抗凍酵母的篩選及發(fā)酵特性研究

薛美翠汪立平, 郝彥利 王正全 趙 勇 黃宇良

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2. 上海洋大學(xué)食品學(xué)院上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

普通商業(yè)酵母在低溫條件下易受冷凍迫害且解凍后不能保留應(yīng)有的發(fā)酵力，從而影響發(fā)酵面制食品的風(fēng)味和口感，因此不能應(yīng)用于冷凍面團的制作。采用耐凍性能好的酵母制作冷凍面團是制約冷凍面團技術(shù)的一個關(guān)鍵因素[1]。

目前，國外報道的抗凍酵母戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)[2]、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FRI-413[3]和FRI-802[4]、耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthermotoleras)FRI-501[5]，均是通過自然篩選方式得到的，并且已經(jīng)應(yīng)用到實際面包生產(chǎn)行業(yè)當(dāng)中。中國也有研究者[6-7]通過自然篩選的方法得到抗凍酵母，但是沒有應(yīng)用到實際工業(yè)生產(chǎn)中的報道。此外，近幾年由于分子技術(shù)的發(fā)展，很多研究者開始從影響酵母抗凍機理方面進行研究，采用分子育種方法得到抗凍酵母。已有報道表明，細胞內(nèi)的幾種化合物含量影響細胞對凍融壓力的耐受性，這些化合物包括海藻糖[8-9]、甘油[10]、脯氨酸[11]及精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等帶電荷氨基酸[12]。Sun等[8]通過表達MAL62基因增加胞內(nèi)海藻糖含量，進而提高細胞的抗凍能力；Dong等[9]通過敲除基因NTH1增加胞內(nèi)海藻糖含量，進而提高細胞的抗凍能力。甘油脫氫酶(GDH)主要參與甘油的代謝過程，Izawa等[10]將GDH基因敲除，從而增加胞內(nèi)甘油含量，使細胞存活率增大。Takagi等[12]發(fā)現(xiàn)其他帶電荷氨基酸包括谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和脯氨酸的抗冷凍能力等同于海藻糖和甘油，都被認為是酵母細胞的冷凍保護劑。Tsolmonbaatar等[11]將PRO1基因突變，從而使菌株胞內(nèi)脯氨酸含量增加，進而增加細胞的抗凍作用；精氨酸酶由CAR1基因編碼，Shima等[13]通過敲除CAR1基因，證實了胞內(nèi)精氨酸含量的積累會增加細胞的抗凍性。為了提高細胞的存活率，研究者提出了其他的方法與技術(shù)，包括添加劑的應(yīng)用，例如抗凍蛋白[14](antifreeze proteins, AFPs)、親水膠體[15]；改善冷凍工藝，例如James等[16]提出，緩慢的冷凍速率會形成對組織細胞造成迫害的大冰晶，而過快的冷凍速率同樣也會對細胞存活率有消極的影響，因此，在應(yīng)用冷凍面團技術(shù)時，應(yīng)該根據(jù)不同生產(chǎn)工藝選擇合適的冷凍速率，從而保證細胞的存活率[17-18]；為了控制面團在冷凍期間形成的冰晶對酵母細胞的影響，超聲波輔助冷凍(UAF)也被應(yīng)用到冷凍食品行業(yè)[19]，Kiani等[20]的研究表明，在-4～-2 ℃ 時使用超生波輔助冷凍可能增加細胞的存活率，但是，該技術(shù)在冷凍面團行業(yè)的應(yīng)用非常局限，相關(guān)報道較少。

本研究擬從自然界篩選抗凍性好且冷凍后發(fā)酵力高的野生耐冷凍酵母菌。采用模擬面團預(yù)發(fā)酵法篩選耐冷凍酵母，分析胞內(nèi)化合物與細胞存活率、相對發(fā)酵力的相關(guān)性，考察胞內(nèi)化合物對存活率和相對發(fā)酵力的影響，總結(jié)出提高自然篩選法效率的方法，對冷凍面團技術(shù)應(yīng)用到中國傳統(tǒng)主食的生產(chǎn)具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團：來自東北、山東、河南、內(nèi)蒙古省的4個農(nóng)村地區(qū)；

市售發(fā)酵劑面包酵母：上海市農(nóng)工商超市，編號A-1，作為整個試驗過程的對照組；

DP307酵母菌DNA提取試劑盒：天根生物技術(shù)公司；

26S rDNA通用引物：上海生工生物技術(shù)公司；

海藻糖：標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，pH 6.0，溶解于1 L蒸餾水，用于酵母菌的初篩；

平板計數(shù)培養(yǎng)基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉20 g，pH 5.5，溶解于1 L蒸餾水，用于冷凍后酵母菌菌落計數(shù)，計算存活率。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計：UV2000型，上海尤尼柯有限公司；

冷凍離心機：H2050R型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

酸度計：pHS-3C型，上海虹益儀器廠；

PCR儀：H1650-W 型，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；

水平電泳儀：PYY-6C型，北京六一儀器廠；

凝膠成像儀：EC3 Imaging System型，美國UVP公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8800型，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 在無菌條件下，分別從4個樣品中取10 g面團加入90 mL生理鹽水(85%)中，無菌均質(zhì)5 min(12次/s)，梯度稀釋至10-7，各梯度取100 μL涂布于YPD平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，待平板長出菌落，將符合酵母菌細胞形態(tài)的菌落至YPD平板培養(yǎng)基多次劃線，直至完全純化。將市售發(fā)酵劑面包酵母溶解于生理鹽水后，直接用于平板劃線。將純化后的酵母菌種轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～4 d后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鮮酵母的制備 將酵母菌種從YPD斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入內(nèi)裝200 mL YPD 培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，蒸餾水洗滌2次，得到各菌株的鮮酵母泥。在105 ℃將鮮酵母烘干，測定鮮酵母烘干前后的質(zhì)量，計算含水率。

1.2.3 抗凍性試驗 根據(jù)文獻[6]修改如下：稱取0.4 g鮮酵母加入裝有50 mL模擬面團培養(yǎng)基的三角瓶中(模擬面團培養(yǎng)基的配置參照文獻[21])，30 ℃預(yù)發(fā)酵180 min后進行菌落計數(shù)。存活率定義為冷凍7 d后和冷凍1 h后酵母菌菌落數(shù)的百分比?？箖鲂栽囼炛貜?fù)6次。

1.2.4 酵母胞內(nèi)化合物含量測定

(1) 海藻糖含量測定：采用硫酸-蒽酮法[22]。酵母菌細胞內(nèi)的海藻糖用三氯乙酸提取，所得溶液僅有海藻糖存在[23]。胞內(nèi)海藻糖含量Wt(%，細胞干重)計算公式參考文獻[24]42。

(2) 甘油含量的測定：采用比色法測定[25]。胞內(nèi)甘油含量Wt(%，細胞干重)計算公式參考文獻[24]43。

(3) 胞內(nèi)氨基酸含量的測定：采用氨基酸分析儀測定[26]。以上所有酵母胞內(nèi)化合物重復(fù)測定次數(shù)為3次。

(4) 胞內(nèi)甘油和氨基酸的提?。簠⒄瘴墨I[27]。

1.2.5 酵母菌發(fā)酵力的測定 采用失重法[28]。用于發(fā)酵的營養(yǎng)液配比參照文獻[29]，準(zhǔn)確稱取2.5 g鮮酵母加入裝有50 mL營養(yǎng)液的三角瓶中，將酵母菌和發(fā)酵液混合均勻，蓋上發(fā)酵栓稱重后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱預(yù)發(fā)酵1 h。冷凍操作同1.2.3，將解凍后的發(fā)酵液放置恒溫培養(yǎng)箱中，記錄2 h 的產(chǎn)氣情況。通過冷凍7 d產(chǎn)氣量的變化來判斷酵母菌的發(fā)酵能力。相對發(fā)酵力定義為冷凍7 d后和冷凍1 h后CO2產(chǎn)氣量的比值。發(fā)酵力重復(fù)測定3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析處理 采用Origin 8.6進行數(shù)據(jù)處理和繪制圖表；采用SPSS 20.0軟件分析細胞存活率和酵母菌發(fā)酵力與胞內(nèi)化合物(海藻糖、甘油、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及總氨基酸)含量的相關(guān)性，單因素方差分析以P<0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.7 菌種鑒定 根據(jù)菌株菌落形態(tài)進行初步鑒定[30]，再通過26S rDNA 序列分析法鑒定酵母，對測序的結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進行核苷酸序列Blast比對分析，并用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗凍酵母的篩選

2.1.1 酵母菌的篩選 從4個酸面團中篩選得到具有典型酵母菌菌落特征的菌株共7株。對菌株進行編號，其中從內(nèi)蒙古面團中分離得到一株，編號N-1；河北面團中分離得到一株，編號H-1；山東面團中分離得3株，編號S-1、S-2、S-3；東北面團中分離得到2株，編號Y-3和Y-4。

2.1.2 抗凍酵母菌的篩選 按照1.2.3所示的方法，分別對7株酵母菌在模擬面團中預(yù)發(fā)酵3 h，測定冷凍7 d 和1 h 后的存活率，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，菌株Y-3和Y-4在模擬面團中預(yù)發(fā)酵3 h，冷凍7 d后存活率分別是86%和94%，存活率均高于已被報道的抗凍酵母菌的存活率[2,6]。其他菌株的存活率均在70%以下，對照組A-1菌株的存活率不到10%，說明對照組酵母菌對低溫特別敏感，不適于冷凍面團的制作。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 抗凍酵母胞內(nèi)海藻糖含量 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=6.671 4x-0.018 2，R2=0.997 0，用于海藻糖濃度的計算。酵母胞內(nèi)海藻糖含量見圖2。從圖2中可以得知，存活率最高的菌株Y-4其海藻糖含量最高為10.91%，而存活率次之的菌株Y-3，其海藻糖含量卻低于存活率不到70%的菌株S-1、S-2和N-1，經(jīng)方差分析得菌株Y-3與菌株S-1和N-1的海藻糖含量均不具有顯著性差異(P>0.05)，菌株Y-3與菌株S-2的海藻糖含量具有顯著性差異(P<0.05)。說明海藻糖對細胞存活率有一定的影響，但不是唯一決定細胞存活率的因素，與Hino等[31]報道的抗凍菌株FRI 501情況相同。

圖1 酵母菌在-20 ℃的存活率

圖2 酵母菌胞內(nèi)海藻糖含量

2.2.2 抗凍酵母胞內(nèi)甘油含量 甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=21.469x+0.001，R2=0.996 0，可用于甘油濃度的計算。從圖3中可以得知，菌株Y-3和Y-4的甘油含量遠遠高于其他抗凍性差的菌株的，通過單因素方差分析可知，甘油含量對細胞存活率的影響具有顯著性差異(P<0.05)。說明細胞內(nèi)甘油含量的積累對細胞存活率有影響，與已報道[10,32]的通過分子技術(shù)積累甘油的酵母細胞具有較高的抗凍性結(jié)果相同。

圖3 酵母胞內(nèi)甘油含量

2.2.3 抗凍酵母胞內(nèi)氨基酸含量 已有研究[11-12]表明脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸4種氨基酸均與細胞抗凍性有關(guān)，因此，本研究只對這4種氨基酸進行分析。酵母菌胞內(nèi)氨基酸含量測定結(jié)果見表1。從表1中可以看出，不同酵母菌氨基酸含量差異較大，通過單因素方差分析可知，4種氨基酸對細胞存活率均有顯著性影響(P<0.05)。菌株Y-4的存活率最高，但是其4種氨基酸的含量均低于存活率僅為31%的菌株S-3，且通過方差分析得知，菌株Y-4與S-3的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸均具有顯著性差異(P<0.05)；此外，除了酵母中沒有檢出脯氨酸，菌株H-1的天冬氨酸含量低于菌株Y-3，其他菌株的氨基酸含量均高于菌株Y-3的，且菌株Y-3與H-1的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸均具有顯著性差異(P<0.05)，與已報道[5,12,33]的細胞內(nèi)某些帶電荷氨基酸會影響到細胞耐冷凍率，但不是主要影響因素的結(jié)論一致。

表1 酵母菌胞內(nèi)氨基酸含量 Table 1 Intracellular amino acids level of yeasts mg/g

2.2.4 不同酵母相對發(fā)酵力的測定結(jié)果 從圖4中可以看出，冷凍1 h后菌株Y-3和N-1的發(fā)酵力低于對照組酵母A-1，并具有顯著性差異(P<0.05)；冷凍7 d 對對照組酵母A-1和菌株Y-3的發(fā)酵力影響最大，但不具有顯著性差異(P>0.05)，其他菌株的發(fā)酵力與對照組酵母的發(fā)酵力均具有顯著性差異(P<0.05)。

對照組酵母A-1和菌株Y-3的相對發(fā)酵力均為9%，菌株H-1的相對發(fā)酵力最高為67%，是對照組酵母發(fā)酵力的7倍之多，具有應(yīng)用到生產(chǎn)冷凍面團的潛在價值。

圖4 不同酵母的發(fā)酵力

2.2.5 胞內(nèi)化合物對細胞存活率及發(fā)酵力相關(guān)性 由表2可知，酵母胞內(nèi)海藻糖含量與細胞存活率呈顯著正相關(guān)，與相對發(fā)酵力呈負相關(guān)，與Sun等[8]和Tan等[34]報道的胞內(nèi)海藻糖含量的提高可以顯著提高細胞存活率，且胞內(nèi)海藻糖含量與發(fā)酵力不存在相關(guān)性的結(jié)論一致；甘油與存活率具有顯著相關(guān)性，與相對發(fā)酵力呈負相關(guān)，與Izawa等[10]通過基因敲出方法使胞內(nèi)甘油含量增大，從而提高細胞存活率和發(fā)酵力的結(jié)論一致，而與Myers等[35]通過在面團中添加外援甘油，從而提高細胞的發(fā)酵力結(jié)果不一致，可能是試驗方法不一致造成的；脯氨酸含量與細胞存活率呈正相關(guān)，而與相對發(fā)酵力呈負相關(guān)，與Sasano等[36]報道的增加脯氨酸含量可以相應(yīng)地增加細胞存活率和發(fā)酵力的觀點不一致，可能是表達MPR基因減少活性氧(ROS)水平，從而改善細胞存活率和發(fā)酵力；精氨酸含量與細胞存活率、發(fā)酵力均為負相關(guān)性，與Shima等[13]報道的通過敲除精氨酸氧化酶基因，增加細胞胞內(nèi)精氨酸含量，從而增加細胞存活率和發(fā)酵力的報道不一致，可能是經(jīng)過基因敲出等分子育種方法改變了精氨酸的代謝機制造成；天冬氨酸和谷氨酸含量均與細胞存活率呈負相關(guān)，且與細胞發(fā)酵力呈顯著正相關(guān)，與Takagi等[33]報道的細胞內(nèi)某些帶電荷氨基酸會影響到細胞耐冷凍率，但不是主要影響因素的結(jié)論一致。

2.3 菌種鑒定

通過冷凍7 d后測定細胞存活率和相對發(fā)酵力的結(jié)果可知，菌株Y-3、Y-4的存活率最高，菌株H-1的相對發(fā)酵力最高，因此，對這3株菌株進行菌落形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定。

2.3.1 菌落形態(tài)鑒定 各菌株的菌落形態(tài)見圖5。菌株Y-3菌落顏色為白色，菌落較小，形態(tài)為圓形，表面光滑、濕潤、黏稠、容易挑起；菌株Y-4菌落顏色為白色，菌落較小，形態(tài)扁平，不光滑，不透明，不易挑起；菌株H-1菌落顏色為乳白色，菌落較大，菌落中央凸起，光滑，不透明，容易挑起，有明顯的酒香味。

圖5 不同菌株的菌落形態(tài)

項目細胞存活率相對發(fā)酵力海藻糖甘油脯氨酸精氨酸天冬氨酸谷氨酸細胞存活率1.000相對發(fā)酵力-0.3001.000海藻糖 0.706?-0.2401.000甘油 0.777?-0.3080.776?1.000脯氨酸 0.134-0.513-0.0850.2331.000精氨酸 -0.448-0.546-0.200-0.2730.5461.000天冬氨酸 -0.6830.745?-0.586-0.5710.588-0.1031.000谷氨酸 -0.6970.766?-0.693-0.6210.550-0.1330.983?1.000

? *表示在0.05水平相關(guān)顯著。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 圖6是菌株Y-3、Y-4和H-1的26S rDNA 基因擴增電泳圖，從圖6中可以看出，3株菌核苷酸序列均在600 bp左右出現(xiàn)特異性亮帶。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行核苷酸序列Blast比對結(jié)果表明，Y-3與漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)的相似性為100%，Y-4與贊斯托假絲酵母(Candidaxestobii)的相似性為99%，H-1與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的相似性為100%。查閱相關(guān)文獻[37]，假絲酵母菌屬于條件致病菌，會引起病人尿道感染。漢遜酵母屬于生香酵母，石嬌嬌等[38]從自然發(fā)酵的甜面醬中也篩選到該菌株并且對其發(fā)酵產(chǎn)物進行檢測，說明該菌株在食品方面的應(yīng)用已經(jīng)有一定的理論基礎(chǔ)，應(yīng)用價值較大。因此，選擇Y-3和H-1作為后續(xù)研究菌株。

2株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7、8。菌株Y-3與菌株DebaryomyceshanseniiKY512216.1在同一分支上，同源性為92%；菌株H-1與菌株SaccharomycescerevisiaeLC336458.1在同一分支上，同源性為99%，因此，可以確定菌株Y-3為Debaryomyceshansenii，菌株H-1為Saccharomycescerevisiae。

3 結(jié)論

本研究通過模擬面團預(yù)發(fā)酵法和測定酵母胞內(nèi)化合物2種方法相結(jié)合，篩選得到抗凍酵母菌Y-3(Debaryomyceshansenii)，且不同于已報道的耐冷凍酵母[2-5]；與分子育種相比較[8-10]，自然篩選得到的野生酵母可以保留原有發(fā)酵食品的風(fēng)味口感，食用安全性可以得到保證，從而體現(xiàn)出本試驗所篩選到的酵母的優(yōu)勢；本試驗對海藻糖、甘油、氨基酸含量與細胞存活率和發(fā)酵力的相關(guān)性進行分析，發(fā)現(xiàn)海藻糖和甘油的含量與細胞存活率呈顯著正相關(guān)，因此，后續(xù)研究若采用自然篩選法篩選耐冷凍酵母時，可以先測定胞內(nèi)海藻糖和甘油的含量，縮小抗凍性試驗的篩選范圍，從而降低工作量，增大篩選效率。

圖7 菌株Y-3的26S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 菌株H-1的26S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

由于冷凍面團技術(shù)中的酵母菌在冷凍解凍后必須仍就保持較高的存活率和發(fā)酵力，因此，試驗后期會對存活率高的菌株Y-3和發(fā)酵能力好的菌株H-1進行混合發(fā)酵，得到最優(yōu)酵母添加比例，以期應(yīng)用到冷凍面團的制作中。

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