雞人工感染弓形蟲病的組織學病理變化

李靜靜

(慶陽市慶城縣動物疫病預防控制中心，甘肅 慶陽 745100)

弓形蟲病是由剛第弓形蟲引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患原蟲病。該病在世界各地流行非常廣泛，在畜牧業(yè)行業(yè)中，弓形蟲的危害作用日益顯著，造成的經(jīng)濟損失日益增長，對畜禽健康生長造成較嚴重的制約。通常單一的感染不能引起明顯的臨床癥狀，但是一旦繼發(fā)感染，可造成嚴重后果，患病動物死亡率會大大增加，可造成嚴重的經(jīng)濟損失。該病的感染源主要是病畜和帶蟲動物。貓及貓科動物是弓形蟲的終末宿主。其中被終末宿主貓排出的卵囊污染的飼料、飲水或事具均可成為家畜感染的重要來源。畜禽和多種野生動物對弓形蟲均具有感染性，其中包括 200多種哺乳動物、70多種鳥類、5種變溫動物和一些節(jié)肢動物。一般以經(jīng)口感染為主，也可經(jīng)破損的皮膚和粘膜感染。家畜弓形蟲病一年四季均可發(fā)，但一般以夏秋季居多。

弓形蟲只有單一蟲種，但同一蟲株對不同宿主的敏感性、致病性差異較大，有滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊5種主要形態(tài)，需要兩個宿主，經(jīng)歷無性生殖和有性生殖兩個生殖過程。前兩種蟲體形態(tài)主要存在于中間宿主體內(nèi)，后三種蟲體主要出現(xiàn)在終末宿主體內(nèi)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 切片機、攤片機、烘片機、顯微鏡等。

1.1.2 主要試劑 10%福爾馬林溶液、75%酒精、80%酒精、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、 100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ、5%的酸化液、蘇木素染液、酸水分化、伊紅染液、中性樹膠等。

1.2 方法

1.2.1 切片操作 進行石蠟的切片及HE染色，顯微鏡下觀察脾臟、肝臟、腎臟的病理學變化。

1.2.2 感染方法 病料人工經(jīng)口感染弓形蟲病的雞的脾臟、肝臟和腎臟。

2 石蠟切片，HE染色

2.1 石蠟切片

2.1.1 取材 用取材器輕輕地取脾臟、肝臟、腎臟的小塊組織為組織塊，不用力牽引，不再組織上來回拖拉，以免造成組織的結構損傷。①樣品要求：長，寬各1 cm左右，厚不得超過5 cm。②固定液：10%福爾馬林固定液：組織塊=20∶1。③固定時間：3～5 h，密封瓶口，封前換液。④修塊：順著組織方向，將切面修平，標記，編號，用紗布包好，用于下步脫水固定。

2.1.2 脫水過程 ①水洗，將固定組織塊放入廣口瓶，瓶口用紗布包好，置流水下水洗，水洗時間為12 h 。②脫水，經(jīng)過固定后的組織塊沖洗后進行脫水，脫水的目的是將組織內(nèi)的水分用酒精置換出來，使組織變硬，為熔化的石蠟浸滲到組織中創(chuàng)造條件。脫水的順序依次是：75%酒精 → 80%酒精→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ→100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ。脫水時間為各1h。③透明，透明是切片前必經(jīng)之步。其目的在于用礦物油或植物油等透明劑置換出無水酒精，以便于熔化的石蠟浸滲到組織間隙內(nèi)。經(jīng)過透明劑處理的組織塊用肉眼觀察呈透明現(xiàn)象，因此將這個過程稱為透明。透明的順序依次是：酒精(100%)；二甲苯=1∶1 → 二甲苯Ⅰ→ 二甲苯Ⅱ→透明時間為各10 min。

2.1.4 浸蠟 浸蠟是將包埋組織用的物質(zhì)深入到所有的組織間隙中，然后將這種物質(zhì)凝固，從而將組織材料包埋其中的方法。浸蠟順序依次是：二甲苯∶石蠟=1∶1 →石蠟Ⅰ→石蠟Ⅱ→ 石蠟Ⅲ 。浸蠟的時間：二甲苯∶石蠟=1∶1為30 min，石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ的時間各1 h。浸蠟時溫箱的溫度應保持在56～58℃。

2.1.5 包埋 包埋首先在金屬框架上涂抹凡士林，以保證石蠟倒入后不會外溢。將包埋用石蠟及浸蠟組織塊放在有石棉網(wǎng)的電爐上保溫。在框架中先倒入少許包埋用石蠟，再用鑷子將組織塊迅速移入框架，再倒入石蠟，待完全凝固后取出待用。

2.1.6 修蠟 取已包埋好的蠟塊，用解剖刀將組織塊周圍多余的石蠟切去，把有組織的蠟塊修成正方形或梯形，用于切片。

2.1.7 切片及展片 將修好的蠟塊固定于切片機上，調(diào)好距離和厚度，然后右手搖動手柄切成5～8 μm薄片,切下的薄片用毛筆挑取放到加熱的水中展平，以便附貼。

2.1.8 附貼及烘片 將涂有附貼液(雞蛋清)的載玻片在展片池中撈取一展平的切片，放到烘片機上烘干，烘片機溫度應保持在40～45℃之間，烘片時間為1 h。

2.2 染色

2.2.1 脫蠟 脫蠟的順序依次為 二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→ 100%酒精Ⅰ→ 100%酒精Ⅱ→ 95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ→ 80%酒精→自來水水洗。脫蠟的時間：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟各10 min，100%酒精Ⅰ脫二甲苯10 min，100%酒精Ⅱ、95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、80%酒精脫二甲苯各5 min，自來水去酒精5 min。

2.2.2 染色 染色的順序依次為5%的酸化液 →蘇木素染液→沖洗→酸水分化→沖洗→伊紅染液。染色時間： 5%的酸化液為5 s，蘇木素染液為細胞核著色5 min，清水沖洗15 min，酸水分化液 (75%的酒精加500 mL的鹽酸就是0.5%的鹽酸酒精)10～20 s ，清水沖洗為淡藍色大概20 min即可，伊紅染液為細胞質(zhì)著色，一般為3 min。

2.2.3 脫水 脫水順序依次為 80%酒精→95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ → 100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ →二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ 。 80%酒精顏色淡化5 min， 95%酒精Ⅰ、95%酒精Ⅱ、100%酒精Ⅰ各5 min，100%酒精Ⅱ10 min ，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明時間分別為5 min、10 min。

2.2.4 封片及烤片 取一蓋玻片，輕輕以蓋玻片的一邊接近中間滴有中性樹膠的載玻片，然后迅速放下蓋玻片，中性樹膠會迅速擴張到四周，校正好蓋玻片方向。將封好的切片放置在45℃烘片機上烘烤一夜。

3 結果

3.1 剖檢眼觀病理變化

脾臟稍腫并且有散在出血點。肝臟腫大，其表面散在粟粒大的出血點。腎臟蒼白，略腫，被膜下散在小出血點。

3.2 鏡檢結果

3.2.1 脾臟的病理學變化 脾臟充血出血(詳見圖1)，水腫，脾竇含血量增多，紅髓中可見壞死灶。被膜及小梁因平滑肌細胞水腫而略增厚，在有核細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量弓形蟲滋養(yǎng)體，他們有的呈月芽狀或弓形，有的呈檸檬狀，圓形，橢圓形等多樣形狀。許多滋養(yǎng)體簇集在1個細胞內(nèi)形成假囊，在一視野里平均可找1個假囊(詳見圖2)。脾細胞大量壞死，有的已破裂崩解，滋養(yǎng)體從中逸出，有的細胞內(nèi)充滿了滋養(yǎng)體。細胞核已消失。此外脾組織內(nèi)充滿紅細胞，呈出血性壞死性炎癥。血液細胞內(nèi)的白細胞被滋養(yǎng)體破壞。

3.2.2 肝臟的病理學變化 肝細胞大量壞死，有的已破裂崩解，滋養(yǎng)體從中逸出，有的細胞內(nèi)充滿了滋養(yǎng)體。細胞核已消失。此外肝組織內(nèi)充滿了紅細胞，呈出血性壞死性炎癥，肝組織間隙內(nèi)有大量嗜酸性細胞浸潤，血液細胞內(nèi)的白細胞被滋養(yǎng)體破壞。中央靜脈充血出血(詳見圖3)，肝細胞發(fā)生顆粒變性和空泡變性，間質(zhì)細胞增生(詳見圖4)。

3.2.3 腎臟的病理學變化 腎小球充血出血(詳見圖5)，水腫，腎小管漿液性滲出(詳見圖6)，在部分腎間質(zhì)有嗜酸性粒細胞浸潤，其間質(zhì)細胞發(fā)生壞死。腎小管上皮細胞顆粒變性和空泡變性(詳見圖7)。

圖3 肝臟中央靜脈充血出血。(HE，×400) 圖4 肝臟內(nèi)滋養(yǎng)體崩解。(HE，×400)

圖7 箭頭所指為腎小管上皮細胞充血，水腫，漿液滲出。(HE，×400)

4 結論

本實驗結果得出雞人工經(jīng)口感染弓形蟲病病原體后，剖檢病變和組織學病理變化最明顯的皆是脾臟、肝臟、腎臟，病理變化發(fā)現(xiàn)其有嚴重的充血出血，水腫。鏡檢發(fā)現(xiàn)在有核細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量弓形蟲滋養(yǎng)體，它們有的呈月芽狀或弓形，有的呈檸檬狀，圓形，橢圓形等多樣形狀。許多滋養(yǎng)體簇集在1個細胞內(nèi)形成假囊，在一視野里平均可找1個假囊。肝脾細胞大量壞死，有的已破裂崩解，滋養(yǎng)體從中逸出，有的細胞內(nèi)充滿了滋養(yǎng)體。細胞核已消失。此外肝臟、脾臟組織內(nèi)充滿紅細胞呈出血性壞死性炎癥血液細胞內(nèi)的白細胞被滋養(yǎng)體破壞。由此得出弓形蟲病對雞的養(yǎng)殖和人類健康存在很大的威脅，需引起人類重視。尤其在粗放型養(yǎng)雞場中，必須加強雞場的衛(wèi)生防護以保護養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展和人類健康。

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