尖銳濕疣皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達(dá)變化及意義

歐偉洪，陳曉東

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院，?？?70208)

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致的性傳播疾病，其發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚未完全闡明[1,2]。尖銳濕疣好發(fā)于肛門及外陰，初期可出現(xiàn)淡紅色丘疹，并逐漸轉(zhuǎn)化為菜花樣、乳頭瘤樣等贅生物，持續(xù)進(jìn)展可出現(xiàn)潰瘍、繼發(fā)感染等。防御素是一類可殺死細(xì)菌、真菌或者病毒等微生物并有抗腫瘤活性的多肽。人β防御素2(HBD-2)、HBD-3作為抗菌肽，能夠與機(jī)體發(fā)生間接或直接的免疫防御反應(yīng)，抑制并殺滅病原菌，其過度表達(dá)與多種皮膚病的發(fā)生有關(guān)[3～5]。B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)基因能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)胞嘧啶及移植抗原啟動子序列，并于活化增殖細(xì)胞中大量轉(zhuǎn)錄，其高度表達(dá)能夠影響抗癌藥物活性[6]。本研究探討尖銳濕疣皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年3月～2017年3月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院收治的尖銳濕疣患者165例(觀察組)，男85例、女80例，年齡20～60(33.41±7.65)歲，病程0.5～4(1.53±0.74)個月；均給予皮損部位液氮冷凍治療，將全部疣體皮損清除，并外用康復(fù)新液，持續(xù)使用1個月。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合尖銳濕疣診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，外陰均有明顯的皮損；入組前均未接受免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：艾滋病及梅毒血清學(xué)檢查提示陽性；肝腎功能損傷；結(jié)核病、銀屑病史；妊娠及哺乳期婦女。選擇同期收治的165例皮膚健康志愿者為對照組，均無皮膚病變史，年齡21～58(31.93±7.94)歲，其中男81例，均進(jìn)行包皮環(huán)切術(shù)；女84例，均進(jìn)行性器官美容整形手術(shù)。兩組年齡、性別具有可比性。

1.2 皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)法。觀察組分別于治療前及治療結(jié)束時收集皮損組織標(biāo)本，女性主要選擇陰道及大小陰唇等部位疣體組織，男性主要選擇肛周及陰莖等部位疣體組織。對照組男性標(biāo)本為包皮環(huán)切術(shù)后的正常包皮，女性標(biāo)本為性器官美容整形患者的健康外陰組織。將標(biāo)本制作為蠟塊并切片，脫蠟至水。室溫下以3%過氧化氫浸泡15 min，采用蒸餾水沖洗，并以磷酸鹽緩沖液浸泡3次；將切片進(jìn)行熱抗原修復(fù)，反復(fù)沖洗3次，滴加5% BSA封閉，室溫下孵育20 min；加入HBD-2、HBD-3、Bcl-2一抗工作液(濃度均為1∶300)，于4 ℃冰箱過夜；次日取出標(biāo)本，于室溫下放置30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入生物素化二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，加入鏈霉親和素復(fù)合體，37 ℃孵育20 min；PBS沖洗3次，加入3,3-二氨基聯(lián)苯胺并避光顯色，于顯微鏡下查看染色情況，并控制反應(yīng)時間，及時終止反應(yīng)；自來水沖洗后，復(fù)染、脫水、透明并封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，選擇MIAS2000圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計HBD-2、HBD-3陽性區(qū)域平均光密度(MOD)值及Bcl-2表達(dá)陽性率。HBD-2陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：以鏡下細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；HBD-3陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：以鏡下細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)紅色顆粒為陽性。Bcl-2定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以出現(xiàn)棕褐色至淡黃色顆粒樣物質(zhì)為陽性。

2 結(jié)果

2.1 兩組皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達(dá)比較 見表1。

表1 兩組皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與同組治療前比較，#P<0.01。

2.2 尖銳濕疣患者皮損組織HBD-2、HBD-3表達(dá)和Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性 尖銳濕疣患者皮損組織HBD-2、HBD-3表達(dá)與Bcl-2表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.709、0.680，P均<0.05)，HBD-2與HBD-3表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.671，P<0.05)。

3 討論

尖銳濕疣好發(fā)于性活躍階段，宿主免疫缺陷時易誘發(fā)HPV感染，但大部分免疫正常者宿主感染HPV后可痊愈，說明可通過增加免疫應(yīng)答反應(yīng)以抵抗HPV感染[11]。

抗菌肽為天然黏膜及表皮免疫的主要成分，具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒等生物活性。HBD-2及HBD-3能夠參與抗菌肽的形成，屬于β防御素，能夠在多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)下生成，主要于角質(zhì)形成細(xì)胞及上皮細(xì)胞中表達(dá)，共同調(diào)控機(jī)體天然免疫系統(tǒng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中HBD-2及HBD-3表達(dá)明顯升高，皮膚、口腔黏膜等組織中均有二者的表達(dá)[13]；尖銳濕疣患者皮損組織HBD-2及HBD-3表達(dá)明顯高于正常皮膚組織[14]。本研究結(jié)果顯示，觀察組治療前皮損組織HBD-2及HBD-3表達(dá)升高，且治療后HBD-2及HBD-3表達(dá)低于治療前。說明局部HPV感染能夠刺激免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)HBD-2及HBD-3表達(dá)；經(jīng)治療HPV感染被控制，HBD-2及HBD-3表達(dá)降低。提示HBD-2及HBD-3可能參與了尖銳濕疣的發(fā)生，二者表達(dá)變化可反映疾病的轉(zhuǎn)歸。

Bcl-2為凋亡抑制基因，主要于細(xì)胞中線粒體核膜、外膜及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)，其過度表達(dá)可抑制多種因素所致的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在多種凋亡細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)明顯下降[15]。邢春瑤等[16]報道，Bcl-2過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡，其可通過特定通路調(diào)控皮損組織細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與增殖失衡，引發(fā)疾病。本研究觀察組皮損組織中Bcl-2表達(dá)明顯高于對照組，提示Bcl-2高表達(dá)可抑制皮損組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)該病的發(fā)生及進(jìn)展；經(jīng)治療Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，可能與疾病經(jīng)治療后細(xì)胞凋亡的異常調(diào)控得到糾正有關(guān)[17]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，尖銳濕疣患者HBD-2、HBD-3、Bcl-2三者兩兩表達(dá)均呈正相關(guān)，說明三者之間可能存在一定相互作用。推測機(jī)體感染HPV后能夠誘導(dǎo)HBD-2、HBD-3、Bcl-2大量表達(dá)，促進(jìn)疾病發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，尖銳濕疣皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達(dá)均上調(diào)，三者表達(dá)變化參與尖銳濕疣的發(fā)生并可反映疾病轉(zhuǎn)歸。

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