特異性控制神經(jīng)元活性法研究睡眠-覺醒機(jī)制新進(jìn)展

楊燕飛 黃志力

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，腦科學(xué)研究院與腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海，200032，中國

睡眠是高度保守的行為，從低等的動(dòng)物到高等的人類都需要睡眠，但睡眠-覺醒的調(diào)控機(jī)制仍是不解之謎。根據(jù)腦電圖（electroencephalogram，EEG）的波幅和頻率，以及肌電圖（electromyogram，EMG）的活動(dòng)度，睡眠被分為快速眼動(dòng)（rapid eye movement，REM）睡眠和非快速眼動(dòng)（non-REM，NREM）睡眠二個(gè)時(shí)相。

目前已知調(diào)控睡眠的系統(tǒng)主要包括：下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateral preoptic area，VLPO）神經(jīng)叢、基底前腦（basal forebrain，BF）、視前區(qū)（preoptic area，POA）、腦 干（brainstem，BS）、丘 腦 網(wǎng) 狀 核（thalamic reticular nucleus，TRN）和基底神經(jīng)節(jié)（basal ganglia，BG）的γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)元等。主要覺醒調(diào)控系統(tǒng)有：腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（reticular formation of brain stem，BSRF）、中縫核（raphe nucleus，RN）5-羥 色 胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經(jīng)元、藍(lán)斑（locus coeruleus，LC）去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）能神經(jīng)元、下丘腦外側(cè)（lateral hypothalamus，LH）食欲素（orexin）能神經(jīng)元、結(jié)節(jié)乳頭核（tuberomammillary nucleus，TMN）組胺（histamine）能神經(jīng)元、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray，PAG）多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元、腦橋 -中腦（pons-midbrain）乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）能神經(jīng)元和BF膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元等。

睡眠和覺醒是通過腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)源性睡眠促進(jìn)物質(zhì)共同作用、相互影響而實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)也受到晝夜節(jié)律和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)控［1-3］。睡眠-覺醒行為受大腦中諸多神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，具有復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路，理解其調(diào)節(jié)機(jī)制具有極大的科學(xué)價(jià)值和臨床意義［4］。特異性控制神經(jīng)元活性技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為揭示睡眠-覺醒的機(jī)制提供了更有力的工具。

1 特異性控制神經(jīng)元活性法

1.1 光遺傳學(xué)

2005年斯坦福大學(xué)Karl Deisseroth實(shí)驗(yàn)室首次將光敏感視紫紅質(zhì)通道蛋白 2（channelrhodopsin-2，ChR2）應(yīng)用在神經(jīng)元中，開啟了神經(jīng)生物學(xué)的新紀(jì)元［5］。目前主要發(fā)現(xiàn)三類光控蛋白，包括快速興奮性、快速抑制性和光控信號(hào)通路蛋白三大類。ChR2是最常用的興奮性光控蛋白，可被473 nm波長的藍(lán)光激活，使胞外陽離子內(nèi)流，產(chǎn)生內(nèi)向電流，引起神經(jīng)元去極化［6-7］。嗜鹽菌紫質(zhì)（halorhodopsin，NpHR）可以被570 nm波長黃光激活，引發(fā)氯離子內(nèi)流，使細(xì)胞超極化。此外還有其他類型的抑制性的光控蛋白［6-7］。如，古嗜鹽菌紫質(zhì)（arechaerhodopsin，ArcH）是外向的質(zhì)子泵，ArcH可以被566 nm藍(lán)綠光激活，將胞內(nèi)的質(zhì)子泵出，從而產(chǎn)生外向的電流抑制神經(jīng)元的電活動(dòng)［8］。近年來又發(fā)現(xiàn)響應(yīng)632 nm紅光的氯離子通道，通過篩選得到蛋白Jaws［9］。

1.2 藥理遺傳學(xué)

北卡羅來納大學(xué)Bryan Roth等通過突變膽堿毒蕈堿型受體，創(chuàng)造了特異性被人工配體激活的人工受體（designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs）［10-11］。DREADDs 沒 有 基 礎(chǔ) 活 性，不能被內(nèi)源性配體膽堿所活化，但能通過外源給予氧化氯氮平（clozapine oxide，CNO）激活。DREADDs包括興奮型和抑制型二種，興奮型系人源化的hM3Dq和鼠源化的rM3Ds，抑制型為人源的hM4Di。M3受體是Gq型G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs），通過磷脂酰肌醇途徑增加胞內(nèi)鈣濃度，從而興奮神經(jīng)元［12-13］。M4受體是 Gi型 GPCR，通過抑制腺苷酸環(huán)化酶或耦聯(lián)內(nèi)向整流鉀離子通道（inwardly rectifying potassium 3，Kir3）使細(xì)胞超極化從而抑制神經(jīng)元［11］。最近Bryan Roth課題組又通過突變阿片肽受體κ受體獲得的 DREADDs（κ-opioid receptor DREADDs，KORD），KORD和hM4Di一樣也是介導(dǎo)內(nèi)向整流鉀離子通道，使細(xì)胞超極化，從而抑制神經(jīng)元活性［14-15］。

運(yùn)用光遺傳學(xué)和藥理遺傳學(xué)方法，在特異性神經(jīng)元上選擇性表達(dá)人工受體，達(dá)到高空間分辨率人工控制神經(jīng)元活性的目的。光遺傳學(xué)在時(shí)間分辨率上更勝一籌，而藥理遺傳學(xué)作用時(shí)間更持久，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，兩者聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。

2 調(diào)控睡眠的核團(tuán)

已知睡眠相關(guān)腦區(qū)，包括VLPO［16-17］和面神經(jīng)旁核（parafacial zone，PZ）［18-19］等，但變性這些核團(tuán)，對(duì)睡眠量的長期影響都很小，提示可能還有更重要的核團(tuán)存在。控制睡眠和覺醒的核團(tuán)是相互聯(lián)系，具體哪個(gè)腦區(qū)及哪類神經(jīng)元在睡眠調(diào)控中發(fā)揮重要作用，尚不清楚。本課題組長期關(guān)注腺苷對(duì)睡眠的調(diào)控及其作用機(jī)制，揭示了腺苷通過作用于TMN組胺能覺醒系統(tǒng)中A1受體 （adenosine A1receptor，A1R）而發(fā)揮促眠作用［20-21］；發(fā)現(xiàn)咖啡因是通過阻斷腺苷 A2A受體（adenosine A2Areceptor，A2AR）發(fā)揮強(qiáng)效促覺醒作用［22-23］，但腦內(nèi)A2AR陽性神經(jīng)元是否啟動(dòng)或維持睡眠，仍有待闡明。

2.1 背側(cè)紋狀體

背側(cè)紋狀體（dorsal striatum，DS）是BG主要的輸入核團(tuán)［24］，其神經(jīng)元密集表達(dá) A2AR［25］。Yuan 等利用藥理遺傳、光遺傳、免疫電鏡和電生理等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)小鼠DS頭端和中部區(qū)域的A2AR陽性神經(jīng)元，通過控制外側(cè)蒼白球（external globus pallidus，GPe）中的小清蛋白陽性（parvalbumin positive，PV+）神經(jīng)元，調(diào)節(jié)動(dòng)物活動(dòng)期睡眠（Fig.1）［26］。這一調(diào)節(jié)作用，可能為治療帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者的白天嗜睡提供新的思路［26］。

Fig.1 A2AR neurons in the rostral and central striatum control sleep

2.2 伏隔核

伏隔核（nucleus accumbens core，NAc）一直被認(rèn)為在獎(jiǎng)賞、成癮和恐懼等活動(dòng)中起重要作用［27］。有研究表明NAc能夠調(diào)節(jié)慢波睡眠（slow wave sleep，SWS）［28］，另外阻斷 NAc中的 A2AR 是咖啡因的促覺醒作用的重要機(jī)制［29］，但NAc中A2AR陽性神經(jīng)元在調(diào)節(jié)睡眠中發(fā)揮的作用不明確。。

Oishi等利用轉(zhuǎn)基因小鼠和光遺傳學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)光刺激NAc中A2AR陽性神經(jīng)元誘發(fā)快速而強(qiáng)烈的SWS，并增加小鼠睡眠量。當(dāng)小鼠出現(xiàn)行為動(dòng)機(jī)時(shí)，伏隔核內(nèi)A2AR神經(jīng)元活性明顯被抑制，小鼠覺醒量增加；相反動(dòng)機(jī)行為缺乏時(shí)，伏隔核內(nèi)A2AR神經(jīng)元活性增加，小鼠出現(xiàn)睡眠。以上研究結(jié)果表明，NAc內(nèi)A2AR陽性神經(jīng)元直接調(diào)節(jié)動(dòng)機(jī)行為缺乏性睡眠（Fig.2）［28］。

此外，F(xiàn)ang 等發(fā)現(xiàn)，小鼠敲除 A2AR，酒精（3 g·kg-1）所引起的促眠作用消失，提示酒精可能通過增加腦內(nèi)腺苷水平，發(fā)揮促眠作用［30］。

2.3 嗅球

嗅覺功能障礙（嗅覺閾值增加和氣味鑒別受損）和REM睡眠障礙癥狀常出現(xiàn)在PD患者運(yùn)動(dòng)癥狀發(fā)生之前［31-32］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)切除大鼠嗅球（olfactory bulb，OB）后，動(dòng)物表現(xiàn)出REM睡眠增加［33］，此研究提示嗅覺功能的異常和REM睡眠障礙密切相關(guān)。此外，OB中有大量A2AR分布［34］，但OB中A2AR對(duì)睡眠調(diào)節(jié)的機(jī)制目前尚不清楚。

Wang等運(yùn)用DREADDs法特異性操縱OB的A2AR陽性神經(jīng)元活性，發(fā)現(xiàn)OB中的A2AR參與REM睡眠的調(diào)控。當(dāng)激活OB中A2AR陽性神經(jīng)元，小鼠REM睡眠降低；抑制該類型神經(jīng)元，小鼠REM睡眠增加。結(jié)合神經(jīng)元特異性示蹤技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)OB中A2AR陽性神經(jīng)元調(diào)控REM睡眠可能與支配下游的梨狀皮層和嗅結(jié)節(jié)有關(guān)［35］。

2.4 面旁核

PZ是近年新發(fā)現(xiàn)的與促眠相關(guān)的核團(tuán)［36］，該區(qū)域的神經(jīng)元在睡眠期興奮性上升，當(dāng)化學(xué)毀損該區(qū)域的神經(jīng)元?jiǎng)t導(dǎo)致動(dòng)物覺醒量顯著增加，表明PZ可能參與睡眠行為的調(diào)控［37］，但對(duì)PZ-GABA能神經(jīng)元能否啟動(dòng)和維持SWS尚不清楚。Fuller等利用DREADDs法選擇性激活PZ-GABA能神經(jīng)元，研究發(fā)現(xiàn)小鼠NREM睡眠量出現(xiàn)連續(xù)3 h的顯著增加；光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PZ-GABA能神經(jīng)元可能是通過抑制其下游覺醒核團(tuán) -臂旁核（parabrachial nucleus，PB），達(dá)到啟動(dòng)睡眠的作用?？傊琍Z的GABA能神經(jīng)元能夠有效地啟動(dòng)SWS，調(diào)節(jié)大腦皮層的腦電活動(dòng)［18］。

2.5 下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)

VLPO一直被認(rèn)為是腦內(nèi)重要的睡眠中樞，該區(qū)域通過向腦內(nèi)多個(gè)覺醒腦區(qū)進(jìn)行抑制性投射，從而啟動(dòng)睡眠［38］。

Dan等利用神經(jīng)元逆行示蹤技術(shù)鎖定VLPO區(qū)域內(nèi)投射到下丘腦重要覺醒中樞TMN的神經(jīng)元。研究結(jié)果揭示了光激活VLPO投射到TMN的GABA（GABAVLPO-TMN）能神經(jīng)元，可誘發(fā)小鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)；激活整個(gè)VLPO區(qū)域其它的GABA能神經(jīng)元?jiǎng)t誘發(fā)小鼠出現(xiàn)覺醒。這一結(jié)果證實(shí)了VLPO在啟動(dòng)睡眠行為中扮演的重要作用，也提示了同一核團(tuán)內(nèi)相同類型的神經(jīng)元對(duì)睡眠-覺醒行為的調(diào)控可能有著完全不同的作用［39］。

2.6 外側(cè)下丘腦

黑色素濃縮激素（melanin-concentrating hormone，MCH）是LH區(qū)域內(nèi)稀疏分布的神經(jīng)肽［40］。MCH神經(jīng)元在睡眠期間活躍，因此藥理學(xué)研究認(rèn)為，此類神經(jīng)元可能參與調(diào)控睡眠［41］。

Sonia Jego等在小鼠REM睡眠期，光激活MCH神經(jīng)元，REM睡眠持續(xù)時(shí)間增加；抑制MCH神經(jīng)元，海馬θ節(jié)律的頻率和幅度降低，但不影響REM睡眠持續(xù)時(shí)間。此外，MCH神經(jīng)元與覺醒核團(tuán)TMN存在著功能性連接，激活MCH神經(jīng)元投射到TMN區(qū)域的神經(jīng)末梢，可誘發(fā)TMN區(qū)域組胺能神經(jīng)元出現(xiàn)抑制性突觸后電流，小鼠REM睡眠顯著延長。此研究結(jié)果表明MCH神經(jīng)元參與REM睡眠調(diào)控可能是通過抑制腦內(nèi)覺醒核團(tuán)TMN實(shí)現(xiàn)的［42］。而Tsunematsu等在NREM睡眠期激活MCH神經(jīng)元，誘發(fā)小鼠REM睡眠，在覺醒期間激活無效；抑制MCH神經(jīng)元?jiǎng)t覺醒增加，NREM睡眠降低，不影響REM睡眠。此研究揭示了只激活MCH神經(jīng)元足以觸發(fā)小鼠從NREM到REM睡眠的轉(zhuǎn)變，并在NREM睡眠的起始和維持中起重要作用［43］。綜上所述，LH中MCH神經(jīng)元參與調(diào)控NREM和REM睡眠，但還有待更近一步的研究。

2.7 丘腦網(wǎng)狀核

TRN位于丘腦白質(zhì)附近，是大腦皮層和丘腦信息交流的門戶，TRN中大量的GABA能神經(jīng)元在睡眠調(diào)節(jié)中起著重要作用［44］。BF和腦干中廣泛投射的膽堿能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)REM睡眠、睡眠-覺醒周期和促進(jìn)覺醒中發(fā)揮重要作用，投射到TRN的膽堿能神經(jīng)元在睡眠中的作用機(jī)制尚不明確。

Fig.2 Optogenetic stimulation of A2AR neurons in the NAc evoked a rapid and robust SWS response

Fig.2 （continued）

Ni等借助膽堿能神經(jīng)元選擇性表達(dá)ChR2的轉(zhuǎn)基因小鼠和光遺傳學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)光刺激投射到TRN的膽堿能神經(jīng)元，激活局部GABA能神經(jīng)元，會(huì)促進(jìn)小鼠睡眠并維持NREM睡眠，但REM睡眠不受影響。直接激活TRN中投射的膽堿能，會(huì)縮短入睡潛伏期和產(chǎn)生NREM睡眠［45］。此外，Lewis等研究表明TRN可快速調(diào)整局部皮層的狀態(tài)。光激活TRN，會(huì)迅速引起皮層產(chǎn)生類似于睡眠中的慢波活動(dòng)，小鼠的覺醒明顯減少［46］。

2.8 未定帶

未定帶（zona incerta，ZI）是與 LH 相連的腦區(qū)，參與調(diào)節(jié)感覺-運(yùn)動(dòng)的整合［47］。刺激丘腦向ZI投射的神經(jīng)纖維可誘發(fā)睡眠樣狀態(tài)［48-49］，但ZI中不同類型的神經(jīng)元在睡眠調(diào)控中的作用未知。Liu等研究發(fā)現(xiàn)腹側(cè)未定帶（ventral ZI，VZI）中的一類GABA能神經(jīng)元可促睡眠。這類神經(jīng)元表達(dá)LIM同源因子Lhx6，能直接抑制可激活覺醒的下丘腦分泌素細(xì)胞和GABA能細(xì)胞的活性。小鼠的睡眠期間，選擇性的激活或抑制VZI中Lhx6陽性神經(jīng)元，可直接增加或減少睡眠時(shí)間。此研究表明，VZI中GABA能神經(jīng)元能夠促進(jìn)睡眠［50］。

3 調(diào)控覺醒的核團(tuán)

由Moruzzi和Magoun提出的“網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)”是經(jīng)典的覺醒控制模型，電刺激中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)引起貓覺醒［51］。上行興奮性沖動(dòng)在丘腦中央髓板內(nèi)核換神經(jīng)元，通過非特異性投射激活整個(gè)大腦皮層。盡管中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)-丘腦-皮層通路是激活大腦皮層的重要結(jié)構(gòu)，但并非唯一激活系統(tǒng)。目前已知調(diào)控覺醒的核團(tuán)還包括 RN［52］、LC［53］、TMN［54］、LH［55］和 BF［56］等，但這些核團(tuán)調(diào)控覺醒的機(jī)制尚不明確。

3.1 基底前腦

BF-膽堿能神經(jīng)元一直被公認(rèn)在皮層激活和覺醒行為中起關(guān)鍵作用［57-58］。在BF中，膽堿能神經(jīng)元僅占總細(xì)胞數(shù)的5%，GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元分別占35%和55%［59］。但由于傳統(tǒng)方法對(duì)特定類型神經(jīng)元選擇性操控較差，BF中這三類神經(jīng)元在睡眠-覺醒調(diào)節(jié)中發(fā)揮的確切作用存在爭(zhēng)議。

3.1.1 基底前腦膽堿能神經(jīng)元

Fig.3 Activation or inhibition of basal forebrain （BF） cholinergic neurons slightly promoted/decreased wakefulness，produced low-delta non-rapid eye movement （NREM） sleep，and decreased/ increased electroencephalogram （EEG） power spectrum of NREM sleep

本課題組通過藥理遺傳學(xué)技術(shù)操控BF-膽堿能神經(jīng)元活性，發(fā)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)元通過激活大腦皮層來抑制腦電δ波活動(dòng)，而不僅是誘導(dǎo)覺醒行為（Fig.3）。DREADDs選擇性激活膽堿能神經(jīng)元，能夠顯著并持續(xù)降低EEG的δ波強(qiáng)度，并產(chǎn)生低δ波的NREM睡眠，增加覺醒的作用短暫；抑制膽堿能神經(jīng)元，能夠顯著增加EEG的δ波，輕微減少覺醒。人源化海腎熒光素酶綠色熒光蛋白（humanized renilla green fluorescent protein，hrGFP）示蹤BF中膽堿能神經(jīng)元的投射，發(fā)現(xiàn)在次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層和扣帶皮層hrGFP陽性神經(jīng)纖維密集分布，而在已知與睡眠相關(guān)的VLPO區(qū)域稀疏。激活BF-膽堿能神經(jīng)元，c-Fos的表達(dá)在次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層和扣帶皮層明顯增加，VLPO中c-Fos表達(dá)降低［60］。此外，Han等利用光遺傳學(xué)技術(shù)特異性激活BF-膽堿能神經(jīng)元，會(huì)誘導(dǎo)小鼠從SWS狀態(tài)向清醒或REM睡眠的轉(zhuǎn)化，但不影響SWS的最終轉(zhuǎn)化方向與概率。在清醒或REM睡眠期間激活膽堿能神經(jīng)元，會(huì)維持皮層的活躍；連續(xù)刺激1 h后，會(huì)導(dǎo)致不活躍期覺醒時(shí)間增加，引起類失眠樣表現(xiàn)［61］。相比之前激活去甲腎上腺素或丘腦分泌素神經(jīng)元誘導(dǎo)小鼠從SWS和REM睡眠轉(zhuǎn)換至覺醒的研究，認(rèn)為在SWS期間光激活膽堿能神經(jīng)元才最有可能誘導(dǎo)覺醒，在REM睡眠時(shí)激活則不能將小鼠喚醒。

3.1.2 基底前腦GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元

覺醒行為被認(rèn)為依賴于BF中膽堿能神經(jīng)元，但病變的膽堿能神經(jīng)元僅引起有限的覺醒和睡眠-覺醒周期變化［56］。提示BF中GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元也可能參與了睡眠-覺醒調(diào)控。

Fuller等借助藥理遺傳學(xué)手段研究三種類型神經(jīng)元在睡眠-覺醒中的調(diào)控作用。在小鼠清醒狀態(tài)下，激活BF-谷氨酸能和膽堿能神經(jīng)元，均明顯鞏固覺醒狀態(tài)，但不影響覺醒量，說明這兩類神經(jīng)元可能在促覺醒方面發(fā)揮的作用較小；激活BF-GABA能神經(jīng)元，產(chǎn)生持續(xù)的覺醒和高頻的皮層節(jié)律，而抑制該類神經(jīng)元?jiǎng)t增加睡眠［62］。Xu等使用光遺傳學(xué)特異性控制BF神經(jīng)元，進(jìn)一步揭示了BF中不同神經(jīng)元在睡眠-覺醒調(diào)節(jié)中的相互協(xié)作作用，并提供了首個(gè)BF中控制睡眠-覺醒的神經(jīng)環(huán)路圖。研究表明激活BF中膽堿能、谷氨酸和PV+-GABA能神經(jīng)元快速誘導(dǎo)覺醒；激活生長抑素陽性（somatostatin positive，SOM+） GABA 能神經(jīng)元促進(jìn)NREM睡眠。促覺醒神經(jīng)元由興奮性谷氨酸能到膽堿能到PV+神經(jīng)元連接構(gòu)成，它們都會(huì)受到SOM+神經(jīng)元的抑制作用［63］。

3.2 腹側(cè)被蓋區(qū)

腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）被認(rèn)為與自主運(yùn)動(dòng)和目標(biāo)導(dǎo)向行為相關(guān)［64］。動(dòng)機(jī)行為高度依賴于覺醒，說明VTA神經(jīng)元可能在睡眠-覺醒行為調(diào)節(jié)中起作用。

Sun等使用DREADDs法證實(shí)了VTA神經(jīng)元在促覺醒中發(fā)揮重要作用。無論是在活動(dòng)期（21：00）還是非活動(dòng)期（9：00）激活VTA神經(jīng)元，小鼠總覺醒率均大幅度增加，NREM和REM睡眠量均明顯下降。抑制VTA神經(jīng)元，不改變NREM睡眠，REM睡眠和覺醒的時(shí)間［65］。Eban等進(jìn)一步揭示了VTA中多巴胺能神經(jīng)元（VTA dopaminergic neuron，DA-VTA）是覺醒所必需的。使用藥理遺傳學(xué)和光遺傳學(xué)技術(shù)特異性操縱DA-VTA神經(jīng)元，當(dāng)DA-VTA神經(jīng)元受抑制時(shí)，即使是面對(duì)顯著的行為刺激，覺醒也會(huì)受到抑制；在小鼠睡眠前，抑制DA-VTA神經(jīng)元，會(huì)促進(jìn)睡眠相關(guān)的筑巢行為。相反，光激活DA-VTA神經(jīng)元會(huì)啟動(dòng)和維持覺醒，抑制睡眠和睡眠相關(guān)的筑巢行為。此外，DA-VTA神經(jīng)元不同的投射，對(duì)覺醒調(diào)節(jié)有差異［66］。以上研究表明VTA神經(jīng)元在睡眠-覺醒行為中起調(diào)節(jié)作用。

3.3 腦橋被蓋

腦橋被蓋核（pedunculopontine tegmental，PPT） /背外側(cè)被蓋核（laterodorsal tegmental，LDT）神經(jīng)元支配的促覺醒區(qū)域，包括VTA、LH、BF、額葉皮層和丘腦核［67］。PPT核調(diào)節(jié)覺醒和REM睡眠一直被認(rèn)為主要與PPT核膽堿能神經(jīng)元有關(guān)。光激活PPT和LDT的膽堿能神經(jīng)元，增加小鼠REM睡眠的概率［68］；睡眠中電刺激PPT核會(huì)導(dǎo)致快速覺醒；損毀貓的PPT核會(huì)減少REM睡眠［69］。但PPT核內(nèi)還有谷氨酸能和GABA能神經(jīng)元，發(fā)揮的作用尚不明確。

Scammell等利用藥理遺傳學(xué)來確定PPT核內(nèi)這三種類型神經(jīng)元在調(diào)節(jié)大腦皮層活動(dòng)和睡眠-覺醒行為中扮演的角色，并繪制出每個(gè)神經(jīng)元的投射。該研究揭示了PPT-谷氨酸能神經(jīng)元強(qiáng)烈地促進(jìn)覺醒，PPT-膽堿能神經(jīng)元抑制皮層節(jié)律，PPT-GABA能神經(jīng)元略微減少REM睡眠。認(rèn)為PPT-谷氨酸和膽堿能神經(jīng)元協(xié)同作用產(chǎn)生覺醒。此外，PPT神經(jīng)元具有不同的投射，對(duì)皮層活動(dòng)和睡眠-覺醒也有不同的影響［70］。研究PPT-谷氨酸能神經(jīng)元促覺醒本質(zhì)以及PPT核內(nèi)各種類型神經(jīng)元的輸入和投射，也是重要的課題。

3.4 外側(cè)下丘腦

促睡眠核團(tuán)VLPO［71］的突觸傳入主要來自于與覺醒相關(guān)的 LH［55］，LH 的病變通常會(huì)引起嗜睡［72］。然而，在LH內(nèi)，這些投射到VLPO神經(jīng)元的種類及在覺醒網(wǎng)絡(luò)中的功能仍存在很多疑問。

Venner等認(rèn)為LH中向VLPO投射的神經(jīng)元可能含有GABA，而這些神經(jīng)元在睡眠-覺醒中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。利用藥理遺傳學(xué)方法操控Vgat-ires-Cre小鼠LH的GABA能神經(jīng)元，證實(shí)了LH中向VLPO投射神經(jīng)元含有GABA，此類神經(jīng)元在睡眠-覺醒中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。LH中向VLPO投射的神經(jīng)元表達(dá)囊泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn) 體（vesicle GABA transporter，VGAT），這 是 GABA釋放神經(jīng)元的標(biāo)記物。當(dāng)激活LH-VGAT神經(jīng)元可促進(jìn)覺醒，抑制LH-VGAT陽性神經(jīng)元?jiǎng)t會(huì)誘發(fā)睡眠，說明LH-VGAT陽性神經(jīng)元是促睡眠核團(tuán)VLPO的主要抑制來源。此外，LH投射到VLPO的這些LH-VGAT陽性神經(jīng)元，也投射到TMN，腹側(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和 LC［73］。

3.5 終紋床核

終紋床核（bed nucleus of the stria terminalis，BNST）在應(yīng)激反應(yīng)、恐懼和焦慮中起重要作用，提高警覺水平和覺醒應(yīng)答，以應(yīng)對(duì)與壓力和危險(xiǎn)相關(guān)的環(huán)境因素［74］，但BNST是否參與睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

Kodani等人發(fā)現(xiàn)BNST中表達(dá)谷氨酸脫羧酶67（glutamate decarboxylase 67，Gad67）的GABA能神經(jīng)元在小鼠睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用。在NREM睡眠期間，光刺激Gad67-Cre小鼠BNSTGABA能神經(jīng)元，小鼠立即轉(zhuǎn)向清醒，orexin系統(tǒng)不參與調(diào)節(jié)；在REM睡眠期間，光刺激BNST-GABA能神經(jīng)元，對(duì)小鼠睡眠-覺醒狀態(tài)無影響。使用藥理遺傳學(xué)技術(shù)長時(shí)間刺激BNST-GABA能神經(jīng)元，會(huì)引起持續(xù)的覺醒狀態(tài)，而這種持續(xù)覺醒狀態(tài)可通過提前給予食欲素受體拮抗劑消除。順行追蹤實(shí)驗(yàn)揭示了，BNSTGABA能神經(jīng)元投射到與覺醒密切關(guān)聯(lián)的腦區(qū)，包括POA、LH、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和PB。綜上所述，BNST-GABA能神經(jīng)元在NREM睡眠至覺醒的過渡中發(fā)揮重要的作用且orexin神經(jīng)元不相關(guān)，當(dāng)BNST中GABA能神經(jīng)元長期受激發(fā)時(shí)，則會(huì)調(diào)動(dòng)orexin系統(tǒng)保持清醒［75］。

4 結(jié)語與展望

特異性控制神經(jīng)元活性技術(shù)以及各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)藥理學(xué)研究的局限，為睡眠-覺醒的研究提供了極大的便利。

最新研究發(fā)現(xiàn)：PZ-GABA能神經(jīng)元能夠有效地啟動(dòng)SWS；激活VLPO至TMN的GABA能神經(jīng)元可誘發(fā)小鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)，整體激活VLPO-GABA能神經(jīng)元?jiǎng)t誘發(fā)小鼠覺醒；LH中MCH神經(jīng)元的激活可維持REM睡眠，并在NREM睡眠的起始和維持中也起重要作用；選擇性激活TRN-膽堿能神經(jīng)元末梢后局部激活GABA能神經(jīng)元，可明顯縮短小鼠入睡潛伏期并增加NREM睡眠量，而REM睡眠不受影響；激活OB-A2AR神經(jīng)元REM睡眠降低，抑制則REM睡眠增加；光刺激NAc中A2AR神經(jīng)元，會(huì)誘發(fā)快速而強(qiáng)烈的SWS反應(yīng)。

對(duì)于覺醒調(diào)節(jié)系統(tǒng)，BF中除了膽堿能神經(jīng)元，激活BF-GABA能神經(jīng)元促覺醒；激活VTA神經(jīng)元增加覺醒，其中DA-VTA在維持清醒中起關(guān)鍵性作用；PPT-谷氨酸能神經(jīng)元強(qiáng)烈地促進(jìn)覺醒，PPT-膽堿能神經(jīng)元抑制皮層慢節(jié)律，PPT-GABA能神經(jīng)元略微減少REM睡眠；激活LH-VGAT陽性神經(jīng)元可促覺醒，抑制則增加睡眠；GABA-BNST神經(jīng)元在NREM睡眠至覺醒過渡中發(fā)揮作用，當(dāng)GABA-BNST神經(jīng)元長期受激發(fā)時(shí)，則會(huì)調(diào)動(dòng)orexin系統(tǒng)保持清醒。

綜上所述，GABA能、谷氨酸能和及膽堿能神經(jīng)元已成為近年來的研究熱點(diǎn)。因此，未來的挑戰(zhàn)將是揭示這些新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)如何協(xié)同來調(diào)節(jié)睡眠和覺醒？內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生物節(jié)律因素如何協(xié)同調(diào)節(jié)，影響睡眠和覺醒神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)？相信隨著新技術(shù)的不斷應(yīng)用，將會(huì)更加深刻而全面地認(rèn)識(shí)到各個(gè)睡眠-覺醒核團(tuán)、不同類型神經(jīng)元及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在睡眠-覺醒中的作用。人工智能及生物物理技術(shù)如能實(shí)現(xiàn)對(duì)這些核團(tuán)的按需性調(diào)控，人為調(diào)控人體睡眠將成為可能。

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