TGF—β1調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和分化能力的影響研究

徐萬田 陳韻 林楠 唐玉香 閆翔

[摘要]目的：研究TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞增殖、分化和ERK/MAPK信號(hào)通路的影響。方法：采用Western blot檢測(cè)TGF-β1在急性牙髓組織、慢性牙髓組織和正常牙髓組織中的表達(dá)，然后采用Ⅰ型膠原酶消化分離培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，不同濃度的TGF-β1處理牙髓細(xì)胞7d，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。采用TGF-β1（5.0μg/L）和U0126（10μmol/L）分別單獨(dú)或聯(lián)合作用于牙髓細(xì)胞7d，CKK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；在第1、3、5和7天檢測(cè)堿性磷酸化酶活性；第7天時(shí)Western blot檢測(cè)ERK/MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白PPAR-γ和ELK-1水平。結(jié)果：TGF-β1在牙髓炎組織中低表達(dá)，且TGF-β1濃度在0.1～5.0?g/L時(shí)，從作用第3天開始能夠顯著促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖（P<0.05），具有時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)。U0126能夠抑制牙髓細(xì)胞的增殖和堿性磷酸化酶的活性，具有時(shí)間依賴性。TGF-β1能夠促進(jìn)PPAR-γ和ELK-1蛋白的表達(dá)，而U0126能夠降低TGF-β1對(duì)PPAR-γ和ELK-1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)論：TGF-β1可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖和分化，且具有時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]牙髓細(xì)胞；增殖；分化；堿性磷酸化酶；信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)]R781.3 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）04-0094-04

Effect of TGF-β1 on the Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Cell Based on ERK/MAPK Signaling Pathway

XU Wan-tian，CHEN Yun，LIN Nan，TANG Yu-xiang，YAN Xiang

（The Third Clinic Department，Nanjing Stomatological Hospital Medical School of Nanjing University，Nanjing 210008，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To study the effects of TGF-β1 on the proliferation， differentiation and ERK/MAPK signaling pathway of human dental pulp cells. Methods We used Western blot to detect TGF-β1 expression in acute and chronic dental pulp tissue organization and normal dental pulp tissue. Primary human dental pulp cells were isolated and cultured by typeⅠcollagenase digestion. Human dental pulp cells were treated by different concentrations of TGF-β1 for 7d. Used CCK-8 method to detect cell proliferation. Human dental pulp cells were treated by TGF-β1 （5.0μg/L） and U0126 （10μmol/L） separately or jointly for 7d and cell proliferation was detected by CKK-8 method. The activity of alkaline phosphorylase was detected in 1d， 3d， 5d and 7d. The levels of key proteins PPAR-γ and ELK-1 in the ERK/MAPK signaling pathway were detected by Western blot. Results TGF-β1 was low expression in the pulpitis tissue， and TGF-β1 concentration at 0.1-5.0μg/L， the proliferation of pulp cells was significantly promoted from the first 3d beginning （P<0.05）， with time and dose dependent effects. U0126 could inhibit the proliferation of pulp cells and the activity of alkaline phosphorylase， which had time dependence. TGF-β1 could promote the expression of PPAR-γ and ELK-1， while U0126 could reduce the promoter action of TGF-β1 on PPAR-γ and ELK-1 protein expression. Conclusion TGF-β1 could promote the proliferation and differentiation of pulp cells， and had time and concentration dependence effect， and its mechanism might be related to ERK/MAPK signaling pathway.

Key words： pulp cells； proliferation； differentiation； alkaline phosphorylase； signaling pathway

研究表明牙髓組織中含有自我增殖和分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)牙髓復(fù)合體受到損傷后，牙髓細(xì)胞就會(huì)向受損部位遷移完成對(duì)牙本質(zhì)的修復(fù)和保護(hù)[1]。但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming growth factor β1， TGF-β1）作為調(diào)控牙髓細(xì)胞遷移重要因子，參與到了反應(yīng)性牙本質(zhì)的修復(fù)[2]，有報(bào)道[3]稱其可以通過p38 MAPK信號(hào)調(diào)控抑制牙髓細(xì)胞增殖。研究表明胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/分裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路（Extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK）能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞的增殖和遷移[4]，而TGF-β1是否能夠基于ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)牙髓細(xì)胞增殖和分化進(jìn)行調(diào)控尚未見報(bào)道。堿性磷酸化酶（Alkaline phosphorylase， ALP）是一種正磷酸甲酯磷酸水解酶，研究表明其水平高低可以反映牙髓細(xì)胞的分化情況[5]。因此本文主要探討ERK/MAPK信號(hào)通路在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖以及分化中的作用，從而為牙髓組織修復(fù)提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 一般資料：選取南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院保存的急性牙髓炎組織標(biāo)本、慢性牙髓炎組織標(biāo)本和正常牙髓組織標(biāo)本各30例作為研究對(duì)象。

1.2 主要儀器和試劑：TGF-β1、ERK/MAPK信號(hào)通路阻斷劑U0126，采購自Peprotech公司。兔抗PPAR-γ、 ELK-1單克隆抗體自美國Abcam公司采購，酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀均采購自Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Western blot檢測(cè)TGF-β1在牙髓組織中的表達(dá)：急性牙髓組織、慢性牙髓組織和正常牙髓組織中蛋白各取100g，裂解蛋白酶進(jìn)行總蛋白提取。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整濃度，上樣進(jìn)行電泳，結(jié)束后4℃轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2h，加入一抗（羊抗TGF-β1單克隆抗體）、二抗（羊抗鼠IgG）37℃孵育2h，ECL顯影后掃描，蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參校正后經(jīng)Quanity-One軟件分析，β-actin作為內(nèi)參。

1.3.2 人牙髓組織體外培養(yǎng)和傳代：征得患者同意后，取在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院就診年齡18～25歲的因阻生或正畸而拔出的健康牙齒，乙醇消毒，在超凈臺(tái)中取出牙髓組織，然后PBS沖洗，放置于DMEM溶液中并剪成1～2mm3的組織塊，加入Ⅰ型膠原酶消化40min，然后低速離心棄上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右，加入胰酶進(jìn)行消化傳代，本研究采用第4～5代細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞增殖能力的影響：取傳代一致的牙髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105接種于96孔板中，每孔200μl，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，更換無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理24h，然后分別更換成含TGF-β1終濃度為0.1、0.5、2.0、5.0μg/L的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置只加DMEM的對(duì)照組，每隔2d更換一次培養(yǎng)基。然后在培養(yǎng)1、3、5和7d時(shí)，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組OD值。

1.3.4 ERK/MAPK信號(hào)通路在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖過程中的作用：實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.3，共分為4組：①對(duì)照組；②TGF-β1（5.0μg/L）處理組；③TGF-β1（5.0μg/L）+U0126（10μmol/L）處理組；④U0126（10μmol/L）處理組。

1.3.5 Western blot檢測(cè)PPAR-γ、ELK-1蛋白表達(dá)：按照1.3.4各組處理培養(yǎng)7d，提取蛋白，按照1.3.1步驟對(duì)PPAR-γ、ELK-1蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 堿性磷酸化酶水平檢測(cè)：取傳代一致的牙髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105接種于96孔板中，每孔200μl，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理24h，然后按照1.3.5分組替換含TGF-β1或U0126的培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)的1d、3d、5d和7d時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入50μl 1g/L的TrionX-100，4℃過夜，然后每孔加入200μl ALP底物，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，加入堿液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，繪圖采用GraphPad Prism 5.0軟件，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1在各牙髓組織中的表達(dá)比較：如圖1所示，TGF-β1在急性牙髓炎組織和慢性牙髓炎組織中的表達(dá)顯著低于正常牙髓組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

注：A.正常牙髓組織；B.急性牙髓炎組織；C.慢性牙髓炎組織；*表示與正常牙髓組織比較，P<0.05

圖1 TGF-β1在各牙髓組織中的表達(dá)

2.2 TGF-β1對(duì)牙髓組織增殖的影響：如圖2所示，在培養(yǎng)第3、5和7天，0.5、2.0、5.0μg/L TGF-β1組細(xì)胞中的OD490值均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且OD490值隨著TGF-β1濃度的增加而不斷升高。同一濃度下與第1天比較，OD490值在第3、5和7天均顯著升高（P<0.05）。本次后續(xù)研究選用TGF-β1濃度為5.0μg/L。

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05；△表示與第1天比較，P<0.05

圖2 TGF-β1對(duì)牙髓組織增殖的影響

2.3 ERK/MAPK信號(hào)通路在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖的影響：如圖3所示，牙髓細(xì)胞培養(yǎng)第3、5和7天，TGF-β1組細(xì)胞的OD490值顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；而TGF-β1+U0126組和U0126組的OD490值顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組（P<0.05）。

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05；△表示與TGF-β1組比較，P<0.05

圖3 ERK/MAPK信號(hào)通路在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖的影響

2.4 ERK/MAPK信號(hào)通路在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞分化的影響：如圖4所示，牙髓細(xì)胞培養(yǎng)第3、5和7天，TGF-β1組細(xì)胞ALP活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且隨著時(shí)間的增加，活性逐漸增高。而TGF-β1+U0126組和U0126組的細(xì)胞ALP活性顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組（P<0.05）。

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05；△表示與TGF-β1組比較，P<0.05

圖4 ERK/MAPK信號(hào)通路在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞分化的影響

2.5 TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖和分化中對(duì)PPAR-γ、 ELK-1蛋白表達(dá)的影響：如圖5所示，TGF-β1組PPAR-γ和ELK-1蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；而TGF-β1+U0126組和U0126組的PPAR-γ和ELK-1蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組（P<0.05）。提示U0126能夠降低TGF-β1對(duì)PPAR-γ和ELK-1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。

注：A.對(duì)照組；B.TGF-β1組；C.TGF-β1+UO126組；D.UO126組；*表示與對(duì)照組比較，P<0.05；△表示與TGF-β1組比較，P<0.05

圖5 TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖和分化中對(duì)PPAR-γ、ELK-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

牙髓組織作為一種有礦化組織包繞的疏松結(jié)締組織，在牙本質(zhì)形成、咀嚼和防御方面起著重要的作用，因此其健康與否直接關(guān)系到牙齒的形態(tài)和功能[6-7]。牙髓受損后，其治療立足于保存患牙，但是死髓牙要想進(jìn)行正常的咀嚼功能，仍需要大量的后續(xù)修復(fù)治療。因此保存活牙髓，對(duì)牙髓復(fù)合體組織進(jìn)行誘導(dǎo)再生，已成為目前口腔科研工作者不斷探尋的課題。

近年來研究表明生長(zhǎng)因子和牙本質(zhì)基質(zhì)成分可以作為始動(dòng)信號(hào)對(duì)牙髓進(jìn)行修復(fù)，相關(guān)的生長(zhǎng)因子譬如骨形成蛋白（Bone morphogenesis proteins， BMPs）、TGF-β1、胰島素樣生長(zhǎng)因子等這些都可以在牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓細(xì)胞中檢測(cè)到[3，8-9]。其中TGF-β1研究證實(shí)其是細(xì)胞增殖、分化和凋亡最重要的調(diào)控因子。本研究結(jié)果顯示TGF-β1在牙髓炎組織中的表達(dá)出現(xiàn)下降，隨著TGF-β1濃度的升高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞增殖越快。ERK/MAPK作為細(xì)胞中重要的信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種生理過程當(dāng)中，有文獻(xiàn)報(bào)道稱ERK/MAPK信號(hào)通路可以增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞的增殖和分化[10]。U0126是ERK/MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑[11]，本研究通過將TGF-β1和U0126分別單獨(dú)或聯(lián)合作用于牙髓細(xì)胞，結(jié)果顯示U0126能夠抑制TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞的增殖作用。本研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠促進(jìn)ERK/MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白PPAR-γ、 ELK-1的表達(dá)，提示ERK/MAPK信號(hào)通路參與到了TGF-β1誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞增殖過程。ALP作為一種正磷酸甲酯磷酸水解酶，其活性的高低可以對(duì)細(xì)胞的礦化和骨組織形成的狀況。在牙髓組織中常將其作為牙髓細(xì)胞想牙本質(zhì)細(xì)胞分化的早期標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示TGF-β1可以顯著增加ALP的活性，而U0126降低ALP的活性。

綜上所述，TGF-β1可以促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖和分化，且具有時(shí)間和濃度依賴性，其作用機(jī)制可能與ERK/MAPK信號(hào)通路相關(guān)，本研究為牙髓組織修復(fù)再生奠定了基礎(chǔ)。

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