人脂肪來源間充質(zhì)干細胞促進Matrigel培養(yǎng)內(nèi)皮細胞血管形成

張有良 林珣珣 后晨蓉 牛星堂 唐慶

[摘要]目的：通過體外細胞學研究（共培養(yǎng)體系建立）直觀表現(xiàn)脂肪干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）體外進血管形成能力，闡述脂肪干細胞作為輔助細胞通過促進早期血供建立而提高移植脂肪存活率的可能機制。方法：臨床通過Coleman法抽吸成人大腿或腹部淺層脂肪，并通過經(jīng)典方法培養(yǎng)獲取ADSCs。對ADSCs進行形態(tài)學、表面分子標記物及多向分化等生物學特性鑒定，并通過Matrigel培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）管腔樣結(jié)構(gòu)形成實驗探討ADSCs體外促血管形成能力，說明ADSCs促進血管新生及移植物早期血供建立的潛力。結(jié)果：ADSCs/HUVECs共培養(yǎng)體系可于體外促進內(nèi)皮細胞形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，提高早期血管新生。結(jié)論：通過共培養(yǎng)體系模擬提示ADSCs體外具備促血管形成的能力，具有促進早期血供建立而提高移植物存活的潛力，為臨床細胞輔助脂肪移植提高存活率的可能機制。

[關鍵詞]脂肪移植；存活率；脂肪干細胞；血管形成；細胞共培養(yǎng)

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）04-0105-04

A Vitro Study on Human Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells Promote the Vascularization of Endothelial Cell in Matrigel

ZHANG You-liang1，LIN Xun-xun1，HOU Chen-rong2，NIU Xing-tang1，TANG Qing1

（1.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，Guangdong，China；2.Laser Center， Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou 510091，Guangdong，China）

Abstract： Objective To evaluate the angiogenesis potential of the adipose derived stem cells （ADSCs） in vitro in order to expound the possible mechanism about the ADSCs improved the survival rate of graft through promoting vascular remodeling in early stage. Methods The fat tissue was obtained from healthy adults abdomen or thigh liposuction through the Coleman technique. The ADSCs was obtained and cultured by the traditional method. The ADSCs was Identified by biological function properties studies including morphological characteristics， molecular surface marker expression and differentiation. The angiogenesis potential was testified by the tube formation assay system in Matrigel with Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in order to expound the angiogenesis potential for improving the survival rate of graft. Results ADSCs promoted the tube formation in vitro in the co-culture system in order to promote the angiogenesis in early stage. Conclusion By co-culture system， the ADSCs had the ability to promote angiogenesis. It had the potential that promote establishing the blood supply at early stage in vitro to improve the survival rate of graft， and that is the plausible mechanisms for cell assisted lipotransfer to improve the survival rate.

Key words：fat grafting； retention； adipose derived stem cells； angiogenesis； cells co-culture

自體脂肪移植廣泛應用于整形修復外科[1-3]。然而脂肪移植物遠期存活率低仍限制其臨床應用效果。隨著脂肪源性間充質(zhì)干細胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）的發(fā)現(xiàn)[4]，其生物學特性具備提高移植物存活的潛力[5]。從此為基礎衍生的細胞輔助脂肪移植技術(shù)（Cell-assisted lipotransfer， CAL）通過ADSCs與脂肪聯(lián)合移植的模式，提高了移植脂肪的存活率[6-7]。脂肪分帶理論提示了早期血供建立是移植物存活的關鍵因素之一[8]，ADSCs是否能促進血管形成、建立血供而提高移植脂肪的存活率呢？本次通過ADSCs促進Matrigel體外臍靜脈內(nèi)皮細胞成血管實驗，研究ADSCs體外促血管形成能力，探索ADSCs作為輔助細胞促進血管形成，提高移植脂肪存活率的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料：本次選取健康男︰女（1：5），年齡17～34歲，從腹部或大腿部抽吸脂肪組織，研究已征本人同意，并自愿簽署相關知情同意書。

1.2 試劑與儀器：I型膠原酶（Sigma，德國）、胰酶（Sigma，德國）、DMSO（Sigma，德國）、Trizol（Sigma，德國），D-Hanks溶液（Gibco，美國）、PBS（Gibco，美國）、FBS（Gibco，美國）、雙抗（Gibco，美國）、DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國），內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液（ScienCell，美國）、內(nèi)皮細胞生長因子復合物（ScienCell，美國）、Matrigel（ScienCell，美國）。培養(yǎng)板/培養(yǎng)瓶/凍存管/離心管（Corning，美國）、培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、離心機（Thermo，美國）、超低溫冰箱（Thermo，美國）、超凈臺（Thermo，美國）、光學/熒光顯微鏡（Leica，德國）、流式細胞儀（Beckman，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)ADSCs：抽吸所得離體脂肪組織靜置20min，排盡下層液體，PBS洗滌1～2次，將脂肪組織按1：1.5倍體積加入0.1% I型膠原酶，置于37℃搖床震動消化50～60min。加入同體積DMEM終止消化。將消化后脂肪組織經(jīng)1 500轉(zhuǎn)/min離心10min。取管底沉淀細胞團，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液常規(guī)有氧培養(yǎng)。48h后換液，去除未貼壁細胞。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，進行形態(tài)學觀察、表面標記物鑒定和三系分化等生物學特性檢測。

1.3.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）培養(yǎng)與傳代：HUVECs原代細胞購于Sciencell公司，細胞鑒定可靠。HUVECs中加入內(nèi)皮細胞生長因子（Endothelial Cell Growth Supplement，ECGs）的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液（Endothelial Cell Medium，ECM）。

1.3.3 Matrigel培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞管腔形成實驗

1.3.3.1 實驗準備：①Matrigel保存于-20℃，經(jīng)4℃過夜溶解呈液態(tài)，所有相關器械經(jīng)-20℃降溫，4℃預冷，Matrigel包被96孔板需于冰上完成：96孔板內(nèi)每孔加入60μl 液態(tài)Matrigel包被，置于37℃孵化30min使Matrigel成膠；②取ADSCs（第3代）及HUVECs消化后1 100轉(zhuǎn)/min，5min離心沉淀，分別取實驗所需的培養(yǎng)液重懸，計數(shù)，調(diào)整細胞密度。

1.3.3.2 實驗分組：共分為2組。①共培養(yǎng)組：在Matrigel包被96孔板內(nèi)加入16 000個HUVECs，并加入4 000個ADSCs，使得HUVECs目標細胞群為4：1，加入200μl ECM（含1% FBS），于37℃溫育；②陰性對照組：Matrigel包被96孔板加入20 000個HUVECs，加入200μl DMEM（含10% FBS）。每組分別設置3處復孔。

1.4 評價指標：96孔板溫育16h后置于研究級倒置熒光顯微鏡下100倍數(shù)觀察，對每孔隨機選擇視野拍照，有細胞視野入選實驗結(jié)果。根據(jù)表1評分標準[9]評分。

表1 Matrigel培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞管腔形成實驗評分標準 （分）

鏡下表現(xiàn) 得分

無管腔芽生 0

細胞聚團，且有管腔芽生，無樹枝樣叢生 1

呈現(xiàn)樹枝樣叢生 2

相互連接的分支叢生 3

復雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 4

1.5 統(tǒng)計學分析：使用SPSS統(tǒng)計學軟件分析所獲數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs鑒定結(jié)果：鏡下可見細胞呈均一性不含脂滴長梭形細胞，經(jīng)傳代后形態(tài)均一，形態(tài)學觀察上符合ADSCs特征，見圖1。流式細胞儀檢測提示：該細胞群符合ADSCs表面分子標記物表達特征，即CD34、CD45造血干細胞相關表面標記物均表達陰性，CD73、CD90、CD105分子表面標記物表達陽性，見圖2。經(jīng)成骨、成軟骨、成脂三系誘導分化證實該細胞群具備三系分化能力，符合ADSCs細胞生物學特性，見圖3。

注：A.ADSCs P3；B.ADSCs P5

圖1 ADSCs形態(tài)學檢觀察結(jié)果，經(jīng)傳代培養(yǎng)，ADSCs呈均一的、不含脂滴的長梭形細胞群（標尺=100μm，200×）

2.2 Matrigel培養(yǎng)下內(nèi)皮細胞管腔形成實驗結(jié)果：①ADSCs/HUVECs共培養(yǎng)組大部分視野內(nèi)可見島狀細胞聚團，部分視野可見細胞團伸出偽足樣芽生結(jié)構(gòu)，相鄰細胞團通過芽生結(jié)構(gòu)可交匯接合，少數(shù)視野可見完整管腔樣結(jié)構(gòu)，見圖4；②DMEM陰性對照組可見HUVECs增殖緩慢，部分視野可見小范圍聚團，未見任何成管芽生，無管腔結(jié)構(gòu)形成，見圖5。

將顯微鏡100倍數(shù)下拍攝的照片通過篩選（Matrigel包被曲面導致的圖片聚焦不佳、細胞數(shù)過少或無細胞、液面或膠面氣泡干擾拍攝等因素的圖片剔除），最終每組均獲得85份合格圖片，根據(jù)評分標準，對圖片進行評分，ADSCs/HUVECs共培養(yǎng)組得分為15分顯著高于DMEM陰性對照組的0分，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），95%置信區(qū)間為（0.82，2.75），表明ADSCs具備促HUVECs體外成管腔的能力，且其成血管能力顯著優(yōu)于DMEM單獨培養(yǎng)，具備促血管新生早期建立血供提高移植物存活的潛力。

注：A.HUVECs增殖明顯且呈島狀聚團，細胞團間可見芽生結(jié)構(gòu)連接；B.圍繞ADSCs呈聚團效應的HUVECs大量增殖，細胞團向外伸出的芽生樣結(jié)構(gòu)，模擬血管壁形成；C.a.細胞團之間偽足樣芽生結(jié)構(gòu)連接；b.多個芽生結(jié)構(gòu)連接形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu)

圖4 ADSCs/HUVECs共培養(yǎng)組鏡下成管效果檢測圖（標尺=100μm，100×）

3 討論

研究表明間充質(zhì)干細胞具備促進移植物存活的潛力，故ADSCs同樣具備促進移植脂肪組織存活率的潛力[10-11]。在此基礎上臨床應用CAL技術(shù)可見移植脂肪存活率提高，但對于ADSCs促進脂肪移植存活率的實際機制仍未有明確證據(jù)及闡述。Kotaro Yoshimura等人的研究結(jié)果提示：移植脂肪組織的外周區(qū)域與受區(qū)內(nèi)環(huán)境直接接觸，可能具備建立早期血供的條件，故存活率較高。早期血供建立是移植物存活的關鍵因素之一。本課題組旨在證實ADSCs是否具備促進血管形成的潛力，探討其通過促進早期血供建立而提高移植物存活率的可能機制。

本次實驗運用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）建立細胞共培養(yǎng)體系，模擬體外ADSCs促進血管形成的能力，是檢測ADSCs對血管新生作用的可靠實驗方法[12-13]。通過HUVECs與ADSCs共同培養(yǎng)，觀察HUVECs的變化和管腔樣結(jié)構(gòu)形成的情況，表現(xiàn)ADSCs對HUVECs的成血管作用，探索ADSCs作為輔助細胞提高脂肪組織存活率的潛在能力，也真實模擬了臨床上應用基質(zhì)血管成分（Stromal vascular fraction， SVF）輔助脂肪移植中ADSCs對移植物存活的作用。管腔形成實驗（Tube formation assay，TFA）結(jié)果提示ADSCs可以通過共培養(yǎng)體系誘導內(nèi)皮細胞激活、增殖和遷移，促進管腔樣結(jié)構(gòu)形成，其可能機制為ADSCs旁分泌血管形成相關生長因子而達成的[14]。在如TGF-β、VEGF及FGF等多種生長因子的作用下，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)大量增殖并相互連接。由于ADSCs較強的耐缺氧能力，這些效應在早期是持續(xù)存在的。另一方面，鑒于間充質(zhì)干細胞的一些細胞學特性，ADSCs對于內(nèi)皮細胞的影響表現(xiàn)在很多方面，體現(xiàn)在ADSCs和HUVECs共培養(yǎng)體系中則是內(nèi)皮細胞增殖、遷移后圍繞ADSCs為中心聚團分布。細胞聚團現(xiàn)象使HUVECs細胞間隙縮短，間隙中生成的偽足樣芽生結(jié)構(gòu)難以觀察，對管腔樣結(jié)構(gòu)的形成造成了一定程度上的干擾。實際上在聚團的細胞間廣泛分布著網(wǎng)格狀的芽生樣結(jié)構(gòu)，且在顯微鏡視野下發(fā)現(xiàn)細胞團之間存在穩(wěn)定結(jié)合的芽生結(jié)構(gòu)，甚至部分視野可以發(fā)現(xiàn)多個細胞團間形成密閉完整的管腔樣結(jié)構(gòu)。而在Metrigel孵育時間的選擇中，考慮脂肪細胞的耐缺氧能力較差[15]，早期缺血缺氧是造成脂肪組織壞死、存活率較低的重要原因之一，早期血管新生血供建立可能是脂肪組織存活的關鍵條件。通過16h的短時程孵育進行觀察對比，探討了ADSCs對成血管過程和早期血供建立的實際作用。該實驗細胞共培養(yǎng)體系與臨床上CAL的情況較為相似：混合了ADSCs的脂肪組織移植后因ADSCs散在分布于受區(qū)，可能發(fā)揮促進血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成的作用，而廣泛形成的血管管腔樣結(jié)構(gòu)可能是早期局部微血管重建的基礎。微血管重建到早期血供建立的轉(zhuǎn)變，表明ADSCs的應用可以提供適合早期血供建立的基礎條件。而陰性對照組即添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)組，HUVECs未見明顯細胞增殖，無細胞聚團現(xiàn)象，所有視野均無管腔結(jié)構(gòu)形成，且未見任何細胞伸出偽足樣芽生結(jié)構(gòu)，可定義為體外無成管結(jié)果。這種無其他因素的培養(yǎng)體系內(nèi)HUVECs體外成管實驗所獲得的陰性結(jié)果與其他類似研究的結(jié)果相符[16]。這也充分說明內(nèi)皮細胞在無相關刺激和內(nèi)環(huán)境基礎下不能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，更不能過渡至早期血管重建。這也可能是脂肪移植早期血供缺乏、缺氧所導致存活率較低的原因。綜上所述，ADSCs在體外作用于HUVECs并促進管腔樣結(jié)構(gòu)的生成，即具備促進血管新生重建的功能。這也是ADSCs作為輔助細胞在CAL中促進早期血供建立、提高移植脂肪存活率的可能關鍵機制之一。

CAL是脂肪組織和輔助細胞聯(lián)合注射的手術(shù)方式，ADSCs對移植的脂肪組織的影響不能通過單一途徑闡述。ADSCs自身分化成脂[5]、協(xié)同作用、抗氧化[17]等作用途徑都可能影響移植物的存活率。體外內(nèi)皮細胞血管形成實驗與CAL體內(nèi)內(nèi)環(huán)境條件仍存在一定的差異，仍需要通過動物模型實驗進一步證實。此次實驗結(jié)果可作為理論基礎，通過建立合適的動物模型，模擬體內(nèi)ADSCs對脂肪組織早期血供建立的影響，通過移植脂肪存活率測量進一步闡明ADSCs在CAL中的實際作用。

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