人工改造野生大豆GsDREB2基因?qū)χ参锬望}和耐滲透脅迫能力的影響

才華,孫娜,宋婷婷

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

轉(zhuǎn)錄因子DREB1A/CBF3 DREB(dehydration responsive element binding protein)和DREB2A可以與DRE順式作用元件結(jié)合[1]，調(diào)控植物低溫和干旱相關(guān)基因的表達(dá)，在非生物脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要的調(diào)控作用[2-4]。有研究表明，該基因的超量表達(dá)可以提高植物的耐鹽性，但會(huì)影響植株的正常生長(zhǎng)[5-8]，而且持續(xù)鹽脅迫，轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性并不十分理想[1,9]。如何能最大限度地發(fā)揮DREB基因的功能，為植物耐逆基因工程提供基因資源，是科學(xué)研究的目標(biāo)。

Liu等[1]在1998年首次通過(guò)酵母單雜交的方法分離擬南芥(Arabidopsisthaliana)CBF1、DREB1A和DREB2A基因。近十幾年來(lái)，DREB轉(zhuǎn)錄因子一直是非生物脅迫分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。已經(jīng)在多種植物中分離得到，并在該基因的結(jié)構(gòu)[10-11]、功能[12-15]、調(diào)控及相互作用網(wǎng)絡(luò)等方面都做了大量研究，結(jié)果表明DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)非生物脅迫反應(yīng)中起到非常重要的調(diào)控作用。雖然DREB類的很多基因都能與DRE/CRT元件結(jié)合，但其表達(dá)方式及調(diào)控基因并不相同。如AtDREB1是冷誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)控冷脅迫響應(yīng)的基因[1]，而AtDREB2是在干旱和高鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，涉及干旱脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[2]。且AtDREB1亞家族6個(gè)基因功能也各不相同[16]，之間還存在著反饋調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后修飾。同樣AtDREB2亞家族中8個(gè)基因的表達(dá)也存在差異，僅DREB2A和DREB2B在高鹽和干旱下誘導(dǎo)表達(dá)，而其他6個(gè)基因在脅迫下的表達(dá)量極低。并且發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因植株中過(guò)量表達(dá)AtDREB2A基因會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)受限，其耐逆性程度也是有限的[8]。以上研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子家族基因的功能是極為復(fù)雜的，其功能具有專一性，并且家族基因內(nèi)部還存在著自我調(diào)節(jié)，甚至于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和激活，例如泛素化[14]等。但其激活的機(jī)制尚不明確，也限制了該類基因在耐逆基因工程中的應(yīng)用。

Sakuma 等[8]發(fā)現(xiàn)，擬南芥DREB2A轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部存在一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(negative regulatory domain, NRD)，該結(jié)構(gòu)域的存在影響DREB2A轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和激活功能，并且發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域的缺失可以提高誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱的耐受性。本研究在2009年克隆了野生大豆(Glycinesoja)的GsDREB2基因，并深入研究了該基因的功能[17-18]。但是在進(jìn)行超量表達(dá)GsDREB2基因擬南芥和煙草(Nicotianatabacum)的耐鹽和干旱脅迫試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因并沒有顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥或煙草的耐逆性。鑒于以上研究，提出這樣的疑問，GsDREB2基因內(nèi)部是否也存在負(fù)向調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的存在是否也影響GsDREB2基因的調(diào)節(jié)功能？本研究對(duì)GsDREB2基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，推測(cè)NRD結(jié)構(gòu)域，并利用酵母試驗(yàn)驗(yàn)證NRD的抑制功能，通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥，比較全長(zhǎng)基因FLDREB和缺失NRD的人工改造基因GsDREB-mNRD在轉(zhuǎn)基因擬南芥中作用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pGBKT7、pGADT7-Rec2、pHIS2酵母雙雜交用載體，酵母菌Y187購(gòu)自clontech Takara Bio Company。誘餌載體pDRE-HIS2及含有該重組質(zhì)粒的酵母菌株Y187/pDRE-HIS2由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存[17]。大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，植物表達(dá)載體pBI121，根癌農(nóng)桿菌 LBA4404，EH105A感受態(tài)細(xì)胞，用于核定位分析的本氏煙草，用于轉(zhuǎn)化的擬南芥哥倫比亞生態(tài)型均由本實(shí)驗(yàn)室保存。該研究于2013年實(shí)施，2014年完成。

1.2 NRD結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)及各片段克隆載體構(gòu)建

根據(jù)Sakuma等[8]所述，用擬南芥AtDREB2A基因(At5g05410)與GsDREB2基因的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，預(yù)測(cè)GsDREB2基因的結(jié)構(gòu)域區(qū)域，選擇AP2結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域之間的Ser 和Try氨基酸富集區(qū)域(140～204)為假設(shè)的NRD結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)預(yù)測(cè)的NRD位點(diǎn)，設(shè)計(jì)不同缺失片段擴(kuò)增的引物序列，并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以便于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄結(jié)合的載體 pGBKT7與pGADT7-Rec2。按照?qǐng)D1中所述進(jìn)行構(gòu)建。

圖1 GsDREB2基因缺失片段的設(shè)計(jì)Fig.1 The designation of the delete mutation of GsDREB2 NLS： 核定位信號(hào)； AP2-domain: AP2-DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域； AAR： C端酸性活性區(qū)； V,E: 區(qū)別于DREBP家族其他蛋白質(zhì)保守的氨基酸； LNFP: AP2-DNA結(jié)構(gòu)域末端氨基酸標(biāo)志; FL-D: 全長(zhǎng)GsDREB2基因; D-AP2: 僅包含GsDREB2基因 NLS和AP2結(jié)構(gòu)域的片段(1～139 aa); D-AP2+NRD:包括 D-AP2和NRD的片段(1～204 aa); D-mNRD: 缺失NRD區(qū)域(140～204 aa)的GsDREB2基因。NLS: Nuclear located singnal; AP2-domain: AP2-DNA binding domain; AAR: C-terminus acidic activation region; V,E: Conserved amino acid residues distinguished from DREBP protein family; LNFP: The end of AP2-DNA binding domain; FL-D: Full-length GsDREB2; D-AP2: Only with NLS and AP2-binding domain (1-139 aa); D-AP2+NRD: Including D-AP2 and NRD (1-204 aa); D-mNRD: GsDREB2 with delete mutation of NRD region (140-204 aa).

1.3 不同缺失片段與DRE元件結(jié)合能力的分析

分別將圖1所示4組片段連接pGADT7載體，轉(zhuǎn)化重組酵母菌Y187/pDRE-HIS2中，涂布-/Leu-/Trp-平板，在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。通過(guò)PCR檢測(cè)的方法篩選同時(shí)含有2個(gè)質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆。具體方法參照Yeast Protocol (clontech Takara Bio Company)并加以改進(jìn)[17]。為了定量測(cè)算結(jié)合能力的大小，借助Image J軟件，通過(guò)菌的濃度間接衡量結(jié)合能力的差異。

具體方法如下：將在為-/Leu-/Trp-平板上生長(zhǎng)并鑒定陽(yáng)性克隆的酵母菌，在液體-/Leu-/Trp-培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，并通過(guò)測(cè)定菌的OD600值，調(diào)平菌液的濃度為0.6 mmol·L-1。菌液分別進(jìn)行10，100，1000倍稀釋，如圖2排列，將稀釋的菌液1 μL 滴在含有60、80 mmol·L-13-AT 和HIS-/Leu-/Trp-缺陷培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。重復(fù)3次，分別在3個(gè)相同的平板上，按照相同的順序點(diǎn)樣。待菌落出現(xiàn)后，在同一照相模式和光線情況下照相，盡量保證圖片的明暗度基本一致。使用IMAGE J軟件，調(diào)整一致的對(duì)比度，選擇一樣的菌落大小面積，對(duì)菌液的濃度進(jìn)行分析。

1.4 不同缺失片段轉(zhuǎn)錄激活活性測(cè)定及分析

將圖1所示4組片段連接pGBKT7載體，將不同片段連接的pGBKT7，分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y189，涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。利用PCR鑒定，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將各陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在SD/Trp-培養(yǎng)基上劃線。培養(yǎng)出菌落后，參照Yeast Protocol (clontech takara bio company)[17]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性的定性和定量分析。

1.5 細(xì)胞核定位分析

分別將GsDREB2-mNRD、FLDREB2與 pCAMBIA-1302 (GenBank 登錄號(hào)為AF234298)連接，構(gòu)建融合GFP蛋白的瞬時(shí)表達(dá)載體pGDREBFL/pGDREBmNRD。將pGDREBFL/pGDREBmNRD轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 EH105ɑ，利用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)化本氏煙草表皮細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號(hào)，以空載體pCAMBIA-1302作為陰性對(duì)照[18]。

1.6 GsDREB2-mNRD與FLDREB2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

以pBI121為載體基本骨架，利用原始載體上EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)，將Gus基因切除，替換為GsDREB2-mNRD或FLDREB2，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體。根據(jù)《植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》所述方法[19]，采用浸花法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，用100 mg·L-1卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化種子，用T1代陽(yáng)性擬南芥種子進(jìn)行后續(xù)耐逆性實(shí)驗(yàn)。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽、耐滲透脅迫分析

選取飽滿的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，用5%次氯酸鈉消毒液消毒10 min后，于4 ℃春化3～7 d，播種于含有125 mmol·L-1NaCl 或250 mmol·L-1甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，兩周后觀察表型，計(jì)算萌發(fā)率(萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/播種種子總數(shù)×100%)和測(cè)量鮮重，試驗(yàn)包括3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，萌發(fā)率和鮮重?cái)?shù)值是3次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 NRD對(duì)GsDREBa與DRE元件結(jié)合能力的影響

將pGADT7-Rec2空載體(簡(jiǎn)化為AD)與3個(gè)突變片段(命名為D-AP2,D-AP2+NRD,D-mNRD)和1個(gè)GsDREB2全長(zhǎng)基因(簡(jiǎn)化為FL-D)與pHIS2-DRE共轉(zhuǎn)化酵母菌，并在含有60和80 mmol·L-13-AT的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(圖2A)，利用Image J軟件，對(duì)酵母菌斑點(diǎn)進(jìn)行半定量分析，以菌斑的明暗度評(píng)價(jià)菌的濃度(圖2B)。當(dāng)菌液濃度稀釋1000倍以后，僅含有AP2結(jié)構(gòu)域和不含有NRD區(qū)的GsDREB2基因依然能夠在含有80 mmol·L-13-AT濃度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明NRD的缺失大大增強(qiáng)了GsDREB2蛋白與DRE元件結(jié)合的能力，NRD的存在抑制了轉(zhuǎn)錄因子與元件的結(jié)合。由此可以判定，與DRE元件結(jié)合起到?jīng)Q定作用的為AP2結(jié)構(gòu)域，只要有此結(jié)構(gòu)域存在，GsDREB2轉(zhuǎn)錄因子便能夠與DRE元件結(jié)合，全長(zhǎng)基因結(jié)合能力下降，降低的原因僅是由于NRD的存在，而GsDREB2轉(zhuǎn)錄因子的C-末端酸性活性區(qū)(AAR)存在與否對(duì)其結(jié)合能力并無(wú)影響。

2.2 NRD對(duì)轉(zhuǎn)錄激活活性影響

將pGDKT7空載體(BD)與3個(gè)突變片段和1個(gè)GsDREB2全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)化酵母菌，在同一個(gè)平板上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌的生長(zhǎng)情況，并測(cè)定β-半乳糖苷酶活性，以此評(píng)價(jià)NRD對(duì)轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。如圖3所示，GsDREB2全長(zhǎng)基因與NRD缺失的GsDREB2酵母菌組可顯藍(lán)色，β-半乳糖苷酶活性較高。而且NRD缺失的β-半乳糖苷酶活性更高。由此表明，NRD結(jié)構(gòu)域負(fù)向調(diào)控GsDREB2轉(zhuǎn)錄激活活性。另外，D-AP2、D-AP2+NRD酵母菌組與對(duì)照BD一樣，只有本底的β-半乳糖苷酶活性，并不具備轉(zhuǎn)錄激活活性。由此說(shuō)明，GsDREB2轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于C端，是轉(zhuǎn)錄激活所必需的。

圖2 GsDREB2缺失片段與DRE元件結(jié)合能力Fig.2 The binding activity of GsDREB2 full-lenghth and its mutants A: 重組酵母菌在SD/-HIS/-Leu /-Trp+3-AT培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況; B: 使用Image J軟件計(jì)算酵母菌濃度。A: The growth of recombinant yeast in SD/-HIS/-Leu /-Trp with 60 or 80 mmol·L-1 3-AT; B: Calculation of yeast concentration by Image J.

圖3 GsDREB2缺失片段轉(zhuǎn)錄激活定性(A)及定量(B)測(cè)定Fig.3 Qualitative (A) and quantitative (B) testing for the transcriptional activity of GsDREB2 full-lenghth and its mutants **差異極顯著(P<0.01). **significant difference (P<0.01).

2.3 GsDREB2-的核定位

NRD結(jié)構(gòu)域的缺失增強(qiáng)了GsDREB2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄激活能力，作為轉(zhuǎn)錄因子準(zhǔn)確地定位細(xì)胞核是行使其功能的基本。因此，對(duì)GsDREB2-mNRD的核定位情況進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖4所示，NRD結(jié)構(gòu)域缺失的融合蛋白(D-mNRD-GFP)與全長(zhǎng)基因的融合蛋白一樣，在轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞核中均顯現(xiàn)出綠色熒光，說(shuō)明NRD結(jié)構(gòu)域的缺失并沒有影響DREB2轉(zhuǎn)錄因子的定位情況，與全長(zhǎng)的GsDREB2基因一樣，GsDREB2-mNRD仍可定位于細(xì)胞核。

圖4 FLGsDREB2 和 GsDREB2-mNRD蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位Fig.4 Subcellular localization analysis of FLGsDREB2 and GsDREB2-mNRD Bright field 白背景，GFR field 熒光背景，Merged 組合。A： 植物瞬時(shí)表達(dá)載體pGDREB2 T-DNA部分；B： FLGsDREB2 和GsDREB2-mNRD細(xì)胞內(nèi)定位分析。A: T-DNA of transient expression vector of pGDREB2; B: Subcellular localization analysis of FLGsDREB2 and GsDREB2-mNRD.

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)期耐鹽、耐滲透脅迫分析

將全長(zhǎng)基因和NRD缺失的GsDREB2基因轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行高鹽(125 mmol·L-1NaCl)和高滲(250 mmol·L-1甘露醇)脅迫處理，以比較分析不同轉(zhuǎn)基因型耐逆性的差別(圖5)。GsDREB2-mNRD超量表達(dá)擬南芥幼苗在鹽和滲透脅迫條件下萌發(fā)率、鮮重及成活率均顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，并都表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，而GsDREB2基因超表達(dá)植株雖然也有一定的耐鹽和滲透脅迫的能力，但幼苗萌發(fā)畸形比較嚴(yán)重，后期成活率比較低。由此表明，NRD區(qū)域的缺失，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子與DRE結(jié)合的強(qiáng)度，提高了轉(zhuǎn)錄因子的激活活性，使轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽和滲透脅迫能力增強(qiáng)。

圖5 轉(zhuǎn)FLDREB和mNRD-DREB基因擬南芥幼苗耐鹽性及滲透脅迫的比較Fig.5 The different tolarence to salt and osmotic stress of Arabidopsis seedlings transformed with FLDREB and mNRD-DREB A: 轉(zhuǎn)GsDREB基因擬南芥種子在125 mmol·L-1 NaCl 和250 mmol·L-1 甘露醇處理下的生長(zhǎng)情況；B: 轉(zhuǎn)GsDREB基因擬南芥種子在125 mmol·L-1 NaCl 和250 mmol·L-1 甘露醇處理下不同天數(shù)的萌發(fā)率、生長(zhǎng)12 d后的鮮重及生長(zhǎng)20 d的成活率。實(shí)驗(yàn)包括3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，圖中給出的值是3次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果的平均值。A: Phenotypes of seed germination between WT and two kinds of transgenic Arabidopsis lines in the presence of control, 125 mmol·L-1 NaCl and 250 mmol·L-1 mannitol； B: Seed germination rate, fresh weight and survival rate between WT and two kinds of transgenic Arabidopsis lines in the presence of control, 125 mmol·L-1 NaCl and 250 mmol·L-1 mannitol. The experiment included three fully independent biological repeats, and three technical repeats and the mean value is shown. * 差異顯著(0.01

3 討論

很多研究均已證明DREB轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性方面起到重要的作用[20-21]，在多種植物中也已克隆出多個(gè)DREB基因[22-23]。但是至今，很少有利用該基因改善農(nóng)作物抗逆性的理想的報(bào)道，DREB轉(zhuǎn)錄因子基因功能的復(fù)雜性是限制其應(yīng)用的主要原因。Junya等[23]在大豆中分離到了1個(gè)DREB2A基因，并對(duì)已克隆獲得的多個(gè)大豆GmDREB2類的基因進(jìn)行了聚類，發(fā)現(xiàn)總共有3個(gè)亞型(subtype)。另外，發(fā)現(xiàn)GmDREB2A基因與GmDREBa和GmDREBc[23]相似性最高，都屬于同一亞型subtype1，但是GmDREBa和GmDREBc激活結(jié)構(gòu)域很短，功能上也存在不同，除具有耐旱性外，還具有耐高溫的功能[21]。與之相似，本研究克隆了來(lái)源于野生大豆的GsDREB2基因，同樣來(lái)源于大豆屬的基因，在基因序列、基因表達(dá)及生物學(xué)功能上卻與GmDREB2A存在較大差異。在前期的研究中，超量表達(dá)GsDREB2基因的煙草，均未發(fā)現(xiàn)較為明顯的抗旱性和耐鹽性，與GmDREB2A基因存在差異。

GsDREB2轉(zhuǎn)錄因子具有NLS 核定位信號(hào)、AP2-DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端酸性活性區(qū)等3部分基本結(jié)構(gòu)，用以在核中與DRE/CRT順式作用元件結(jié)合激活下游基因表達(dá)，行使其轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。Sakuma等[2,8]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)C末端酸性活性區(qū)前面含有30個(gè)氨基酸(136～165)組成的負(fù)向調(diào)控區(qū)(NRD)，該區(qū)域的缺失，解除了轉(zhuǎn)錄激活的抑制作用，有效地提高了DREB2A基因在脅迫條件下和非脅迫條件下的調(diào)控作用。本研究基于此結(jié)果，也獲得了AP2-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端酸性活性區(qū)中間的65個(gè)富含Ser、Try 氨基酸的負(fù)向調(diào)控區(qū)(140～204)，經(jīng)過(guò)酵母實(shí)驗(yàn)，確定該區(qū)域的存在抑制了DNA結(jié)合功能和轉(zhuǎn)錄激活功能，間接抑制了DREB基因的調(diào)控作用。經(jīng)驗(yàn)證確定，缺失NRD結(jié)構(gòu)域的GsDREB2基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽和抗?jié)B透脅迫反應(yīng)中起到正調(diào)控作用。

然而，天然的GsDREB2基因存在的生物學(xué)意義是什么？如果在正常的情況下，由于NRD的存在抑制了該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活下游與干旱和鹽相關(guān)的基因表達(dá)，那么在脅迫條件下，其又是如何行使功能的呢？這個(gè)問題還有待進(jìn)一步深入研究。Qin等[14]發(fā)現(xiàn)，AtDREB2A轉(zhuǎn)錄因子在正常環(huán)境下，參與泛素化降解的過(guò)程，負(fù)向調(diào)節(jié)干旱響應(yīng)蛋白的基因表達(dá)，并且這種調(diào)控是比較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，與多種代謝途徑是相關(guān)聯(lián)的?；蛟SNRD結(jié)構(gòu)域的存在與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白修飾存在關(guān)系，這還只是假設(shè)。但不可否認(rèn)，DREB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控是比較復(fù)雜的。

即便人工改造了該基因，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗?jié)B透脅迫的能力有所提高，但尚不能直接應(yīng)用。Sakuma[2，8]的研究發(fā)現(xiàn)，缺失NRD的AtDREB2A基因在誘導(dǎo)型rd29A啟動(dòng)子調(diào)控下，才能發(fā)揮最好的提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽的效果。因此，后續(xù)野生大豆來(lái)源的GsDREB2基因的應(yīng)用還要在啟動(dòng)子選用上加以考慮，可以優(yōu)先考慮rd29A誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

4 結(jié)論

GsDREB2轉(zhuǎn)錄因子基因AP2結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域之間存在65個(gè)氨基酸組成的Ser 和Try氨基酸富集區(qū)域，該區(qū)域的存在抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合特性和激活活性，將該區(qū)域命名為負(fù)向調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。突變?nèi)笔RD結(jié)構(gòu)域的GsDREB2基因依然可定位在細(xì)胞核，并且可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性和耐滲透脅迫的能力。

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