AtSOS基因在紫花苜蓿中的表達(dá)及其耐鹽性研究

麻冬梅，秦楚

(1.寧夏大學(xué) 西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

土壤鹽漬化是人類面臨的世界性問題，全球約100多個(gè)國家存在著不同類型的鹽堿地，占陸地面積的10%左右[1]，它不僅限制全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2]，還威脅生態(tài)環(huán)境、制約可持續(xù)發(fā)展。在我國，鹽堿土地主要分布于華北、東北、西北內(nèi)陸和濱海地區(qū)[3]。由于鹽堿土中含有大量可溶性的鹽離子(特別是大量的可交換性鈉)，從而抑制了植物的正常生長(zhǎng)，同時(shí)由于自然和人為因素的影響，鹽堿地面積仍在不斷增加。因此，對(duì)鹽堿土地的改良與應(yīng)用具有重大的意義[4]。到目前為止，治理鹽堿地主要有物理改良、化學(xué)改良和生物改良，其中物理和化學(xué)方法改良土壤不僅耗資巨大，還有可能會(huì)造成土壤次生鹽堿化問題[5]，而通過種植耐鹽堿植物的生物改良不僅耗資少，而且效果顯著[6]。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物新品種成為利用鹽堿地的重要途徑之一。

對(duì)于多數(shù)植物，高鹽度和水分虧缺嚴(yán)重會(huì)增加植物細(xì)胞的滲透，使細(xì)胞積累過多的活性氧以及加重?fù)p傷葉片的細(xì)胞膜脂[7]，從而影響植物的生長(zhǎng)、質(zhì)量和產(chǎn)量。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生的豆科牧草，主要用于牧草、干草、青貯飼料和青割[8]。它不僅在蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)與維生素水平上有突出的營養(yǎng)價(jià)值，其自身還有固氮能力。此外，紫花苜蓿的根比大多數(shù)作物要深，這種深厚的根系能使苜蓿適應(yīng)各種環(huán)境條件，從而提高其抗侵蝕能力[9]。因此，苜蓿因其多功能、高產(chǎn)、飼料價(jià)值高等特點(diǎn)，在土壤改良和土壤保護(hù)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[10]。然而環(huán)境的挑戰(zhàn)，特別是土壤鹽堿度的影響，不僅嚴(yán)重制約了紫花苜蓿的產(chǎn)量，而且還影響其根瘤的形成和共生固氮的能力[11]，使紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)受到了嚴(yán)重的威脅，因而培育耐鹽堿的紫花苜蓿新品種成了研究的重點(diǎn)。但是傳統(tǒng)的育種方法不僅程序繁雜而且生長(zhǎng)周期漫長(zhǎng)，性狀難以綜合，再加上紫花苜蓿異花授粉的限制，以及存在自交衰退等問題，給培育新品種帶來更大的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段為培育苜蓿新品種開辟了新途徑，有效利用耐鹽新品種植物進(jìn)行鹽堿地改良，不僅可以加快改良進(jìn)程，還可以提高農(nóng)業(yè)的發(fā)展，目前已開展了大量的耐鹽轉(zhuǎn)基因苜蓿的研究工作[12-14]。

享有“牧草之王”美稱的苜蓿，不僅種植廣泛、產(chǎn)量高、品質(zhì)好，而且根系比較發(fā)達(dá)，有一定的固氮能力，因此，對(duì)土壤有一定的改良作用。阿爾岡金品種是由加拿大引進(jìn)的，具有豐產(chǎn)、抗旱、抗寒等特點(diǎn)，但其耐鹽性較差[15]。本研究以紫花苜蓿阿爾岡金的子葉節(jié)為受體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將擬南芥(Arabidopsisthaliana)來源的基因SOS1+SOS2+SOS3導(dǎo)入紫花苜蓿，以期獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)的耐鹽性植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了相關(guān)農(nóng)藝性狀和生理生化指標(biāo)的檢測(cè)，為進(jìn)一步選育耐鹽新品種創(chuàng)建種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2015年9月開始，2017年1月結(jié)束，通過分子檢測(cè)共獲得轉(zhuǎn)基因植株12株，在進(jìn)行抗性篩選前，已將實(shí)驗(yàn)材料通過扦插的方式保存。

1.1.1種子 材料為阿爾岡金紫花苜蓿，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)曹致中老師饋贈(zèng)。

1.1.2載體 轉(zhuǎn)化的基因?yàn)锳tSOS1、AtSOS2、AtSOS3，均是與植物耐鹽相關(guān)的基因。載體由山東大學(xué)夏光敏實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

含有AtSOS1+AtSOS2+AtSOS3基因的表達(dá)載體pCAMBIA33O1-AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3的結(jié)構(gòu)如下：

圖1 AtSOS1+2+3載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The vector of AtSOS1+2+3

SOS1基因(3489 bp)、SOS2基因(1341 bp)、SOS3基因(669 bp)分別受啟動(dòng)子P35s調(diào)控。載體中還包含一個(gè)Bar(552 bp)篩選基因。

PCR引物見表1。RT-PCR引物見表2。

表1 AtSOS和Bar基因的PCR引物Table 1 The PCR primers of AtSOS and Bar genes

表2 AtSOS基因的RT-PCR引物Table 2 The RT-PCR primers of AtSOS genes

1.1.3培養(yǎng)基 接種培養(yǎng)基(M1)是1/2 MS；篩選培養(yǎng)基(M2)為MS培養(yǎng)基加入500 mg·L-1水解羅蛋白、5 mg·L-1PPT(草甘膦)和500 mg·L-1頭孢；分化培養(yǎng)基(M3)為MS培養(yǎng)基加入1 mg·L-16-BA(6-芐基氨基嘌呤)、300 mg·L-1PPT和300 mg·L-1頭孢；生根培養(yǎng)基(M4)為1/2 MS加入1 mg·L-1IBA(吲哚丁酸)、100 mg·L-1Glufosinate (草甘膦)和100 mg·L-1頭孢。

1.2 方法

1.2.1紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化 自來水沖洗紫花苜蓿種子5次后放于超凈工作臺(tái)中，先用75%的乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的HgCl2消毒8 min，無菌水沖洗5次。將處理后的種子接種于M1培養(yǎng)基上，25 ℃，3000 lx，12 h/12 h光照培養(yǎng)。將培養(yǎng)7 d的無菌苗，掐掉一片子葉和胚芽即子葉節(jié)，浸入農(nóng)桿菌懸浮液中，輕搖15 min。侵染后的子葉節(jié)轉(zhuǎn)移到含有3張無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，暗培養(yǎng)3 d。共培養(yǎng)后，將被侵染的子葉節(jié)接到M2培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)15 d。篩選出抗PPT的子葉節(jié)，轉(zhuǎn)移到M3培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，直到長(zhǎng)成小苗，轉(zhuǎn)接于M4培養(yǎng)基中。在恒溫氣候室，將生根紫花苜蓿轉(zhuǎn)移到土壤(營養(yǎng)土∶黃土∶蛭石=2∶3∶1)中生長(zhǎng)。

1.2.2轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 PCR檢測(cè)：提取未轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片的 DNA，并以 DNA 為模板對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別以重組質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)基因植株的DNA為陽性和陰性對(duì)照，取5 μL產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。

PCR反應(yīng)程序：

AtSOS1基因PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；56.4 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，循環(huán)25圈；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；

AtSOS2基因PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；57.3 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，循環(huán)35圈；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；

AtSOS3基因PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；57.6 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，循環(huán)30圈；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存；

Bar基因的PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；65.7 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，循環(huán)30圈；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

抗除草劑檢測(cè)：選取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株，每株植株分別選出3片長(zhǎng)勢(shì)良好、綠色健康的葉片，用手術(shù)刀在葉片表層輕輕劃破2道后，用毛筆涂抹500 mg·L-1的Glufosinate，3 d后觀察植株葉片表型。

RT-PCR檢測(cè)：采用北京華越洋公司的植物RNA提取試劑盒3.0提取轉(zhuǎn)基因與野生型植株的總RNA后，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR06A(美國，Takara)，獲得cDNA，繼而以cDNA為模板，進(jìn)行AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。

1.2.3鹽脅迫處理及耐鹽性檢測(cè) 在人工氣候室中，選擇轉(zhuǎn)基因和野生型植株各9盆，共設(shè)置100、200和300 mmol·L-13種濃度梯度NaCl水溶液，每個(gè)濃度梯度處理轉(zhuǎn)基因和野生型植株各3盆，共處理6 d，每天分別澆100 mL的NaCl水溶液。

鹽處理期間，每隔1 d測(cè)定各處理下轉(zhuǎn)基因和野生型植株的株高，記錄數(shù)據(jù)。

相對(duì)株高生長(zhǎng)率=(處理植株的株高-未處理前的株高)/未處理前的株高×100%

采用SPAD儀器每隔1 d測(cè)定各處理下轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片的葉綠素含量，每株隨機(jī)選取3片葉子，將葉片做好標(biāo)記，每次測(cè)量同一葉片的葉綠素含量，記錄數(shù)據(jù)。

收集處理前(0 d)和處理后(6 d)的植株葉片保存于-80 ℃冰箱中，在同一天按植物生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書進(jìn)行超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、過氧化物酶(peroxidase， POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、脯氨酸(praline, Pro)、可溶性糖、細(xì)胞膜透性和Na+、K+離子含量的測(cè)定[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子鑒定

2.1.1再生植株的獲得 以阿爾岡金的子葉節(jié)為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。侵染后將農(nóng)桿菌與子葉節(jié)共培養(yǎng)3 d(圖2a)。然后，子葉節(jié)在含有5 mg·L-1的Glufosinate培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)15 d(圖2b)?？剐宰尤~節(jié)在節(jié)點(diǎn)處長(zhǎng)出新芽，而非轉(zhuǎn)基因子葉節(jié)的胚軸處逐漸褐化，節(jié)點(diǎn)處也不生出新芽。將抗性子葉節(jié)接入分化培養(yǎng)基上(圖2c)，在節(jié)點(diǎn)處繼續(xù)生出新芽，待新芽長(zhǎng)至一定高度，轉(zhuǎn)移到瓶中繼續(xù)培養(yǎng)(圖2d)。待小苗長(zhǎng)至4 cm左右時(shí)，將小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，1個(gè)月后，抗性植株長(zhǎng)出大量根系(圖2e)。隨后，將抗性植株轉(zhuǎn)移至土壤中，放入人工氣候室生長(zhǎng)(圖2f)。

2.1.2PCR檢測(cè) 為了驗(yàn)證目的基因是否整合到阿爾岡金的基因組中，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒、轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片的基因組DNA，以DNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依次擴(kuò)增出SOS1、SOS2、SOS3和Bar基因序列(圖3a，b，c，d)。以農(nóng)桿菌質(zhì)粒為陽性對(duì)照，野生型植株為陰性對(duì)照，通過檢測(cè)獲得12株抗性植株。

圖2 紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2 Transformation of alfalfa a：共培養(yǎng)；b：篩選；c、d：分化培養(yǎng)；e：生根；f：再生植株。a：Cocultivation；b：Screening；c, d：Differentiation；e：Rooting；f：Plant regeneration.

2.1.3轉(zhuǎn)基因和野生型植株的抗除草劑鑒定 經(jīng)高濃度除草劑處理后，野生型植株抵抗除草劑能力較弱，3 d后，其葉片發(fā)黃、萎蔫；而轉(zhuǎn)基因植株的葉片仍保持綠色(圖4)。

2.1.4RT-PCR分析 通過提取轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片的RNA，繼而進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確定了SOS1、SOS2和SOS3基因在RNA水平上的表達(dá)(圖5)。

2.2 耐鹽性檢測(cè)

2.2.1鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的表型變化 用3種不同濃度的NaCl溶液(100，200和300 mmol·L-1)處理轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿植株，每個(gè)處理重復(fù)3次，分析兩者的耐鹽性。在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿的生理狀態(tài)均下降，植株隨著鹽濃度的增加生長(zhǎng)逐漸減慢。6 d后，轉(zhuǎn)基因和野生型植株之間有明顯的表型差異。在100 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株生長(zhǎng)差異并不明顯，葉片均略微變黃。而在200 mmol·L-1的NaCl處理下，野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株相比，葉片明顯變黃，并且出現(xiàn)萎蔫和枯萎跡象(圖6a, b)。在300 mmol·L-1的NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株均逐漸枯死。

2.2.2鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的相對(duì)株高增長(zhǎng)率變化 不同鹽濃度處理下，所有植株的株高均有所增長(zhǎng)。由圖7可知，6 d后，所有植株株高的相對(duì)增長(zhǎng)率均可達(dá)到10%以上。在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)趨勢(shì)顯著，其相對(duì)增長(zhǎng)率均高于相同時(shí)間處理時(shí)的野生型植株，6 d時(shí)，可分別高出9%和7%。而在300 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株株高的變化差異并不明顯。

2.2.3鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿葉綠素含量的變化 葉綠素是一類與植物光合作用有關(guān)的重要色素，其含量的多少反映了植物光合能力的強(qiáng)弱。由圖8可知，處理前，轉(zhuǎn)基因植株葉片的葉綠素含量均高于野生型植株。在NaCl脅迫2 d后，所有植株的葉綠素含量均呈上升趨勢(shì)。脅迫4和6 d時(shí)，除100 mmol·L-1的NaCl溶液處理的轉(zhuǎn)基因植株葉片的葉綠素含量仍增加外，其他不同脅迫各處理的葉綠素含量均大幅度下降。

圖4 除草劑處理前后轉(zhuǎn)基因和野生型植株表型的變化Fig.4 The changes in the phenotype of transgenic and wild-type strains under herbicide treatment a：除草劑處理前；b：除草劑處理后。WT：野生型植株；T：轉(zhuǎn)基因植株。a：Before herbicide treatment；b：After herbicide treatment.WT：Wild type plant；T：Transgenic plants.下同。The same below.

圖5 RT-PCR分析結(jié)果Fig.5 The analysis of alfalfa by RT-PCT M：marker 2000；1, 2：SOS1基因的RT-PCR結(jié)果；3, 4：SOS2基因的RT-PCR結(jié)果；5, 6：SOS3基因的RT-PCR結(jié)果。M：marker 2000；1, 2：The RT-PCR of SOS1；3, 4：The RT-PCR of SOS2；5, 6：The RT-PCR of SOS3.

圖6 不同鹽濃度處理轉(zhuǎn)基因和野生型植株6 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The experimental results of transgenic and wild type plants by dealing with different salt concentration after 6 days a：處理前轉(zhuǎn)基因和野生型植株的生長(zhǎng)情況；b：處理后轉(zhuǎn)基因和野生型植株的生長(zhǎng)情況。a：The growth of transgenic and wild plants before handling；b：The growth of transgenic and wild plants after 6 days.

圖7 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株的株高增長(zhǎng)率變化Fig.7 The growth rate of plant height in transgenic and wild-type strains under salt stress

圖8 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉綠素含量的變化Fig.8 The changes of cholorophyll content in transgenic and wild-type strains under salt stress

2.2.4鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿葉片的細(xì)胞膜透性變化 植物的細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境以及保證細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝起著重要的作用。在正常的生長(zhǎng)環(huán)境下，細(xì)胞膜具有選擇通透性。當(dāng)植物受到鹽脅迫影響時(shí)，細(xì)胞膜遭到破壞，導(dǎo)致膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，植物葉片浸提液的電導(dǎo)率增大。細(xì)胞膜透性越大表示細(xì)胞受傷害越嚴(yán)重，通過測(cè)量細(xì)胞膜透性的變化，來判斷植物的受損傷程度。由圖9可以看出，即使在正常條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的細(xì)胞膜透性就顯著低于野生型植株，均比野生型植株低10%以上，證明轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性更強(qiáng)。在NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片的細(xì)胞膜透性均有所上升，在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，野生型植株的變化與轉(zhuǎn)基因相比更為明顯，與未處理前相比，野生型植株的細(xì)胞膜透性提高了10%左右，而轉(zhuǎn)基因植株提高不到5%。在300 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的細(xì)胞膜透性變化差異并不明顯，均增加了13%。

2.2.5鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿中SOD活性的變化 植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)，其抗氧化酶系統(tǒng)易被影響，當(dāng)植物細(xì)胞受到鹽脅迫產(chǎn)生離子毒性時(shí)，細(xì)胞中的活性氧會(huì)大量積累，造成氧化損傷，繼而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。SOD是重要的抗氧化保護(hù)酶，其活性可以反映植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受程度。在NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株的SOD活性均有所增加，其中轉(zhuǎn)基因植株中的SOD活性的增加幅度低于野生型植株，在100 mmol·L-1的NaCl處理下，野生型植株中SOD的活性增加了66 U·g-1·h-1，而轉(zhuǎn)基因植株僅增加14 U·g-1·h-1。說明野生型植株在鹽脅迫下SOD活性增加明顯，利于其清除超氧化自由基，從而保護(hù)植物細(xì)胞膜免受損害，進(jìn)而說明，該濃度下鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株造成的損傷顯著低于野生型植株。

圖9 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株細(xì)胞膜透性的變化Fig.9 The changes of cell membrane permeability in transgenic and wild-type strains under salt stress

圖10 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株SOD活性的變化Fig.10 The changes of SOD activity in transgenic and wild-type strains under salt stress

2.2.6鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿中POD活性的變化 植物細(xì)胞中過氧化氫酶的主要作用是清除植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2。SOD作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生H2O2，因此植物中POD活性的多少可用于評(píng)價(jià)植物的抗逆性。由圖11可以看出，在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株中POD活性差異不大。鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的POD活性均增加，轉(zhuǎn)基因植株的POD活性增加量分別高出野生型植株2、9和9 U·g-1·min-1。

2.2.7鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿中CAT活性的變化 由圖12可以看出，在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，未處理前，轉(zhuǎn)基因植株中的CAT活性均高于野生型植株。在鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的CAT活性均有增加，但轉(zhuǎn)基因植株增加更為明顯，增加量均高出野生型1倍。進(jìn)而說明轉(zhuǎn)基因植株清除逆境脅迫后產(chǎn)生的H2O2的能力和反應(yīng)強(qiáng)度均高于野生型植株。

2.2.8鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿中MDA含量變化 MDA含量的多少可代表細(xì)胞質(zhì)膜受損傷的程度，由圖13可以看出，在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，MDA含量均維持在一定水平。鹽脅迫后， MDA含量在轉(zhuǎn)基因和野生型植株中均下降，在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理時(shí)，野生型植株的MDA含量與未處理前相比，下降了一半，說明野生型植株的細(xì)胞膜受損傷更為嚴(yán)重。

2.2.9鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿中Pro含量變化 逆境環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞失水過多或吸水困難，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)可以通過積累大量游離的脯氨酸來提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，以便減少逆境對(duì)植物的傷害。由圖14可以看出，在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的脯氨酸含量都很低，并且差異不大。但鹽脅迫后，二者的脯氨酸含量均顯著提高，其中在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理時(shí)，野生型植株中脯氨酸的增加量分別是轉(zhuǎn)基因植株的5和2倍。而在300 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株中脯氨酸含量變化差異并不明顯。

圖11 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株P(guān)OD活性的變化Fig.11 The changes of POD activity in transgenic and wild-type strains under salt stress

圖12 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株CAT活性的變化Fig.12 The changes of CAT activity in transgenic and wild-type strains under salt stress

圖13 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株MDA含量的變化Fig.13 The changes of MDA content in transgenic and wild-type strains under salt stress

圖14 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株P(guān)ro含量的變化Fig.14 The changes of Pro content in transgenic and wild-type strains under salt stress

2.2.10鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿中可溶性

圖15 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株可溶性糖含量的變化Fig.15 The changes of soluble sugar content in transgenic and wild-type strains under salt stress

糖含量變化 植物會(huì)因?yàn)楦啕}環(huán)境而造成滲透脅迫，此時(shí)為抵御鹽害，調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，細(xì)胞會(huì)積累可溶性小分子有機(jī)物如可溶性糖來穩(wěn)定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞的滲透壓。由圖15可以看出，在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株中可溶性糖的含量均增加，并且轉(zhuǎn)基因植株的變化趨勢(shì)更為明顯。在100 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)可溶性糖含量高達(dá)26 μg·g-1，為野生型植株的3倍。而在300 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，野生型植株中可溶性糖含量與未處理前相比降低了3 μg·g-1，可能是高鹽環(huán)境對(duì)野生型植株的細(xì)胞膜造成了不可逆轉(zhuǎn)的損害。

2.2.11鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型紫花苜蓿根系中Na+和K+含量的變化 由圖16可以看出，未用NaCl處理的轉(zhuǎn)基因和野生型植株根系中的Na+含量相似，隨著鹽處理濃度的增加，被測(cè)植株根系中Na+含量均增加，但是野生型植株的增長(zhǎng)趨勢(shì)更為明顯。在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，同等鹽濃度，野生型植株根系中的Na+含量均明顯高于轉(zhuǎn)基因植株，積累了更多的鹽(圖16a)。

未用NaCl處理時(shí)，野生型植株根系中的K+含量明顯高于轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)鹽脅迫后，野生型植株根系中的K+含量迅速降低，隨后，隨著鹽處理濃度的增加呈上升趨勢(shì)。同等濃度鹽處理下，轉(zhuǎn)基因植株根系中的K+含量均明顯高于野生型植株(圖16b)。

圖16 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型植株根系中Na+和K+含量的變化Fig.16 The changes of Na+ and K+ content in the root of transgenic and wild-type strains under salt stress a：Na+含量；b： K+含量。a：The content of Na+；b：The content of K+.

3 討論

本試驗(yàn)以紫花苜蓿“阿爾岡金”的子葉節(jié)為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，并且將多基因植物表達(dá)載體SOS1+SOS2+SOS3引入紫花苜蓿中，以期提高紫花苜蓿的耐鹽性。

轉(zhuǎn)基因植株主要在DNA， RNA和抗除草劑上進(jìn)行分子檢測(cè)。在DNA水平上，PCR檢測(cè)技術(shù)最為普遍，具有對(duì)植物基因組純度要求不高，操作簡(jiǎn)單快捷，成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，通常情況下，一般檢測(cè)出外源基因的部分片段已整合到了植物基因組中時(shí)，便可確定該段基因已完全轉(zhuǎn)入植物中。但轉(zhuǎn)入到植物中的基因，可能會(huì)發(fā)生基因沉默現(xiàn)象[17]，或是由于載體過大，導(dǎo)致T-DNA不完全整合[18-20]，從而無法表達(dá)?？梢酝ㄟ^對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RNA水平的檢測(cè)，來進(jìn)一步確定外源基因的整合效果。RT-PCR檢測(cè)對(duì)植株RNA的濃度和純度要求較高，在整個(gè)操作過程中，為了防止RNA的污染和降解，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較為嚴(yán)格。

與野生型植株相比，鹽害引起的癥狀，如植物萎蔫、老葉變黃等，在轉(zhuǎn)基因植株中影響較輕，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的長(zhǎng)勢(shì)顯著高于野生型植株。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，鹽脅迫會(huì)使植物細(xì)胞內(nèi)的葉綠體受損，降低植物光合作用的能力[21]。本研究表明，在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量高于野生型植株(圖8)，表明轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的光合能力強(qiáng)于野生型紫花苜蓿。

植物受到鹽害時(shí)，植物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加，膜透性增加越多，說明細(xì)胞受損越嚴(yán)重，植物抗逆性越弱[22]，鹽脅迫后，轉(zhuǎn)基因植物的膜透性明顯低于野生型植株(圖9)，說明轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性增強(qiáng)。

在治療期間,實(shí)驗(yàn)組患者有1例患者出現(xiàn)了不良反應(yīng),不良反應(yīng)發(fā)生率為2.38%,顯著低于對(duì)照組的21.43%,組間比較差異具有顯著性(P<0.05)。

在鹽脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生過多的活性氧，活性氧的大量積累，造成膜系統(tǒng)的氧化損傷[23]。在本研究中，分別測(cè)定了SOD、POD、CAT活性和MDA、Pro、可溶性糖含量的生理生化指標(biāo)。野生型紫花苜蓿中，為了清除Na+產(chǎn)生的毒害，從而誘導(dǎo)SOD的活性增加，而轉(zhuǎn)基因植株由于耐鹽性增強(qiáng)，Na+對(duì)其的毒害作用減弱，使其誘導(dǎo)SOD的活性增加程度低于野生型植株(圖10)；在清除活性氧的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量H2O2，POD和CAT能夠?qū)2O2還原成H2O，從而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的H2O2水平，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中的POD和CAT活性有所增加(圖11,12)，說明其抗氧化能力增強(qiáng)。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量可代表細(xì)胞膜受損傷程度[24]，鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因和野生型植株中的MDA含量均下降，且野生型植株中下降得更為明顯(圖13)，說明其受到的損傷更大。由于氨基酸的積累與植物的耐鹽性呈負(fù)相關(guān)[25]，即脯氨酸含量積累越多，其耐鹽性越差，因而轉(zhuǎn)基因植株中的Pro含量明顯低于野生型植株(圖14)。除此之外，可溶性糖作為植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以維持細(xì)胞膨脹，抑制細(xì)胞的被動(dòng)脫水，當(dāng)鹽脅迫造成細(xì)胞脫水時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物中的可溶性糖含量明顯高于野生型植株(圖15)，為其抵抗鹽害提供支撐。

此外，通過研究植物根系中的離子含量，進(jìn)一步探究其耐鹽性。鹽處理下，轉(zhuǎn)基因植株的根系中Na+的積累比野生型植株少，而K+的吸收多于野生型植株(圖16)，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植株中的SOS1編碼的Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)體可以有效地將Na+排出胞外，保護(hù)K+通道，促進(jìn)K+內(nèi)流[26-27]。SOS1活性受SOS3-SOS2復(fù)合體調(diào)控，促進(jìn)Na+外排，減輕了離子毒性，從而提高了植株的耐鹽性。

由于轉(zhuǎn)基因植株T0代性狀還不穩(wěn)定，還需通過收集轉(zhuǎn)基因植株雜交后的種子進(jìn)行T1和T2代的耐鹽性鑒定。

4 結(jié)論

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行AtSOS途徑的多基因表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，在100和200 mmol·L-1的NaCl溶液處理下，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀和生理生化指標(biāo)變化明顯，說明轉(zhuǎn)基因紫花苜?？梢栽?00 mmol·L-1(11.7‰) NaCl的鹽環(huán)境下生存。而在300 mmol·L-1的NaCl溶液處理時(shí)，二者耐鹽指標(biāo)變化的差異不大。

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