黑豆皮中花青素成分鑒定及細胞內(nèi)抗氧化活性研究

李玉英，白金晶，李 新，王轉(zhuǎn)花

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

黑豆（black soybean）是一種食藥兩用、具有較高營養(yǎng)價值的豆科植物，因其種皮中含有花色素類物質(zhì)而呈現(xiàn)黑色?；ㄇ嗨兀╝nthocyanins）是賦予植物顏色的最天然的水溶性色素，屬于類黃酮化合物，以C6-C3-C6為基本骨架[1-2]。自然界中的花青素多以糖基的形式存在，保護花青素免受氧化降解，更有益于人體的吸收利用。據(jù)文獻[3-4]報道，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是黑豆皮的重要活性成分，且因地域不同，黑豆皮中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量存在明顯差異。

花青素具有抗炎、抗腫瘤、防衰老、降糖、降脂、預防心血管疾病及抗氧化等多重功效[5-8]。ALHOSIN等[9]采用臺盼藍染色法檢測得出，藍莓提取物（Antho 50）對慢性淋巴白血病細胞具有抑制作用，且進一步通過annexin V-FITC/PI方法檢測細胞發(fā)生凋亡。周丹蓉等[10]通過體外檢測李果皮提取物清除羥自由基、超氧陰離子自由基與DPPH的能力，說明其抗氧化能力與含量呈正相關。HUANG等[11]將藍莓花青素作用于內(nèi)皮細胞后檢測到活性氧水平降低和黃嘌呤氧化酶與超氧化物歧化酶升高，說明其具有一定的抗氧化性。但是關于黑豆皮花青素（BSCA）在細胞內(nèi)的抗氧化性能及其對癌細胞的增殖抑制作用的研究報道相對較少。

本研究通過HPLC鑒定黑豆皮中所含花青素的成分，采用細胞內(nèi)抗氧化活性（CAA）檢測法及抗增殖活性的檢測，從體外總抗氧化能力與體內(nèi)氧化系統(tǒng)綜合評價了其對細胞的抗氧化性能，旨在為從豆科植物開發(fā)一種具有抗癌作用的抗氧化保健產(chǎn)品奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黃仁圓形黑豆種子（產(chǎn)自山西運城）；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）標準品、飛燕草素葡萄糖苷（delphinidin-3-glucoside，D3G）標準品、矮牽牛素葡萄糖苷（Petunidin 3-glucoside，Pt3G）標準品、飛燕草素標準品、矮牽牛素標準品、矢車菊素標準品、DMEM培養(yǎng)基（上海立菲生物技術有限公司）；D101大孔吸附樹脂、胰蛋白酶（trypsin）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索萊寶科技有限公司）；Venusil XBP C18（L）液相色譜柱（博納艾杰爾科技有限公司）；DPPH，2，2′-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2，2'-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride granu lar，ABAP），2′，7′- 二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′，7′-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）（美國 Sigma公司）；谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒（南京建成生物科技有限公司）；總谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化（MDA）檢測試劑盒、BCA試劑盒（碧云天生物技術研究所）；甲醇、甲酸、乙腈為色譜級試劑；水楊酸、FeSO4、無水乙醇、H2O2、抗壞血酸（Vc）均為國產(chǎn)分析純。

人肝癌Hep G2細胞、人結腸癌HCT116細胞、人乳腺癌MCF-7細胞，由山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室保存。

1.2 儀器與設備

高速粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；微波催化合成/萃取儀（北京祥鵠科技公司）；真空冷凍干燥器（上海匯分電子科技有限公司）；恒溫水浴鍋（太倉華利達儀器廠）；高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-RAD公司）；多功能酶標儀（美國博騰儀器有限公司）；Lambda 35型紫外-可見分光光度計（美國Perkin Elmer公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑豆皮花青素（BSCA）的分離純化與制備稱取一定量的黑豆皮粉末，分別采用水浴與微波輔助提取法進行提取，通過單因素試驗優(yōu)化提取條件，并大量提取黑豆皮花青素，經(jīng)D101大孔樹脂加以純化，高效液相色譜法分析鑒定黑豆皮中提取物的成分及含量。

HPLC的提取條件是依據(jù)文獻[12-13]并改進，梯度洗脫程序，流動相A為0.3%的甲酸（色譜級），流動相B為100%的乙腈（色譜級）；進樣量為10μL；檢測波長為513 nm；柱溫為25℃；流速為0.8 mL/min；洗脫梯度為：90%的流動相A，10%的流動相B，0～5 min；85%的流動相 A，15%的流動相 B，5～45 min；75%的流動相 A，25%的流動相 B，45～60 min。

1.3.2 BSCA清除DPPH能力的測定 用電子天平稱取0.5mgDPPH與一定量的BSCA，用無水乙醇將其分別配成5%的DPPH溶液與0.025，0.050，0.075，0.100，0,125，0.150，0.175，0.200 mg/mL的 BSCA。將BSCA溶液與DPPH溶液各取2 mL，充分混勻。避光條件下靜置30 min后，在519 nm處檢測其OD值。同樣的操作，用乙醇代替DPPH溶液設置為對照，用乙醇代替樣品設置為空白對照，Vc為陽性對照。按公式（1）計算DPPH清除率。

1.3.3 BSCA清除羥自由基能力的測定 10 mL試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL，不同質(zhì)量濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 m g/mL）BSCA 檢測溶液2.0 mL與6 mmol/LH2O2溶液2.0 mL，搖勻后靜置10 min。再加入6 mmol/L水楊酸溶液2.0 mL，充分搖勻后靜置30 min，于510 nm處檢測其OD值。同樣步驟，用蒸餾水代替水楊酸設置為對照，用蒸餾水代替樣品設置為空白對照，以Vc為陽性對照。按公式（2）計算BSCA對羥自由基的清除率。

1.3.4 BSCA對腫瘤細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期人肝癌Hep G2細胞、人結腸癌HCT116細胞與人乳腺癌MCF-7細胞，分別配制成5×103個單細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，藥物組加入不同質(zhì)量濃度（0，25，50，100，150，200，250 μg/mL）的 BSCA，每組設 5 個復孔。對照組只加入相應的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24，48 h后每孔再加20 μL 5.0 mg/mL的 MTT培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，室溫下低速振蕩至紫色結晶物完全溶解，在490 nm處測定吸光度值，按公式（3）計算細胞抑制率。

1.3.5 細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）試驗[14]取對數(shù)生長期Hep G2細胞，配制成4×103個單細胞懸液。接種于黑色的96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗一次。然后加入用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的100 μL的DCFH-DA與BSCA溶液，DCFH-DA的終濃度為 25 μmol/L，BSCA 的最終質(zhì)量濃度為 0，2.5，5，10，25，50，100，150，200 μg/mL，每個濃度設置 5 個復孔。37℃繼續(xù)培養(yǎng)60 min后移除培養(yǎng)液，PBS清洗 2～3 遍 。 每 孔 加 入 100 μL，600 μmol/L 的ABAP。對照組只加DCFH-DA探針與ABAP進行處理，空白組只用DCFH-DA處理，清洗后補加等體積的無血清培養(yǎng)基。采用多功能酶標儀測定熒光值。測定的條件：溫度37℃，發(fā)射波長538 nm，激發(fā)波長485 nm，每5 min測定一次，跟蹤測定1 h。采用Origin 8.5軟件計算時間-熒光強度曲線下的積分面積，并且按照公式（4）計算細胞內(nèi)抗氧化活性（CAA）值。

式中，∫SA為加入不同濃度花青素提取物后的熒光值與時間形成曲線的積分面積；∫CA為對照組的熒光值與時間形成曲線的積分面積。

1.3.6 體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活力以及MDA指標的檢測 取對數(shù)生長期的Hep G2細胞配制成3×104個單細胞懸液。接種于6孔培養(yǎng)板中，待貼壁后，用不同質(zhì)量濃度（0，50，100，150 μg/mL）的 BSCA 處理細胞，對照組只加入完全培養(yǎng)基。作用24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗并收集細胞，常溫下1 100 r/min離心5 min，棄上清，每管加100 μL的細胞裂解液，在冰上孵育30 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，取其上清，用BCA試劑盒測其蛋白濃度。按照各試劑盒說明書取上清液用于測定SOD，CAT，GSH-Px，GSH，MDA指標的變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，通過Origin軟件與Excel表格進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。所有試驗重復至少3次，應用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 BSCA成分的分析

通過單因素試驗，確定最佳提取條件及方法：提取劑為60%的乙醇，pH值為2，料液比為1∶30，微波功率500 W、微波時間90 s的微波輔助提取法。經(jīng)HPLC分析BSCA的成分及含量，并與標準品進行比對得出，BSCA所含成分分別是：（1）D3G（占 6.7%），（2）C3G（占 64%），（3）Pt3G（占 3.4%），（4）矢車菊素（占20.5%）（圖1）。其中，所含主要的花青素成分為C3G，含量為10.02 mg/g。

2.2 總抗氧化活性檢測

DPPH與羥自由基清除法檢測了BSCA體外抗氧化性能。由圖2-A可知，BSCA與Vc清除DPPH的能力隨其質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量相關性。BSCA清除DPPH的能力在一定程度上要強于Vc的作用。當BSCA的質(zhì)量濃度在0.075 mg/mL時，清除率為58.5%。而Vc的質(zhì)量濃度在0.1 mg/mL時，清除率才達到55.9%。從圖2-B可以看出，BSCA與Vc對羥自由基的清除作用也同樣隨著質(zhì)量濃度的升高而明顯增強。當BSCA質(zhì)量濃度達到0.6 mg/mL時，對羥自由基的清除率達到64.3%，而Vc對羥自由基的清除率為53.35%?？梢姡珺SCA強于Vc對羥自由基的清除作用。

2.3 BSCA的抗增殖活性檢測

采用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度的BSCA分別作用于肝癌Hep G2、結腸癌HCT116、乳腺癌MCF-7細胞后的細胞增殖情況如圖3所示，BSCA作用細胞一定時間后，其對細胞的抑制作用呈現(xiàn)一種時間-劑量依賴性的降低趨勢。作用48 h后，150 μg/mL的 BSCA對 MCF-7，HCT116和 Hep G2的抑制率分別為19.4%±2.16%，23.06%±2.2%和44.76%±2.96%，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）；200 μg/mL 的 BSCA 對 MCF-7，HCT116 和Hep G2的抑制率分別為25.4%±2.1%，34.3%±1.9%和67.9%±2.3%?？梢姡伟〩ep G2細胞株對BSCA的作用最為敏感，因此，后續(xù)細胞相關試驗均選用Hep G2細胞。

2.4 細胞抗氧化活性（CAA）檢測

細胞抗氧化活性方法用于在細胞水平定量分析食品提取物質(zhì)或日常食用食品的抗氧化能力。自身不帶熒光的探針DCFH-DA可自由通過細胞膜，但在被細胞膜上的酯酶水解后的DCFH不能自由過膜。在自由基誘導劑ABAP處理下，DCFH會在進入細胞后刺激細胞膜產(chǎn)生更多的活性氧，此時進入細胞內(nèi)的DCFH在自由基或活性氧的作用下氧化生成帶熒光的DCF。即可通過檢測DCF的熒光值而檢測出自由基的水平。在抗氧化劑的作用下，即可將自由基清除而阻斷DCFH轉(zhuǎn)變成DCF，最終使熒光強度降低。因此，與對照組相比，細胞內(nèi)熒光強度的減弱，反映出樣品的抗氧化能力。

從圖4-A可以看出，細胞的熒光強度隨著BSCA質(zhì)量濃度的增大而降低，說明BSCA具有抑制細胞內(nèi)產(chǎn)生DCF的能力，即花青素質(zhì)量濃度越大，熒光值越低，抗氧化能力越強。并且與空白組相比，試驗組熒光強度具有顯著差異（P＜0.05）。

從圖4-B可以看出，細胞的熒光強度隨著BSCA質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應關系。按照公式（1）計算得出BSCA抑制自由基氧化DCFH的劑量效應曲線，發(fā)現(xiàn)當BSCA的質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時，CAA值達到了 50（即 EC50值）。

2.5 體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)及MDA指標的檢測

人體自身體內(nèi)存在維持機體抗氧化與非抗氧化平衡的系統(tǒng)，可清除體內(nèi)的自由基。其中，超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）共同構成了體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)。谷胱甘肽（GSH）與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）構成反應體系，消除體內(nèi)脂類過氧化物以及自由基的毒害作用。本研究對SOD，CAT，GSH，GSH-Px的抗氧化酶加以分析，結果表明，隨著BSCA質(zhì)量濃度的增加，幾種酶均有一定程度的升高（表1）。說明BSCA可以增強機體的抗氧化性能。而丙二醛（MDA）在遇到氧化應激的情況下，會發(fā)生脂質(zhì)氧化，對機體造成一定的損傷。將BSCA作用于細胞24 h后，細胞內(nèi)MDA的含量隨著BSCA質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)出降低趨勢。說明BSCA還有助于避免脂質(zhì)的過氧化，增強機體自身的抗氧化系統(tǒng)。

表1 BSCA 對 CAT，SOD，GSH，GSH-Px，MDA 含量的影響

3 討論

本研究采用高效液相色譜技術分析鑒定了山西特產(chǎn)黑豆皮中花青素（BSCA）的組分，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷、矮牽牛素葡萄糖苷和矢車菊素，其中，主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G），其含量達10.02 mg/g。劉占云等[4]利用高效液相色譜法分析了湖北黃仁的、東北青仁與黃仁的、山東濱州青圓的及安徽青扁的4個不同地區(qū)的5種黑豆皮中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）的含量，測定結果為5.263～12.829 mg/g，可見本試驗所用的山西黑豆中含有的C3G成分較高。JANG等[15]采用高效液相色譜法檢測了韓國黑豆中所含花青素的組分是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷和矮牽牛素葡萄糖苷3種成分；LEE等[16]研究表明，黑豆皮中的花青素是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素葡萄糖苷、矮牽牛素葡萄糖苷、天竺葵素葡萄糖苷及矢車菊素5種成分。這些都與本研究山西黑豆皮中所含花青素成分有一定的區(qū)別。

據(jù)文獻[6，9，17]報道，花青素具有一定的抗腫瘤活性。為了進一步研究BSCA的抗癌活性，本研究采用MTT法檢測了BSCA對3種癌細胞增殖的抑制作用，結果表明，BSCA對3種癌細胞均有不同程度的抑制作用，且對肝癌Hep G2細胞的作用最為顯著。

體外抗氧化檢測方法已有大量文獻報道[18-20]。而CAA法是基于傳統(tǒng)的化學抗氧化活性檢測方法（ORAC，TOSC，F(xiàn)RAP，TEAC，TRAP） 以外的一個有重大改進的方法[19]。此方法不僅相對簡單、省時、耗材較少，最主要是以很簡便的方式模擬生物體內(nèi)環(huán)境，CAA檢測涉及到了細胞吸收、代謝以及具有重要調(diào)控作用的生物活性成分的分布等方面。因此，CAA法研究結果更加貼切的體現(xiàn)抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)所發(fā)揮的抗氧化性能。本研究CAA法結果顯示，BSCA具有明顯的細胞內(nèi)抗氧化活性。同時，檢測了BSCA對體內(nèi)固有的抗氧化酶的影響，發(fā)現(xiàn)BSCA均有助于酶活性的增強，使來源于黑豆花青素的抗氧化活性具有更明顯的應用價值。

綜上所述，黑豆皮花青素可以作為天然無毒副作用的抗氧化劑加以開發(fā)成保健食品。

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