宮頸癌前病變應(yīng)用P16/Ki—67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢查的診斷價(jià)值

方佳 陳鳳燕

[摘要]目的 探析P16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測在宮頸癌前病變?cè)\斷的準(zhǔn)確性。方法 選擇2016年5月～2017年3月我院收治的宮頸癌前病變患者900例，所有患者均接受P16/Ki-67免疫化學(xué)雙染法檢測、液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）、人乳頭瘤病毒DNA（HPVDNA）檢測，應(yīng)用P16/Ki-67免疫化學(xué)雙染法檢測宮頸癌前病變的陽性率，以病理活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估P16/Ki-67免疫化學(xué)雙染法、TCT法檢測宮頸癌前病變的準(zhǔn)確性。結(jié)果 900例患者，以病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)（陽性54例），發(fā)現(xiàn)宮頸癌前病變p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的特異性為82.3%（696/846），敏感性為92.6%（50/54），TCT檢查法的特異性為68.6%（580/846），敏感性為62.9%（34/54），兩種檢查方式比較，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的特異性、敏感性顯著高于TCT法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 P16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測可提高宮頸癌前病變?cè)\斷的準(zhǔn)確性，效果確切，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞]癌前病變；宮頸癌；化學(xué)雙染法；P16/Ki-67；細(xì)胞免疫學(xué)

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）4（c）-0125-03

Diagnostic value of P16/Ki-67 immunocytochemistry double staining for cervical precancerous lesions

FANG Jia CHEN Feng-yan

Department of Pathology，People′s Hospital of Puning City，Guangdong Province，Puning 515300，China

[Abstract]Objective To explore the application of P16/Ki-67 immunocytochemistry double staining in the diagnosis of cervical precancerous lesions for its accuracy.Methods A total of 900 patients with cervical precancerous lesions who were treated in our hospital from May 2016 to March 2017 were selected.Each patient was provided with P16/Ki-67 immunochemistry double staining assay and thinprep cytologic test （TCT） for human papilloma virus DNA.The positive rate of cervical precancerous lesions was detected using P16/Ki-67 immunochemistry double staining method.The pathological biopsy results were set as the gold standard，the accuracy of P16/Ki-67 immunochemistry double staining and TCT detecting cervical precancerous lesions was assessed.Results Among 900 participants，54 subjects were examined as positivity by pathological biopsy.The specificity and sensitivity of P16/Ki-67 immunocytochemistry double staining for cervical precancerous lesions were 82.3% （696/846） and 92.6% （50/54）.By TCT，they were 68.6% （580/846） and 62.9% （34/54） respectively.Compared with the two examination methods，the specificity and sensitivity of P16/Ki-67 immunocytochemistry double staining were superior to those by TCT with significant differences（P<0.05）.Conclusion The detection of P16/Ki-67 immunocytochemistry double staining can improve the diagnostic accuracy of cervical precancerous lesions in a definite effect，which is worthy of clinical promotion.

[Key words]Precancerous lesions；Cervical cancer；Chemical double staining；P16/Ki-67；Cellular immunology

宮頸原位癌的高發(fā)群體為30～35歲女性，浸潤癌的高發(fā)群體為45～55歲女性[1]。宮頸癌的發(fā)病與吸煙、感染滴蟲、單純皰疹病毒Ⅱ型、沙眼衣原體、多產(chǎn)、多孕、初產(chǎn)年齡小、性伴侶過多、感染人乳頭瘤病毒（HPV）等因素密切相關(guān)。宮頸癌早期無特異性臨床表現(xiàn)，病情進(jìn)展可出現(xiàn)排液、陰道流血等特征。研究表明，HPV是導(dǎo)致宮頸癌的因素之一，但只有持續(xù)長期感染HPV高危型病毒會(huì)引發(fā)高級(jí)別宮頸癌上皮內(nèi)瘤變，進(jìn)展為宮頸癌，同時(shí)通過新技術(shù)、新檢測方式有助于提高宮頸癌篩查的準(zhǔn)確性及有效性[2]。宮頸癌的細(xì)胞學(xué)篩查方式在實(shí)際臨床操作中存在重復(fù)性差、靈敏度較低，檢查結(jié)果存在一定的假陽性率及假陰性率，P16/Ki-67雙染檢測輔助細(xì)胞學(xué)技術(shù)診斷有助于降低陰道鏡的轉(zhuǎn)診率。本研究探析P16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測在宮頸癌前病變?cè)\斷準(zhǔn)確性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2016年5月～2017年3月來我院就診的宮頸癌前病變患者900例，均予以宮頸液基細(xì)胞學(xué)（TCT）檢查、HPV檢查，病理活檢結(jié)果確診，每位女性均接受P16/Ki-67免疫化學(xué)雙染法檢測、TCT檢查、HPVDNA檢測，根據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年《女性生殖器官腫瘤分類》標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，年齡23～59歲，平均（40.2±3.4）歲。文化程度：高中及以上學(xué)歷者535例，初中及以下學(xué)歷365例。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期、生理期、接受盆腔放射療法患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與研究者均知情同意。

1.2方法

P16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染方法由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供的細(xì)胞學(xué)P16/Ki-67雙染試劑盒。細(xì)胞薄片置于95%的乙醇中30 min，流動(dòng)水沖洗1 min，應(yīng)用EDTA8.0系統(tǒng)在95°C溫度下熱修復(fù)標(biāo)本20 min，滴加100 ul過氧化物酶，室內(nèi)常溫孵育10 min，滴加Ki-67抗體、P16抗體組合，室溫下孵育1 h，滴加100 μl顯色劑DAB，常溫下5 min孵育。蘇木素染色，應(yīng)用乙醇梯度脫水，中性樹膠固封。進(jìn)行HPVDNA檢驗(yàn)，TCT檢查，進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)專用毛刷在宮頸內(nèi)交界和鱗狀上皮處采集細(xì)胞，細(xì)胞洗涮至TCT專用取樣瓶內(nèi)，TCT制片機(jī)制作為薄層涂片，經(jīng)巴氏染色后予以鏡檢。以病理活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3檢查評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)及觀察指標(biāo)

比較p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測法、TCT檢測法的特異度、靈敏度。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%，靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%。P16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染檢測結(jié)果評(píng)估[3]：Ki-67呈黃色，位于細(xì)胞核上，細(xì)胞核部分交叉反應(yīng)呈棕褐色。p16呈紅色，位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核上。陽性結(jié)果為雙染細(xì)胞>1個(gè)出現(xiàn)在染色片內(nèi)；雙染細(xì)胞細(xì)胞核為棕褐色或黃色，而細(xì)胞質(zhì)呈紅色。陰性結(jié)果為染色片內(nèi)出現(xiàn)單染細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)雙染細(xì)胞。單染細(xì)胞為紅色細(xì)胞質(zhì)，棕褐色或黃色細(xì)胞核。兩位病理醫(yī)師閱片（巴氏染色涂片），良性或正常為陰性，異常腺上皮細(xì)胞、鱗狀上皮浸潤癌、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變，包含原位癌、中、重度鱗狀上皮不典型增生，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變、不排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變，無法明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞均為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS 18.0軟件系統(tǒng)處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

900例患者，以病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)（陽性54例），p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的特異性為82.3%（696/846），敏感性為92.6（50/54），TCT檢查法的特異性為68.6%（580/846），敏感性為62.9%（34/54），p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的特異性、敏感性顯著高于TCT法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1、2、3）。

表1 p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法與病理診斷宮頸癌前病變的診斷準(zhǔn)確性評(píng)估（n）

表2 TCT法與病理診斷宮頸癌前病變的診斷準(zhǔn)確性評(píng)估（n）

表3 p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法與TCT法特異性、靈敏性的比較[%（n1/n2）]

3討論

目前，較多發(fā)達(dá)國家應(yīng)用巴氏檢查或常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查法可降低宮頸癌的發(fā)病率。約有99%的宮頸癌患者與高危型病毒密切相關(guān)（HR-HPV）[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，從起初感染HR-HPV到進(jìn)展為宮頸癌最少不低于8年，HR-HPV陰性的女性在5～7年內(nèi)不會(huì)進(jìn)展為宮頸癌[5]。研究指出半年后再行細(xì)胞學(xué)檢查只檢測到部分高級(jí)別宮頸鱗狀上皮病變[6]。其中約有1/3的高級(jí)別宮頸鱗狀上皮病變持續(xù)感染最終診斷HR-HPV，HR-HPV多次檢測或重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)對(duì)陰道鏡轉(zhuǎn)診率的下降效果不佳[7]。目前，臨床醫(yī)學(xué)已應(yīng)用新型輔助檢查方式提高宮頸癌及癌前病變檢查的準(zhǔn)確性[8]。有已發(fā)生癌變或出現(xiàn)癌變趨勢的細(xì)胞核酸增生異常，在細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化前已經(jīng)出現(xiàn)了核酸變化[9-10]。宮頸上皮DNA非整倍體缺少可用于評(píng)估臨床預(yù)后。以往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)檢測DNA倍體的陽性預(yù)測值具有一定差異性，可能與標(biāo)本的數(shù)量、標(biāo)本的選擇密切相關(guān)[11]。

本研究探析輔助宮頸癌前病變?cè)\斷應(yīng)用P16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測法的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的特異性為82.3%（696/846），敏感性為92.6（50/54），TCT檢查法的特異性為68.6%（580/846），敏感性為62.9%（34/54），p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的特異性、敏感性顯著高于TCT法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與宋艷等[12]的研究結(jié)果大體一致，宮頸癌前病變的細(xì)胞學(xué)檢查是檢測其形態(tài)學(xué)，如形態(tài)改變則細(xì)胞學(xué)檢查則會(huì)出現(xiàn)一定的誤差性，重復(fù)診斷的結(jié)果不佳[13]。本研究結(jié)果顯示，以病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的檢查準(zhǔn)確率與病理活檢的準(zhǔn)確率，均超過90%以上兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而TCT的檢查陽性率為62.9%（34例）顯著低于病理活檢及p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法的檢查的特異性及敏感性更高，提示p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法和病理活檢的檢查準(zhǔn)確性更高，且檢查方式對(duì)機(jī)體無創(chuàng)傷性[14]。臨床已用單染Ki-67/P16法輔助檢測宮頸鱗狀上皮病變組織學(xué)，但需與組織形態(tài)學(xué)檢測相結(jié)合，用于鑒別宮頸鱗狀上皮萎縮性變化、反應(yīng)性變化、化生或病變[15]。過去應(yīng)用P16或Ki-67細(xì)胞單染評(píng)估結(jié)果準(zhǔn)確性較低，P16可用于評(píng)估宮頸癌Ⅰ級(jí)的預(yù)后[16]。本研究結(jié)果顯示，P16不僅在異常細(xì)胞上呈局限性表達(dá)，同時(shí)在健康的子宮化生、柱狀、內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均正常。P16過度表達(dá)阻滯細(xì)胞周期，細(xì)胞標(biāo)本顯示二者為雙標(biāo)蛋白表達(dá)方式[17]。單個(gè)癌細(xì)胞會(huì)通過HPV基因蛋白可通過P16/Ki-67的雙陽性表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期[18-19]。在DNA倍體分析基礎(chǔ)上，有可重復(fù)的細(xì)胞學(xué)制片雙染P16/Ki-67可促使一過性感染的假陽性下降，可降低宮頸活檢及陰道鏡的創(chuàng)傷性檢查，提高高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的陽性預(yù)測值，降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理壓力[20]。

綜上所述，P16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測可提高宮頸癌前病變?cè)\斷的準(zhǔn)確性，效果確切，值得臨床推廣。

[參考文獻(xiàn)]

[1]鄧麗，梁青松，鄧琳琳.宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織uPA、VEGF、Ki-67的表達(dá)在預(yù)測新輔助化療遠(yuǎn)期療效中的作用[J].中國老年學(xué)雜志，2016，36（18）：4506-4507.

[2]李凌，李隆玉，楊起楠，等.高危型HPV載量與分型檢測對(duì)宮頸高級(jí)別病變預(yù)測價(jià)值的前瞻性隊(duì)列研究[J].中國腫瘤臨床，2016，43（9）：376-380.

[3]熱米拉·熱扎克.E6癌蛋白對(duì)宮頸癌及癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)分層及長期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測作用研究：基于中國人群的前瞻性隊(duì)列研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2017，51（8）：750.

[4]張琳琳，張品南，蘇志春，等.宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查與高危型HPV檢測在宮頸癌前病變?cè)缙诤Y查中的對(duì)比性研究[J].中國癌癥雜志，2008，18（12）：947-949.

[5]師曉艷，雷俠.宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查與高危型HPV檢測用于宮頸癌前病變并發(fā)感染早期篩查的對(duì)比研究[J].中國性科學(xué)，2017，26（1）：33-35.

[6]陳汶，于露露，王紅，等.cobas4800高危型人乳頭瘤病檢測技術(shù)在子宮頸癌前病變篩查和細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)診中的應(yīng)用[J].中華腫瘤雜志，2012，34 （7）：543-548.

[7]胡莉琴.導(dǎo)流雜交人乳頭瘤狀病毒基因分型檢測在宮頸癌前病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國婦幼保健，2016，31（3）：491-493.

[8]陶志梅，潘敏，俞美娟，等.高危型人乳頭瘤病毒感染聯(lián)合液基薄層細(xì)胞檢測對(duì)宮頸癌及宮頸癌前病變篩查與隨訪的臨床意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（10）：2340-2343.

[9]康慧杰，王金桃，高晨菲，等.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1與甲基-CpG-結(jié)合蛋白2異常表達(dá)在宮頸病變中的作用及相互關(guān)系[J].中華流行病學(xué)雜志，2013，34 （12）：1223-1227.

[10]Sideri M，Garutti P，Costa S，et al.Accuracy of colposcopically directed biopsy：results from an online quality assurance programme for colposcopy in a population-based cervical screening setting in Italy[J].Biomed Res Int，2015，29（36）：119-121.

[11]Canfell K，Caruana M，Gebski V，et al.Cervical screening with primary HPV testing or cytology in a population of women in which those aged 33 years or younger had previously been offered HPV vaccination：results of the compass pilot randomised trial[J].PLoS Med.2017，14（9）：e1002388.

[12]宋艷，李凌，陳鳳，等.凹空細(xì)胞檢測在宮頸癌前病變篩查中的應(yīng)用及其與Hybrid Capture2-HPV檢測方法的比較[J].中華流行病學(xué)雜志，2010，31 （8）：959-960.

[13]鄒先進(jìn)，蔡蘭，劉穎，等.子宮頸癌前病變與子宮頸癌組織中p16INK4A蛋白檢測及其與人乳頭狀瘤病毒感染的關(guān)系[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39（9）：625-626.

[14]張文淼，帥次霞，鄭飛云，等.脆性組氨酸三聯(lián)體基因在宮頸癌前病變和宮頸癌中的表達(dá)及其與p53和HPV16/18的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2006，28（6）：151-152.

[15]喻芳明，葉滕，蘇楊娜，等.p53基因第4外顯子第72密碼子多態(tài)性與中國女性宮頸癌相關(guān)性的Meta分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，28（8）：770-775.

[16]Asimomytis A，Karanikou M，Rodolakis A，et al.mTOR downstream effectors，4EBP1 and eIF4E，are overexpressed and associated with HPV status in precancerous lesions and carcinomas of the uterine cervix[J].Oncol Lett，2016，12（5）：3234-3240.

[17]張濤，毛世華，唐良陷.宮頸上皮內(nèi)瘤變及早期宮頸癌組織中P16、HPVL-1殼蛋白的表達(dá)與HR-HPV載量相關(guān)性研究[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2016，22（7）：1839-1841.

[18]于靜，朱慧庭，趙晶晶，等. p16INK4a/Ki-67雙免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)不能明確意義的不典型鱗狀細(xì)胞和低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變患者的分流作用[J].中華病理學(xué)雜志，2017，46（5）：1061-1062.

[19]項(xiàng)媛媛，王苗苗，謝艷，等.P16蛋白、HPVL-1殼蛋白在CIN和早期宮頸癌組織中的表達(dá)及其篩查價(jià)值[J].中國婦幼健康研究，2017，28（7）：151-152.

[20]Zanotta N，Tornesello ML，Annunziata C，et al.Candidate soluble immune mediators in young women with High-Risk Human Papillomavirus Infection：high expression of chemo-kines promoting angiogenesis and cell proliferation[J].PLoS One，2016，11（3）：e151851.

（收稿日期：2018-01-23 本文編輯：崔建中）