犬瘟熱核衣殼蛋白原核表達(dá)及蛋白純化

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(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 廣西 南寧 530004；2.廣西玉林市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所)

犬瘟熱(Canine distemper , CD) 是由副粘病毒科副粘病毒亞科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒( Canine distemper virus, CDV) 引起的一種累及犬科和其他食肉目動(dòng)物的高度接觸傳染性、致死性傳染病。在臨床上以雙相熱、卡他性鼻炎以及隨后引起支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重胃腸炎和神經(jīng)癥狀等為主要特征，且容易繼發(fā)其它病毒或細(xì)菌的混合感染和二次感染。發(fā)病率幾乎達(dá)100%，死亡率達(dá)30%～80%不等，素有“毀滅性傳染病”之稱。犬瘟熱病毒為單股不分節(jié)段的、非重疊的負(fù)鏈RNA病毒。病毒粒子中的主要蛋白有核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、附著蛋白或血凝蛋白(H)。N蛋白是CDV中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，N蛋白構(gòu)成螺旋狀的殼體，供RNA結(jié)合。N蛋白是具有免疫原性的保守結(jié)構(gòu)蛋白。N蛋白上含有B淋巴細(xì)胞抗原表位，在細(xì)胞免疫方面有著重要作用；且N蛋白與病毒的毒力密切相關(guān)，在病毒感染時(shí)可引起強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，尤其在感染初期F和H蛋白特異性抗體低于檢測(cè)水平時(shí)，N蛋白特異性抗體仍能被檢出。因此，N蛋白在犬瘟熱診斷上具有重要意義。本研究旨在克隆CDV-N截短體基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)產(chǎn)物，純化CDV-截短體蛋白，為制備CDV單克隆抗體和膠體金診斷試紙條奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21，pMD18T-CDV-N和 pET30a質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T質(zhì)粒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 主要試劑

LA Taq 酶、DNA marker購(gòu)自大連寶生物公司，限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、HimdⅢ、T4 DNA連接酶、蛋白預(yù)染marker 購(gòu)自Fermentas 公司，鼠源性His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 購(gòu)自北京康為公司； Ni-NTA agarose購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.3 CDV-N截短體基因克隆

CDV-N基因全長(zhǎng)1572bp，共編碼523個(gè)氨基酸。用DNAStar 軟件預(yù)測(cè)CDV-N588蛋白B細(xì)胞抗原表位，選擇其中抗原表位集中的一段(氨基酸位點(diǎn)：328-523)用于原核表達(dá)。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CDV-N截短體上游引物 5'-TATGGATCCTCCTACCCACTGCTCT-3' 及下游引物 5'-CCCAAGCTTATTGAGTAGCTCTCTATC-3'。上游引物中引入BamH I 酶切位點(diǎn)，下游引物中引入Hind III 酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為588 bp。引物由廣州invitogen公司合成。以pMD18T-CDV-N 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增CDV-N截短體基因。 PCR 反應(yīng)體系：LA Taq 0.5 μL 10×LA PCR Buffer 5 μL, dNTP 8μl, 模板1μL ，上、下游引物(25μM)各1 μl ，加水至50μl。 PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，LA 平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑斑、增菌，小提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送廣州invitogen公司測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD18T-CDV-N588。

1.4 CDV-N截短體基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)pMD18T-CDV-N588和pET30a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Bam H Ⅰ和Himd Ⅲ 分別雙酶切 ，分別膠回收CDV-N588片段和線性化的pET30a，T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜, LA 平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑斑、增菌，小提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送廣州invitogen公司測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET30a-CDV-N588。

1.5 His-CDV-N588 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET30a-CDV-N588轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落，加入含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)(220 rpm )過(guò)夜。取重組菌按1∶50的體積比轉(zhuǎn)接入含50 mg/L卡那霉素的15 mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8 時(shí)，取少量菌液作為陰性對(duì)照，剩余菌液中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在37℃中誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.6 His-CDV-N588 融合蛋白純化

將重組菌按1∶50的體積比對(duì)接1000 mL含50 mg/L 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD590=0.8時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，4 h后收集菌體。隨后的蛋白純化按照Qiagen公司Ni-NTA argrose使用說(shuō)明進(jìn)行操作。離心收集菌體沉淀，每1 g沉淀濕重加5 mL Buffer B(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 8.0) 重懸菌體，置于室溫下振搖，超聲破碎10 min, 12000 rmp離心15 min，收集上清。按1∶4比例，將50%Ni-NTA瓊脂糖珠和菌體裂解液上清裝入純化柱，室溫下置水平搖床振搖60 min混勻，過(guò)柱。用2倍柱床體積Buffer C(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 6.3)洗脫3次，用2倍柱床體積Buffer D(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 5.9)洗脫1次，再用用2倍柱床體積Buffer E(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 4.5)洗脫His-CDV-N588融合蛋白，洗脫5次。分別收集少量菌體裂解液上清、沉淀、過(guò)柱液、Buffer C和Buffer E洗脫品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 His-CDV-N588融合蛋白Western blotting檢測(cè)

分別收集少量非純化菌體蛋白和純化了的His-CDV-N588融合蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用TBST緩沖液漂洗10 min, 然后用TBST配制的3%BSA, 4℃封閉過(guò)夜。棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的His單克隆抗體(1∶500)室溫孵育2 h, 然后4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min, 加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1500), 室溫孵育2 h, TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學(xué)發(fā)光劑A、B作用5 min, 在暗盒內(nèi)壓X光片(轉(zhuǎn)印膜蛋白面朝上)，曝光、顯影和定影。用預(yù)染蛋白marker判定目的蛋白的相對(duì)分子量。

2 結(jié)果

2.1 CDV-N截短體基因PCR擴(kuò)增

CDV-N588PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得大小約為0.6 kb左右的片段，與預(yù)期長(zhǎng)度一致(圖1)。

2.2 pMD18T-CDV-N588重組質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序

重組質(zhì)粒pMD18-T-CDV-N588經(jīng)Bam HI和HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠圖上出現(xiàn)了約2.7 kb和0.6 kb的預(yù)期條帶(圖2)，表明該重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。與GenBank上己公布的同名基因(登錄號(hào)：HM596308.1)相比較，核苷酸序列(圖3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(圖4)相似性為均為99%。

M: DNA marker DL 2000；

M1：DNA MarkerDL 2000；

圖3 CDV-N截短體基因測(cè)序結(jié)果

圖4 推導(dǎo)的CDV-N截短體基因氨基酸序列

2.3 CDV-N截短體基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

Bam HI 和Hind Ⅲ 雙酶切原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-CDV-N588，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠圖片上顯示了約5.9 kb和0.6 kb預(yù)期條帶(圖5)，結(jié)果表明原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 重組質(zhì)粒pET30a-CDV-N588在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET30a-CDV-N588轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)1 mmo/L 的 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和未誘導(dǎo)重組菌液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)的重組菌液在相對(duì)分子量約30 KDa處有蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的重組菌液未出現(xiàn)此條帶(圖6)。

M：預(yù)染蛋白marker；1、3、5、7：未誘導(dǎo)的重組BL21；

2.5 His-CDV-N588融合蛋白純化

應(yīng)用Ni-NTA瓊脂糖珠在變性條件下純化的His-CDV-N588融合蛋白呈現(xiàn)單一條帶(圖7)，純度高。純化前后的蛋白樣品經(jīng)Western blotting檢測(cè)，均呈現(xiàn)預(yù)期大小的蛋白條帶(圖8)，證明筆者確實(shí)獲得了His-CDV-N588融合蛋白。

M：預(yù)染蛋白marker；1:未誘導(dǎo)的重組BL21;

M：預(yù)染蛋白marker；1:未誘導(dǎo)的重組BL21;

3 討論

近些年CDV-N基因的克隆、原核或真核表達(dá)研究主要選用N蛋白基因全長(zhǎng)片段。本實(shí)驗(yàn)截取CDV-N基因B細(xì)胞抗原表位較集中的一段用于原核表達(dá)，獲得了高純度的His-CDV-N截短體融合蛋白，該片段可能比全長(zhǎng)CDV-N基因具有更好的免疫原性。

近些年，筆者所在實(shí)驗(yàn)室在原核表達(dá)、蛋白純化和多克隆抗體制備方面做了大量工作，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間探索，發(fā)現(xiàn)真核基因在原核細(xì)胞中多以包涵體形式表達(dá)，用8 mol/L(pH 8.0)溶解包涵體，變性條件下純化His標(biāo)簽融合蛋白行之有效，純化后的蛋白無(wú)需復(fù)性，就可以直接免疫兔或鼠制備多克隆或單克隆抗體。這些前期研究建立的技術(shù)平臺(tái)為CDV-N截短體基因原核表達(dá)和蛋白純化提供了有力的技術(shù)支持。

表達(dá)載體上的6×His標(biāo)簽序列與Ni離子具有很強(qiáng)的親和力， His標(biāo)簽蛋白結(jié)合能牢固結(jié)合在Ni-NTA 瓊脂糖珠介質(zhì)上。純化過(guò)程中，雜蛋白富含組氨酸區(qū)域會(huì)非特異性地與Ni-NTA瓊脂糖珠介質(zhì)結(jié)合從而影響純化效率。但蛋白是兩性分子，帶電性質(zhì)可隨pH的變化而變化，當(dāng)雜蛋白洗脫液pH值與目的蛋白等電點(diǎn)pH值相近時(shí)，雜蛋白被洗脫;降低pH，可以減弱His標(biāo)簽蛋白與Ni離子的結(jié)合力，從而能洗脫并得到較高純度的目的蛋白。本研究中CDV-N588蛋白的等電點(diǎn)pH值為5.4，筆者將雜蛋白洗脫液pH值調(diào)至6.3(Buffer C)和5.9(Buffer D)，目的蛋白洗脫液(Buffer E)pH調(diào)至4.5，有效地解決了雜蛋白污染問(wèn)題。在純化過(guò)程中，細(xì)胞破碎條件和裂解液過(guò)柱速率也影響純化效果。超聲波破碎功率太高和工作時(shí)間太久會(huì)產(chǎn)生氣泡影響破碎效果，功率太低和間隔時(shí)間太短則會(huì)破碎不完全。工作5 s，間隔10 s，360 W作用30 min，是超聲波破碎最佳條件；細(xì)胞裂解液過(guò)柱速率不能太快，否則會(huì)導(dǎo)致目的蛋白CDV-N588與純化介質(zhì)結(jié)合率下降，最佳過(guò)柱速率為30滴/min。通過(guò)對(duì)純化過(guò)程的優(yōu)化，我們順利得到了His-CDV-N588融合蛋白。

4 結(jié)論

采用PCR技術(shù)，成功擴(kuò)增了CDV-N截短體基因片段， 成功構(gòu)建了CDV-N截短體基因原核表達(dá)載體， pET30a-CDV-N588在大腸桿菌中得以高效表達(dá)，純化后的His-CDV-N588蛋白純度較高，可用于單克隆或多克隆或抗體的制備。

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