鐵皮石斛高效快速繁殖體系研究

盧 莉 ，劉曉芳 ，Saad Abdel r ahman ，王景雪

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.新英格蘭大學環(huán)境與農(nóng)業(yè)學院，澳大利亞 阿米代爾 2350）

鐵皮石斛為我國古老的中藥材，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《中藥大詞典》等書籍中都有記載，以莖入藥，具有益胃生津、延年益壽、滋陰、明目等功效，被國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”[1]。鐵皮石斛植株內(nèi)有許多生物活性成分，大分子包括凝集素、細胞分裂素氧化酶、生物堿和多糖，其中，石斛多糖有免疫調(diào)節(jié)的作用[2]。生物堿有抗氧化、抗癌和神經(jīng)保護的作用；其他化合物也具有抗氧化、抗癌和免疫調(diào)節(jié)的作用[3-4]。隨著現(xiàn)代科技的進步，鐵皮石斛被越來越多的學者所研究，研究其中的有效成分及其發(fā)揮藥性的基因。市場上的相關(guān)產(chǎn)品多種多樣，有干制品“鐵皮楓斗”，有新鮮的石斛莖條，也有鐵皮石斛和其他中藥按一定比例制成的保健品。鐵皮石斛自然繁殖率較低，而且由于生活環(huán)境缺失、農(nóng)業(yè)的過度開發(fā)、城市化、過度采集以及醫(yī)藥的使用等原因[5-6]，導致野生鐵皮石斛每年的產(chǎn)量非常少。目前，野生鐵皮石斛資源接近瀕危，組培苗移栽田間往往存在成活率低的問題。另外，移栽苗對栽培環(huán)境和管理技術(shù)要求較高，栽培基質(zhì)對鐵皮石斛移栽的成活率和生長繁殖影響很大[7]，而且要求在田間生長的時間較長，因此，利用懸浮培養(yǎng)方法培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖，可為鐵皮石斛產(chǎn)品提供新的原材料[8]。

常規(guī)的鐵皮石斛組織培養(yǎng)體系是采用固體培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng)，該培養(yǎng)方式具有簡便、容易操作、不易污染等優(yōu)點；但是也存在生長較慢、培養(yǎng)設施占地空間較大等弊端。而石斛原球莖懸浮培養(yǎng)具有生長周期短、效率高、成本低等優(yōu)點，是解決石斛增殖效率低的有效途徑之一，也是近幾年研究的熱點[9]。史俊等[10]選用15種液體培養(yǎng)液對鐵皮石斛種子懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基進行了篩選，得到的最佳懸浮培養(yǎng)基為：1/2 MS＋0.5 mg/L NAA＋80 g/L土豆汁＋45 g/L蔗糖。研究發(fā)現(xiàn)，相對較低的無機鹽濃度對種子的萌發(fā)有較顯著的影響，低濃度的NAA，不添加6-BA有利于原球莖的形成，不添加激素也可以誘導出原球莖。賈煒瓏等[11]探討康乃馨、菊花快速繁殖的培養(yǎng)基激素組成時發(fā)現(xiàn)，低濃度的6-BA和適當濃度的NAA可以有效促進幼苗分化且移栽成活率較高。

本試驗旨在研究一種結(jié)合懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)2種方式優(yōu)化鐵皮石斛快速繁殖的技術(shù)，以縮短鐵皮石斛種子誘導原球莖到再生植株成苗的組織培養(yǎng)周期，為鐵皮石斛種苗工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用種子是山西大學生命科學學院植物學實驗室鐵皮石斛人工授粉所得。

1.2 方法

固體培養(yǎng)條件：接種后的培養(yǎng)基放置在組培室內(nèi)，溫度25℃左右，光照強度1 500 lx，光照時間為12 h/d。

懸浮培養(yǎng)條件：接種后的培養(yǎng)基放在搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速110 r/min，溫度25℃左右，光照強度1 500 lx，光照時間為12 h/d。

1.2.1 鐵皮石斛種子萌發(fā) 取人工授粉后、成熟保持新鮮且尚未開裂的蒴果（圖1-A），先沖洗干凈，再用75%的酒精、0.1%HgCl2消毒，然后用無菌水沖洗，無菌濾紙吸干水分[12]，接種于MS培養(yǎng)基上。將接種好的種子置于植物組培室進行無菌培養(yǎng)。

1.2.2 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng) 以30 g/L蔗糖為基礎，采用正交設計方案，確定了4個試驗因素：基本培養(yǎng)基、（NH4）2SO4與 KNO3的質(zhì)量比、細胞分裂素6-BA、生長素NAA，基本培養(yǎng)基為花寶一號[13]、N6和1/2 MS共3個水平，（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比分別設0.33 g/L∶0.525 g/L，0.99 g/L∶1.515 g/L，1.65 g/L∶0.505 g/L共3個水平，細胞分裂素6-BA為0.1，0.3，0.5 mg/L共3個水平，生長素NAA為0.4，0.6，0.8 mg/L共3個水平，采用L9（43）正交表，進行4因素3水平正交試驗，共9個處理。稱取0.1g原球莖接種于30mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d，每個處理接種5瓶，重復3次，每處理共15瓶。接種后的培養(yǎng)基放入搖床內(nèi)，30 d后統(tǒng)計原球莖的鮮質(zhì)量和長勢。

1.2.3 鐵皮石斛原球莖分化 以25g/L蔗糖＋6.5g/L瓊脂＋1 g/L活性炭為基礎，采用正交設計方案，確定了4個試驗因素：基本培養(yǎng)基、細胞分裂素6-BA、生長素NAA、土豆汁，基本培養(yǎng)基為1/2 MS，N6，Kc共3個水平，細胞分裂素6-BA為0.1，0.2，0.3 mg/L共3個水平，生長素NAA為0.2，0.4，0.6 mg/L共3個水平，土豆汁為50，75，100 g/L共3個水平，采用L9（43）正交表，進行4因素3水平正交試驗，共16個處理。取懸浮培養(yǎng)30 d后的原球莖，用鑷子將其輕輕移入固體培養(yǎng)基中，每瓶移入6個，每個處理接種6瓶，重復3次，每處理共18瓶。接種后的培養(yǎng)基標號放入組培室內(nèi)，60 d后統(tǒng)計原球莖的鮮質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計結(jié)果在Excel上處理計算，先用Graphpad prism軟件進行方差分析，然后進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛種子萌發(fā)

按1.2.1所述方法，用鐵皮石斛的種子誘導原球莖。鐵皮石斛種子接種于不添加任何植物激素的培養(yǎng)基里萌發(fā)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 d后種子膨大、發(fā)綠，30 d后測其直徑為0.473～0.523 mm（圖1-B）。

2.2 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)

將鐵皮石斛種子固體培養(yǎng)30 d后所得的原球莖接種于液體培養(yǎng)基中增殖，研究基本培養(yǎng)基、細胞分裂素6-BA、生長素NAA和（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比對原球莖增殖的影響（表1，2）。鐵皮石斛原球莖在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后的生長情況如圖1-C所示，原球莖分化程度高，增殖效率高，但顏色有些發(fā)白。由表1可知，（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比為0.33 g/L∶0.525 g/L時在懸浮培養(yǎng)原球莖試驗中占主要位置，4個因素對原球莖增殖率的影響大小順序為：（NH4）2SO4∶KNO3＞基本培養(yǎng)基＞細胞分裂素6-BA＞生長素NAA。采用方差分析進一步驗證得出（表 2），（NH4）2SO4與 KNO3質(zhì)量比的 F值最大，達到極顯著水平，說明（NH4）2SO4與KNO3的質(zhì)量比在原球莖增殖中影響最大；基本培養(yǎng)基也達到極顯著水平，影響力次之。

表1 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)正交試驗結(jié)果

表2 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)方差分析結(jié)果

2.3 鐵皮石斛原球莖分化

將液體培養(yǎng)30 d后的原球莖接種到固體培養(yǎng)基上，研究基本培養(yǎng)基、細胞分裂素6-BA、生長素NAA、土豆對原球莖分化的影響。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計原球莖的鮮質(zhì)量，其結(jié)果如表3所示。

鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)后在固體培養(yǎng)基上生長60 d，最優(yōu)鮮質(zhì)量為4.07 g，大部分幼苗有分化現(xiàn)象，長勢良好（圖1-D）。

從表3，4可以看出，試驗中4個因素對幼苗鮮質(zhì)量影響的主次順序為：細胞分裂素6-BA＞基本培養(yǎng)基＞生長素NAA＞土豆，細胞分裂素6-BA和基本培養(yǎng)基都達到了極顯著水平，在幼苗生長過程中影響很大；生長素NAA達到了顯著水平，影響力次之；有機添加劑土豆對于幼苗生長的影響力較弱。

對試驗中各因素各水平之間的平均數(shù)進行多重比較，以分析確定哪2個水平之間的差異顯著，結(jié)果列于表5。

由表5可知，基本培養(yǎng)基中Kc培養(yǎng)基的原球莖鮮質(zhì)量與N6培養(yǎng)基處理間有顯著性差異；細胞分裂素6-BA濃度為0.1 mg/L的原球莖鮮質(zhì)量與0.2，0.3 mg/L處理間有顯著性差異；生長素NAA的濃度為0.6 mg/L的原球莖鮮質(zhì)量與0.2 mg/L的處理間差異顯著性達到0.05水平。

表3 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)之后的固體培養(yǎng)正交試驗結(jié)果

表4 鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)之后的固體培養(yǎng)方差分析試驗結(jié)果

表5 各因素各水平之間平均數(shù)多重比較的結(jié)果

經(jīng)研究，篩選出鐵皮石斛不同生長階段最佳繁 殖體系如表6所示。

表6 鐵皮石斛原球莖最佳繁殖體系

3 討論

徐玲等[14]用不同有機附加物組合對鐵皮石斛原球莖鮮質(zhì)量增質(zhì)量進行研究，結(jié)果表明，在培養(yǎng)60 d后，原球莖鮮質(zhì)量增質(zhì)量最高的培養(yǎng)基是MS＋0.5 mg/L NAA＋1 mg/L 6-BA＋100 g/L土豆汁＋100 g/L小麥面粉＋20 g/L蔗糖＋6 g/L瓊脂＋0.5 g/L活性炭，鮮質(zhì)量是不添加有機附加物對照的5.35倍。本試驗中原球莖增殖采用懸浮培養(yǎng)，優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.4 mg/LNAA＋0.1 mg/L 6-BA＋0.33 g/L（NH4）2SO4∶0.525 g/L KNO3＋30 g/L蔗糖，在培養(yǎng)30 d，原球莖鮮質(zhì)量平均增殖率為6.73%。侯丕勇等[15]用不同激素對懸浮培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖在固體培養(yǎng)基上生長和分化進行研究，結(jié)果得出，NAA對原球莖的分化作用較好，與本試驗得出的結(jié)論生長素NAA對懸浮培養(yǎng)后原球莖增殖分化長成幼苗的影響中達到了顯著水平的結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，以種子為外植體，在固體培養(yǎng)基萌發(fā)、液體培養(yǎng)基增殖、再接種到固體培養(yǎng)基分化生根的體系，具有促進原球莖增殖、大大增加原球莖分化率、縮短組培時間、節(jié)省生產(chǎn)空間、節(jié)約成本、生根率較高（達90.1%）等特點，適合大規(guī)模推廣。

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