯亮藍(lán)R-250中染色2 h，在醋酸脫色液中脫色至背景無色，采用凝膠分析儀進(jìn)行拍照。

1.3.3 DSC法測(cè)定樣品的THA

采用DSC法測(cè)定南極磷蝦AFPs的THA，以BSA為對(duì)照。參照Ding Xiangli等[20]的方法稍作改動(dòng)。將10 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的南極磷蝦AFPs密封于鋁制坩堝中，放置在樣品池中央，以空鋁皿為參比。設(shè)備穩(wěn)定后，以1.0 ℃/min的升降溫速率從室溫降溫至-30 ℃，然后升溫至20 ℃，再降溫至-30 ℃，獲得南極磷蝦AFPs的熔融焓（ΔHm）和熔點(diǎn)（Tm）。接著，從-30 ℃緩慢升溫至樣品體系為固液混合物狀態(tài)，稱為保留溫度（Th），停留5 min，使冰晶完全孵化，再將溫度從Th降低至-30 ℃，重復(fù)上述過程，在不同的Th下停留5 min。記錄不同Th下，樣品結(jié)晶的起始溫度（T0）和結(jié)晶焓（ΔHf）。按照公式（1）和（2）計(jì)算樣品的THA和冰晶含量。

1.3.4 DSC法測(cè)定THA條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[10]，考察DSC法測(cè)定南極磷蝦AFPs的THA影響因素，優(yōu)化其評(píng)價(jià)條件以獲得最佳的測(cè)定條件。

1.3.4.1 升降溫速率對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響

分別選取升降溫速率為0.50、0.75、1.00、2.50、5.00 ℃/min，南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，以PBS為緩沖體系開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察升降溫速率對(duì)南極磷蝦AFPs的THA的影響。

1.3.4.2 南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響

分別選取南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/mL，升降溫速率為1 ℃/min，以PBS為緩沖體系開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響。

1.3.4.3 冰晶含量對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響

采用DSC法測(cè)定THA時(shí)，冰晶含量與Th有著密切的關(guān)系，Th越接近平衡熔點(diǎn)，冰晶含量就越小。因此，分別選取-2.3～-3.0 ℃間不同的Th，南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，升降溫速率為1 ℃/min，以PBS為緩沖體系開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察冰晶含量對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響。

1.3.4.4 緩沖體系對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響

將南極磷蝦AFPs分別溶解于水、PBS、Tris-鹽酸不同的緩沖體系，并以BSA為對(duì)照，南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，升降溫速率為1 ℃/min開展實(shí)驗(yàn)。以THA為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察緩沖體系對(duì)THA評(píng)價(jià)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE對(duì)南極磷蝦AFPs分子質(zhì)量及純度的鑒定

圖1 南極磷蝦AFPs的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profile of AFPs

通過SDS-PAGE對(duì)南極磷蝦AFPs的分子質(zhì)量及純度進(jìn)行鑒定，由圖1可知，樣品呈現(xiàn)單一條帶，無其他雜帶。結(jié)果表明，所提取的南極磷蝦AFPs具有較高的純度，分子質(zhì)量約為76 kDa。

2.2 南極磷蝦AFPs的THA

由圖2和表1可知，AFPs由完全結(jié)冰被加熱到不同的保留溫度Th，從不同Th開始降溫時(shí)，已融化的部分沒有立即結(jié)冰，而是出現(xiàn)了冰點(diǎn)的滯后現(xiàn)象，Th與T0之間相差較大，這表明南極磷蝦AFPs具有THA。而BSA從不同Th開始降溫時(shí)，已融化的部分立即結(jié)冰，Th等于T0，沒有出現(xiàn)冰點(diǎn)的滯后現(xiàn)象，即BSA沒有表現(xiàn)出THA。因此，DSC法可以用于測(cè)定南極磷蝦AFPs的THA。冰晶含量為11.02%時(shí)，南極磷蝦AFPs的THA為1.76 ℃。

由圖2A和表1也可知，隨著Th的升高，冰晶含量不斷的下降，南極磷蝦AFPs的THA呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，Th為-2.60 ℃時(shí)，冰晶含量為5.79 %，THA達(dá)到了2.74 ℃，此時(shí)的THA可能是由于過冷現(xiàn)象造成的。冰晶結(jié)晶過程中，是以體系中已含有的冰晶為冰核開始結(jié)晶，體系中冰晶含量越少，冰晶表面AFPs的吸附覆蓋程度越高，AFPs抑制冰晶繼續(xù)生長的作用就越強(qiáng)，其溶液完全結(jié)晶所需的時(shí)間就越長，測(cè)得的THA也就越高[21]。但若AFPs溶液中任意一個(gè)區(qū)域內(nèi)都沒有形成至少一個(gè)足夠大的冰核，此時(shí)水分子無法包圍著晶核結(jié)冰，使得溶液出現(xiàn)過冷現(xiàn)象，從而造成冰點(diǎn)比熔點(diǎn)低很多，但此時(shí)所測(cè)定的冰點(diǎn)并沒有真實(shí)地反映南極磷蝦AFPs的THA。

圖2 AFPs與BSA的DSC熱流曲線Fig. 2 DSC curves of partially melted AFPs and BSA

表1 AFPs與BSA的Th、T0、冰晶含量和THATable 1 Hold and onset temperature (Th and T0), ice fraction and THA of AFPs and BSA

2.3 DSC法測(cè)定THA的條件優(yōu)化

DSC法是一種熱分析方法，能夠通過測(cè)定升、降溫過程中熱焓的變化直接反映樣品冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間的差異，獲得其THA。這種方法避免了直接觀察法容易引入人為誤差的缺陷[21]。但是由于AFPs來源和特性的不同，采用DSC法測(cè)定AFPs是的THA時(shí)，可能受到一些因素的影響，如樣品質(zhì)量濃度、升降溫速率、冰晶含量和緩沖體系等的影響。因此，需要對(duì)其評(píng)價(jià)條件進(jìn)行優(yōu)化[22-23]。

2.3.1 升降溫速率對(duì)THA的影響

圖3 不同升降溫速率下AFPs的DSC熱流曲線圖Fig. 3 DSC curves of AFPs at different cooling rates

從圖3中可以看出，除過冷狀態(tài)，當(dāng)升降溫速率為5.00 ℃/min時(shí)，THA都超過2 ℃。如圖3A所示，Th為-2.30 ℃，THA為2.92 ℃；當(dāng)升降溫速率為2.50 ℃/min時(shí)，THA在2.00 ℃左右；而當(dāng)升降溫速率為1.00、0.75、0.50 ℃/min時(shí)，如圖3F所示，THA都穩(wěn)定在1.70 ℃左右。因此，當(dāng)升降溫速率較快時(shí)，THA呈現(xiàn)被升高狀態(tài)，這可能是由于過高的升降溫速率使得體系的換熱不充分，冰晶凍結(jié)的滯后現(xiàn)象被放大[11]，熱流曲線圖上的表現(xiàn)為在-10 ℃以下，體系依然處于結(jié)晶狀態(tài)。

當(dāng)升降溫速率為0.50～1.00 ℃/min時(shí)，樣品結(jié)晶時(shí)放熱處于相對(duì)正常的范圍，體系換熱充分。因此，能夠測(cè)得相對(duì)穩(wěn)定的南極磷蝦AFPs的THA。但升降溫的速率過低，耗時(shí)太長，因此，選擇1.00 ℃/min作為升降溫速率較為合適。這也與多數(shù)研究中選擇的升降溫速率相吻合[24-26]。

2.3.2 樣品質(zhì)量濃度對(duì)THA的影響表2 不同質(zhì)量濃度AFPs的Th、T0、冰晶含量和THA

圖4 不同質(zhì)量濃度AFPs的DSC熱流曲線圖Fig. 4 DSC curves of AFPs at different concentrations

表2 不同質(zhì)量濃度AFPs的Th、T0、冰晶含量和THATable 2 Th, T0, ice fractions and THA of AFPs at different concentrations

由圖4和表2可知，隨著南極磷蝦AFPs質(zhì)量濃度的增加，THA先快速升高；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL后，THA的變化趨向于平穩(wěn)，THA的增量收窄。因此，南極磷蝦AFPs的THA在一定的范圍內(nèi)呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。其他研究也表明，部分AFPs的THA具有質(zhì)量濃度依賴性，THA不僅需要AFPs分子吸附于冰晶上，還需要溶液中有自由AFPs分子的存在[27-30]。基于吸附抑制機(jī)理可知，AFPs吸附于冰晶的部分表面，而非整個(gè)表面，以一種類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形式存在，AFPs分子彼此之間存在一定的間隔[31-33]。AFPs會(huì)改變冰水界面的局部表面張力，干擾其所覆蓋的冰晶生長，使得其所覆蓋區(qū)域的冰晶生長受到抑制，而其他區(qū)域不受抑制[34]。當(dāng)所吸附的AFPs彼此之間的平均間隔等于或小于兩倍的冰晶冰峰臨界曲率半徑時(shí)，冰晶的生長就會(huì)受到抑制。因此，如果AFPs的質(zhì)量濃度過低，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)AFPs分子之間的距離過大，冰晶生長的抑制效果就會(huì)較差，THA表現(xiàn)的較低。

目前的研究也表明，在某些AFPs（如魚類AFPs）中，THA與AFPs分子和冰晶面的結(jié)合速率以及其質(zhì)量濃度密切相關(guān)，THA在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈依賴關(guān)系，通常與AFPs質(zhì)量濃度的平方根成正比[1,30,35]。而對(duì)于高活性AFPs（如昆蟲AFPs），其能夠與冰晶的基面結(jié)合[36-37]，當(dāng)將吸附了AFPs分子的冰晶周圍環(huán)境的AFPs除去后，THA依然保持不變，這表明，其THA不直接依賴于溶液中的AFPs的質(zhì)量濃度，而與AFPs分子在冰晶面上的表面密度相關(guān)[1,34,38]。

2.3.3 冰晶含量對(duì)THA的影響

研究表明，冰晶的含量與粒徑會(huì)對(duì)THA產(chǎn)生影響[39-40]。當(dāng)冰晶的含量和粒徑足夠小時(shí)，冰晶所吸附的AFPs的數(shù)量很少。因此，當(dāng)THA評(píng)價(jià)時(shí)剩余樣品溶液中AFPs的質(zhì)量濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，若冰晶含量或粒徑過大，剩余樣品溶液中AFPs的質(zhì)量濃度因大量吸附而降低，AFPs在冰晶表面的吸附度會(huì)降低，這將導(dǎo)致THA的降低[27]。采用傳統(tǒng)方法或者納升滲透壓計(jì)法測(cè)定AFPs的THA時(shí)，體系中都是僅保留一個(gè)冰晶，通過顯微鏡觀察冰晶的生長情況，以獲得樣品的THA，盡量降低冰晶含量和粒徑對(duì)THA的影響，存在人為誤差。采用DSC法測(cè)定時(shí)，雖然無法直接觀察到冰晶的情況，但可以通過計(jì)算（公式2）獲得樣品中的冰晶含量。

圖5 不同Th下樣品的冰晶含量與THA間的關(guān)系Fig. 5 Relationship between ice crystal fraction and THA of AFPs at different Th

先前的研究指出，冰晶含量在0.13%～10.00%間，THA與冰晶含量呈現(xiàn)冪指數(shù)函數(shù)的增長關(guān)系[40]，而當(dāng)冰晶含量在10%～90%時(shí)，THA就會(huì)呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值[11,20]。由圖5可知，當(dāng)冰晶含量低于4%時(shí)，出現(xiàn)樣品的過冷現(xiàn)象，即樣品在零下十幾度才會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象，不能將其用于真實(shí)THA的計(jì)算。相反，當(dāng)冰晶含量高于20%時(shí)，樣品立刻結(jié)冰，檢測(cè)不到THA；冰晶含量在4%～20%之間時(shí)，THA呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；冰晶含量為4%～10%之間時(shí)，THA普遍超過2 ℃，這可能是由于部分過冷造成；冰晶含量在10%～15%之間時(shí)，THA最為穩(wěn)定，在1.7 ℃附近波動(dòng)；隨著冰晶含量的繼續(xù)升高，THA開始降低。因此，冰晶含量應(yīng)在10%～15%之間，這也與Ding Xiangli等[20]的研究結(jié)果相近。

2.3.4 緩沖體系對(duì)THA的影響

圖6 不同緩沖體系中南極磷蝦AFPs和BSA的DSC熱流曲線圖Fig. 6 DSC curves of AFPs and BSA in different buffer systems

表3 不同緩沖體系A(chǔ)FPs樣品與BSA的Th、T0、冰晶含量和THATable 3 Th, T0, ice fractions and THA of AFPs and BSA in different buffer systems

采用了不同的緩沖體系，如Tris-鹽酸緩沖液（pH 8.0）[41]、PBS（pH 7.4）[24]開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。不同緩沖體系對(duì)南極磷蝦AFPs THA的影響如圖6和表3所示。BSA無論在任何緩沖體系中都沒有表現(xiàn)出THA，南極磷蝦AFPs在水中的THA僅為0.08 ℃，在pH值都為7.8的PBS緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液，THA較為接近，分別為1.62、1.67 ℃，這表明不同緩沖體系能夠影響AFPs的THA。

研究表明AFPs的冰晶結(jié)合位點(diǎn)是相對(duì)疏水的，將AFPs溶解于水中，其冰晶結(jié)合位點(diǎn)可能無法完全展開，活性因此受到抑制，引起THA的下降[42-43]。此外，低分子質(zhì)量的溶質(zhì)以及鹽離子可能也會(huì)對(duì)THA造成影響[44-49]，通常，能夠?qū)FPs的THA提高數(shù)倍[44]，如Xu Yao等[29]將AFP-Ⅲ樣品分別溶于水和0.5 mol/L的檸檬酸鈉溶液，溶于水中的AFP-Ⅲ樣品的THA呈線性下降。即使是同一種緩沖液，體系pH值的影響也較大，如Tris-鹽酸緩沖液，體系pH值為7.2[50]、7.5[51]、8.0[41]等，但都為偏堿性的條件。鹽離子及pH值對(duì)南極磷蝦AFPs的THA的確切影響，在后面的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)重點(diǎn)考察。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以純化的南極磷蝦AFPs為研究對(duì)象，采用DSC法評(píng)價(jià)了影響其THA的因素。研究結(jié)果表明，南極磷蝦AFPs的分子質(zhì)量約為76 kDa，THA為1.76 ℃。優(yōu)化確定DSC法評(píng)價(jià)南極磷蝦AFPs的THA升降溫速率為1.00 ℃/min，樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，冰晶含量為10%～15%之間。此外，緩沖體系對(duì)THA也有較大的影響，通常選擇偏堿性的緩沖溶液體系。鹽離子含量、種類及體系pH值等對(duì)南極磷蝦AFPs的THA影響仍待后續(xù)深入研究。

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