三氮脒注射液在山羊體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較

張 超，曾楊梅，姜 波，吳俊偉.*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460；2.重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司)

三氮脒屬于芳香雙脒類，是傳統(tǒng)的廣譜抗血液原蟲藥，對(duì)家畜梨形蟲、錐蟲和無(wú)形體均有治療作用，并在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上具有廣泛的運(yùn)用。由于注射用三氮脒粉末配制后易降解不能長(zhǎng)期保存，且用量不準(zhǔn)易導(dǎo)致中毒，導(dǎo)致三氮脒中毒的病例頻發(fā)。重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司獨(dú)立自主研制出一種新制劑三氮脒注射液，具有高度穩(wěn)定、安全的特性，且在集中化、規(guī)?；念A(yù)防和治療疾病的過(guò)程中能達(dá)到快速、準(zhǔn)確的效果。雖然注射用三氮脒已有報(bào)道兔、豬、綿羊等藥動(dòng)學(xué)的研究，但不同劑型在不同動(dòng)物中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)必會(huì)有所差異。為指導(dǎo)新藥設(shè)計(jì)和制定臨床給藥方案提供依據(jù)，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)三氮脒注射液與注射用三氮脒的比較藥動(dòng)學(xué)研究，得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為三氮脒注射液在臨床上的安全、合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：配備自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外檢測(cè)器，Waters 2695系列(美國(guó)Waters公司)，色譜柱：Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。電子分析天平，型號(hào)CPA225D(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，渦旋混合器，型號(hào)XW-80A(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，高速離心機(jī)，1-14 型(德國(guó) SIGMA 公司)，可調(diào)微量移液器10～100、1000 μL(德國(guó) Eppendorf公司)。

1.2 藥品和試劑

三氮脒對(duì)照品(NGL Fine-Chem Ltd, India，批號(hào)DA/K/121/12，含量86.9%)；7% 三氮脒注射液(重慶布爾動(dòng)物藥業(yè)有限公司研制，規(guī)格：100 mL∶7 g)；注射用三氮脒(蘭州正豐藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：1 g)。甲醇、乙腈(美國(guó)Thermo公司，色譜純)，磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸為分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

重慶大足黑山羊，12只，雌雄各半，6～8月齡左右，體重范圍20～25 kg，試驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)，飲水、飼喂不含任何藥物。

1.4 給藥與采樣

動(dòng)物按隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為2組。試驗(yàn)前測(cè)定制劑的含量，按照2010版《獸藥使用指南》選擇3.5 mg·kg-1體重分別頸部肌內(nèi)注射三氮脒和三氮脒注射液。

給藥前采取空白血漿，給藥后0.083 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、10 h、24 h、48 h，每次采血約3 mL，置于肝素鈉抗凝管中，3000 r/min離心10 min，用移液器小心吸取血漿于1.5 mL EP管中，每個(gè)樣品保存兩份，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品處理

取500 μL血漿樣品，加入750 μL的沉淀劑(乙腈)，立即渦旋混勻，靜置后14000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系針筒式過(guò)濾器過(guò)濾后用于HPLC分析。

1.6 色譜條件

流動(dòng)相：0.085 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇=85:15(V/V)，進(jìn)樣量：40 μL，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：40 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng): 370 nm。

1.7 回收率和變異系數(shù)

將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液加入山羊空白血漿中，配得低(0.5 μg·mL-1)、中(2 μg·mL-1)和高(5 μg·mL-1) 三個(gè)樣品濃度，按1.5 樣品處理方法處理樣品，進(jìn)行HPLC測(cè)定；同時(shí)分別取濃度為 0.5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1三氮脒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行 HPLC測(cè)定，不同濃度樣品分別重復(fù)5次，以峰面積比計(jì)算，求其回收率。每批(日內(nèi)) 作 5次重復(fù)，共作 5 個(gè)批次(日間)。計(jì)算每批內(nèi)和每批間的色譜峰面積平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤，求得各變異系數(shù)。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

在1.5 mL 的離心管中各加入空白血漿450 μL，后依次加入濃度為250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品工作液50 μL，制得三氮脒濃度為10μg·mL-1、5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1的血漿樣品，渦旋混勻，按血漿樣品方法處理后進(jìn)樣分析，以三氮脒色譜峰面積為橫坐標(biāo)(A)，藥物濃度(B) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.9 樣品測(cè)定與數(shù)據(jù)處理

給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿樣品經(jīng)處理后，進(jìn)行HPLC測(cè)定，采用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件，用Marquardt法以權(quán)重1，1/C，1/C2 3種進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)WSS和AIC值判斷最佳藥動(dòng)學(xué)模型。采用SPSS 20對(duì)血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物的紫外吸收光譜

取三氮脒對(duì)照品適量，制成水溶液，采用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在251 nm和370 nm均有吸收，而在370 nm處吸收值最大，且此波長(zhǎng)靠近可見光范圍，對(duì)其他雜質(zhì)吸收比較弱，故選擇370 nm作為試驗(yàn)的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 三氮脒對(duì)照品水溶液紫外掃描圖譜

2.2 方法的專屬性

在1.6的色譜條件下，三氮脒的保留時(shí)間為8.3 min。與血漿中的其他雜質(zhì)有效分離，峰型對(duì)稱性良好，無(wú)明顯拖尾，色譜圖如圖2。

2.3 線性范圍

血漿中三氮脒線性回歸方程為Y=16816X-1939.5 (r2=0. 9992)，線性范圍為0.2～10 μg·mL-1，按信噪比S/N=3為檢測(cè)限(LOD)，S/N=10為定量限(LOQ)，求得本方法測(cè)定血漿中三氮脒檢測(cè)限為0.1 μg·mL-1，定量限為0.2 μg·mL-1。

2.4 回收率和變異系數(shù)

按上述樣品處理方法，在0.5 μg·mL-1、2 μg·mL-1、5 μg·mL-1濃度下，平均回收率在(69.55±1.20)% ～(78.77±1.26)% 之間，批內(nèi)和批間系數(shù)均不超過(guò)10.0%。由此可知，此血漿處理方法用液相檢測(cè)方法可靠，重復(fù)性好。

A: 空白血漿；B:三氮脒對(duì)照品溶液；C:空白血漿添加三氮脒對(duì)照品；D:空白血漿添加三氮脒注射液圖2 三氮脒專屬性高效液相色譜圖

2.5 血藥濃度和主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

三氮脒在山羊體內(nèi)符合一級(jí)吸收二室模型，三氮脒不同時(shí)間點(diǎn)血藥濃度平均值見表1，GraphPad Prism 5繪制藥時(shí)曲線見圖3，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

表1 單劑量注射三氮脒后各采血點(diǎn)羊血漿中三氮脒濃度(x±s，n=6)

圖3 山羊單劑量肌內(nèi)注射三氮脒注射液與注射用三氮脒后藥時(shí)曲線

3 討論

3.1 方法學(xué)

根據(jù)紫外掃描結(jié)果，在370±2 nm的整數(shù)波長(zhǎng)范圍內(nèi)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，選擇370 nm作為本試驗(yàn)的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

試驗(yàn)前查看文獻(xiàn)報(bào)道三氮脒的流動(dòng)相，并根據(jù)條件比較選擇不同流動(dòng)相，最終選定磷酸鹽緩沖液和乙腈作為流動(dòng)相，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值在3.0左右。經(jīng)過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的比例，使保留時(shí)間適中并與雜質(zhì)有效分離，且色譜峰尖銳；在流動(dòng)相中加入0.1%三乙胺使之先與色譜柱固定相中的硅羥基結(jié)合，從而減少三氮脒上的脒基等基團(tuán)在離子鍵、化學(xué)鍵等作用導(dǎo)致的峰拖尾；pH值在3.0可以抑制色譜柱中十八烷基硅烷鍵合硅膠中的硅羥基離子化，減少離子間相互作用、有助于三氮脒分離，形成良好峰型。最終確定流動(dòng)相為：0.085 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(含0.1%三乙胺，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)︰ 甲醇=85︰15(V/V)。

血漿中的藥物含量是反映動(dòng)物體內(nèi)藥物濃度的重要指標(biāo)。為了準(zhǔn)確測(cè)定血漿中的藥物含量，需要完全釋放與蛋白結(jié)合的藥物，并去除蛋白質(zhì)，同時(shí)也可保護(hù)儀器性能免受損害，延長(zhǎng)色譜柱的使用期限。日常常用的蛋白沉淀劑是甲醇、乙腈、丙酮等與水混溶的有機(jī)溶劑，通過(guò)與蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚。通過(guò)篩選最終選擇乙腈作為沉淀劑，操作簡(jiǎn)便并能有效的除去蛋白質(zhì)，儀器響應(yīng)值高，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確。

表2 羊單劑量注射三氮脒注射液與注射用三氮脒后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

3.2 藥動(dòng)學(xué)比較

從吸收半衰期(t1/2ka)、分布半衰期(t1/2α)可以看出三氮脒注射液比三氮脒具有緩慢吸收、快速分布的特性，從而保證藥物在體內(nèi)的安全性。試驗(yàn)中三氮脒的達(dá)峰濃度(Cmax)為5.97 μg·mL-1、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為0.22 h與報(bào)道大致相符，與三氮脒注射液的Cmax為7.63 μg·mL-1和Tmax為0.40 h比較，三氮脒注射液在體內(nèi)達(dá)到平衡時(shí)所需要的時(shí)間更長(zhǎng)和濃度更高的特點(diǎn)，表明三氮脒注射液的安全性更好，不良反應(yīng)更少。三氮脒的藥時(shí)曲線下面積(AUC)為53.96 μg·mL-1*h，與報(bào)道三氮脒在治療急性感染期牛的AUC為49.05 μg·mL-1*h基本相符，而三氮脒注射液的藥時(shí)曲線下面積AUC增加了23.47 μg·mL-1*h，表明藥物在山羊體內(nèi)的含量更高，作用時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，起到緩釋長(zhǎng)效的特點(diǎn)。劑型是影響藥物動(dòng)力學(xué)的重要因素，不同劑型的藥物在機(jī)體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征有所差異。姚龍泉等報(bào)道，不同劑型三氮脒在正常動(dòng)物體內(nèi)，達(dá)峰濃度存在顯著差異。通過(guò)改變藥物的劑型研發(fā)具有高度穩(wěn)定、安全且使用方便的產(chǎn)品將是一種趨勢(shì)。

三氮脒注射液以3.5 mg·kg-1肌內(nèi)注射后，山羊血漿中Cmax可達(dá)到7.63 μg·mL-1，在給藥后24 h內(nèi)血藥濃度維持在0.89 μg·mL-1，高于對(duì)常見原蟲的MIC值，因此，推薦三氮脒注射液可按3.5 mg·kg-1劑量注射給藥，1 ～2日1次。

參考文獻(xiàn):

[1] 李彥軍，梁建忠，李曉婷，等. 新生羔羊三氮脒中毒的病例報(bào)告[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2017(07): 105-106.

[2] 梁盼紅. 1例藏獒三氮脒中毒的生化檢驗(yàn)及治療[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技. 2015(06): 39-40.

[3] 姚龍泉，張西臣，陳國(guó)慶，等. 三氮脒、三氮脒脂質(zhì)體和復(fù)方三氮脒注射液在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和組織殘留[J]. 中國(guó)寄生蟲病防治雜志. 2002(06): 51-54.

[4] 趙吉祥，李博，路文華，等. 豬血漿樣品中三氮脒質(zhì)量濃度的高效液相色譜測(cè)定方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2014(01): 93-97.

[5] Staroverov S A, Sidorkin V A, Fomin A S, et al. Biodynamic parameters of micellar diminazene in sheep erythrocytes and blood plasma[J]. J Vet Sci. 2011, 12(4): 303-307.

[6] Lewis K M, Cohn L A, Birkenheuer A J, et al. Pharmacokinetics of diminazene aceturate in healthy cats[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. 2012, 35(6): 608-610.

[7] 劉瑾，曾振靈，余靜賢，等. 牛乳中三氮脒殘留高效液相色譜檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2012(05): 533-536.

[8] 金錄勝，陳莎莎，李樹綱，等. 反相高效液相色譜法測(cè)定三氮脒有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志. 2010(06): 41-43.

[9] Kassaye L, Hymete A, Bekhit A A, et al. Validation of an HPLC method for the simultaneous determination of diminazene diaceturate and phenazone in injectable veterinary granules and bulk powders[J]. Pak J Pharm Sci. 2012, 25(1): 255-259.

[10] Mamman M, Mckeever D J, Aliu Y O, et al. Pharmacokinetics of diminazene in plasma and lymph of goats[J]. Am J Vet Res. 1996, 57(5): 710-714.