絳柳雌株花芽分化1)

胡雨逸 周元超 王魯北 袁濤

(臨沂市園林科學(xué)研究院，臨沂，276000) (北京林業(yè)大學(xué))

絳柳(Salixmatsudanaf.pendula)為楊柳科柳屬落葉喬木，小枝黃色，光滑柔軟且下垂，狀若絲絳，常被誤認(rèn)為垂柳。由于生長速度快、適應(yīng)性強(qiáng)、分布區(qū)域廣，是我國北方地區(qū)重要的園林綠化、生態(tài)修復(fù)樹種，廣泛應(yīng)用于各類城鄉(xiāng)綠地綠化當(dāng)中[1]，栽植數(shù)量巨大。胡有寧[2]在調(diào)查研究城市森林系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)，絳柳已成為延安市除槐以外，栽植數(shù)量最多的行道樹樹種，占比高達(dá)14.81%。陳崇[3]、李想等[4]、秦仲[5]、趙松婷等[6]更是將其作為北京城市園林綠化代表樹種開展相關(guān)應(yīng)用性研究。

隨著柳樹的大量運用，柳絮的危害也日益凸顯。目前研究出的飛絮解決方法主要有噴水降絮、更新雌株、阻斷授粉、柳樹高位嫁接、疏除雌花序、激素調(diào)控雌花芽分化等[7-14]。但這些方法成本高、工作量大、效率低等，一直沒有有效地解決絳柳飛絮的問題。王建紅等[13]提出在成花決定時間前使用“抑花一號”注射樹干可有效防止次年飛絮，之后則無效果。因此，必須明確絳柳雌株花芽分化過程，準(zhǔn)確確定成花決定時間，才能更好地防治飛絮。

目前，有關(guān)花芽分化的研究多集中在花原基外觀形狀描述、花芽分化所需的內(nèi)源激素和營養(yǎng)物質(zhì)以及特征基因檢測方面[15-19]。前兩者難以準(zhǔn)確判定成花決定時間，后者則因技術(shù)難度大、成本高，難以廣泛應(yīng)用。王建紅等[13]在成花決定時間前應(yīng)分階段注射“抑花一號”，確定了毛白楊的成花決定時間，但未能明確該狀態(tài)下花芽的外部形態(tài)及其與花芽內(nèi)部分化過程之間的相關(guān)性，從而也無法有效地從外觀形態(tài)判定是否進(jìn)入成花決定態(tài)。另外，“抑花一號”注射法雖然可以準(zhǔn)確判定出楊柳屬的成花決定時間，但是由于定期切片觀察花芽分化所需期限較長，借助芽的形態(tài)特征判定更為高效。

本文應(yīng)用石蠟切片法觀察了注射“抑花一號”和未注射的絳柳雌株的花芽分化過程，觀察花芽分化前后花芽的外部形態(tài)特征和分化過程中的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為有效控制飛絮技術(shù)的推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

10年生以上株齡絳柳雌株，生長一致，胸徑10～40 cm，株高5～15 m，位于臨沂市濱河景區(qū)北城新區(qū)北京路與濱河西路交匯處東南側(cè)區(qū)段。

樣本采集：自2016年4月26日至7月25日，選取生長狀況和株齡一致的絳柳雌株，每5 d注射一次“抑花一號”?！耙只ㄒ惶枴睘榉勰?，微溶于水。每克藥劑需先完全溶于10 mL 95%酒精，再加水40 mL稀釋。然后選用與注射機(jī)匹配的鉆頭(1 cm)，用電鉆在樹干胸徑部位垂直鉆孔，20 cm胸徑以下打孔2個，20～30 cm胸徑打孔3個，30～40 cm胸徑打孔4個。最后用6HZ-1015型高壓樹木注射器，按1.75 mL·cm-1胸徑藥量平均注射到各注射孔中，每個處理設(shè)3個重復(fù)(3株樹)，每次采集3株樹冠中部四個朝向12根50～100 cm長度的當(dāng)年生健壯枝條的側(cè)芽100～200個，共計3 349個。

同時選取與上文生長狀況和株齡一致的絳柳雌株,不注射“抑花一號”,每5 d采樣1次。每次采集5株樹冠中部四個朝向12根50～100 cm長度的當(dāng)年生健壯枝條的側(cè)芽100～200個，共計3 287個，做對照。

花芽外觀形態(tài)觀察：樣本采集后用OlympusSZX7型體視顯微鏡觀察并拍照記錄，利用CellSens Entry軟件測量芽的長寬值，之后放入FAA固定液中固定。

花芽分化過程觀察：樣本固定2 d后剝芽處理初步觀察，統(tǒng)計不同形態(tài)分化時期的數(shù)量，保存代表性芽體。7 d后脫水包埋，MicroHM315R型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，切片厚度10～12 μm，番紅、固綠雙重染色，中性樹膠封片，OlympusBX53型熒光顯微鏡觀察并照相。石蠟切片制作方法參考賀冰等[20]的方法，番紅、固綠染色方法加以改進(jìn)，由原來的切片復(fù)水后染色改為直接染色。

花芽分化進(jìn)程觀察：于2017年3月份，隨機(jī)剪取對照組和“抑花一號”處理的雌株樹冠中部東西南北四個方向12根50～100 cm長度的2年生健壯枝條，觀察并記錄其上柔荑花序及葉芽的數(shù)量。兩者之和為枝條上總芽數(shù)。計算雌花芽數(shù)量所占百分比。

雌花芽百分比=(柔荑花序數(shù)量/總芽數(shù)(葉芽數(shù)量+柔荑花序數(shù)量))×100%

物候期觀察：自2016年1月1日至7月25日，每3 d進(jìn)行一次物候期觀測。

數(shù)據(jù)分析方法：所得試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進(jìn)行整理、繪圖，再利用SPSS 22.0軟件做單因子差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花芽外觀形態(tài)特征

觀測期間，絳柳雌花芽整體呈綠色，無明顯顏色變化；外被絨毛，但明顯毛量變化。由表1數(shù)據(jù)可見，觀測期間，絳柳花芽的長度變化于1.88±0.24至2.67±0.40，P值為0.11，無顯著差異，無法作為判定花芽分化進(jìn)程的依據(jù)；寬度變化于1.15±0.14至1.62±0.31，P值為0.10，無顯著差異，無法作為判定花芽分化的依據(jù)；長寬比變化于1.59至1.86，但呈現(xiàn)一定趨勢變化規(guī)律，圖1顯示了從花芽分化開始到雌蕊分化結(jié)束時期，絳柳雌株花芽的外觀大小變化，芽形狀沒有明顯的變化，但在6月5日前芽的長寬比呈明顯的下降趨勢，6月5日長寬比降至最低值，隨后呈升高趨勢。這一變化規(guī)律與花芽分化進(jìn)程相一致，但無法構(gòu)成判定各分化過程的依據(jù)。

表1 絳柳雌花芽不同發(fā)育階段的形態(tài)

2.2 花芽分化過程

據(jù)觀察，絳柳雌株的芽為混合芽，雌花芽分化始于5月21日，觀察期間經(jīng)歷了花序原基分化期、小花原基分化期、雌蕊分化期3個時期。

花序原基分化期：5月21日至5月31日，花芽外觀較為干癟瘦小，剝開芽鱗后絨毛尚未形成或較少。內(nèi)部生長錐由尖變圓(圖2A)，形成花序軸(圖2B)，并在花序軸上開始形成小花原基突起(圖2C)。

小花原基分化期：6月5日至7月10日，花芽基部漸寬、頂部明顯伸長，整體圓潤飽滿，剝開芽鱗絨毛日趨增多。內(nèi)部花序軸兩側(cè)開始分化出小苞片(圖3A)。小苞片與花序軸之間的苞腋處生長點細(xì)胞分裂加劇，進(jìn)而形成半球形隆起即小花原基(圖3B、3C)。小花原基不斷變大(圖3D、3E、3F)，與花序組織的細(xì)胞界線變明顯(圖3G、3H、3I)。雌花芽上所有小花原基在這一時期內(nèi)基本全部形成(圖3J)。

A.5月26日絳柳雌花芽，標(biāo)尺=1 mm；B.7月20日絳柳雌花芽，標(biāo)尺=1 mm。

A.5月21日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；B.5月26日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；C.5月31日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；Gc.生長錐；R.花序軸；B.苞片；F.絨毛。

雌蕊分化期：7月15日后，花芽外觀形態(tài)較前期差異不明顯。但內(nèi)部小花原基突起不斷增大，小苞片上下表面出現(xiàn)絨毛，之后形成雌蕊原基(圖3K)。

此外，7月15日后注射“抑花一號”的雌株花芽的切片中，花序軸中下部的小花原基出現(xiàn)部分?jǐn)∮F(xiàn)象(圖3L)。

2.3 花芽分化進(jìn)程

根據(jù)圖4數(shù)據(jù)，未處理的絳柳雌株花芽百分率為65.77%～65.79%。2016年6月5日以后“抑花一號”處理的雌株，雌花芽百分率開始升高；到7月15日以后，已有59.01%的側(cè)芽分化為雌花芽。根據(jù)前文花芽分化階段觀察結(jié)果可知，6月5日至7月15日側(cè)芽已分化出小花原基，并于7月15日前后進(jìn)入雌蕊分化期。可見，6月5日后注射“抑花一號”已不能逆轉(zhuǎn)側(cè)芽向花芽分化的進(jìn)程。而2016年6月5日前(即2016年4月26日—5月31日)注射“抑花一號”的絳柳雌株，2017年3月觀察的雌花芽百分率為0～3.51%。由此推斷，在臨沂地區(qū)絳柳雌株的成花決定時間為6月5日至7月10日。

此外，在2017年3月份觀察期間發(fā)現(xiàn)6月5日后注射“抑花一號”的雌株2年生枝條上部分柔荑花序有正常的花序軸和小苞片，但小花全部敗育，無果實，不飛毛；隨著時間推移，這樣的花序從上到下越來越多(圖5)。由此推斷，絳柳雌株在6月5日，即小花原基分化期開始時進(jìn)入花序決定態(tài)，花序軸及小苞片分化完成且無法逆轉(zhuǎn)，但花序軸上的小花尚未進(jìn)入小花決定態(tài)；在小花原基分化期應(yīng)用“抑花一號”可使絳柳雌株花序上小花的分化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，無法完成全部分化，特別是雌蕊的分化，導(dǎo)致不開花或者小花敗育，但花序的分化已完成，花序軸和其上的小苞片已形成無法逆轉(zhuǎn)[21-22]。這與Ferguson et al.[23]豌豆分生組織或芽的測定結(jié)果一致。小花原基分化期是控制絳柳雌株成花決定的關(guān)鍵時期，抑制花序上小花的分化是防治次年飛毛的關(guān)鍵。

2.4 花芽分化時間與物候期

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，絳柳雌花一般在果實開始脫落期(即飄絮開始期4月13日)后的38 d左右陸續(xù)進(jìn)入花芽分化；52 d后完成花序決定態(tài)，進(jìn)入小花原基分化期，開始花的決定；93 d后進(jìn)入雌蕊原基分化期，從開始花芽分化到雌蕊分化完畢持續(xù)約103 d。采用化學(xué)藥劑防治飛絮藥物阻止絳柳雌株花芽分化的處理時間從花芽分化開始之前的25 d到小花原基分化前都有效果，即開始飛絮后的13～52 d。

A.6月5日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；B.6月10日雌花芽，標(biāo)尺=200 μm；C.6月15日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；D.6月20日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；E.6月25日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；F.6月30日雌花芽，標(biāo)尺=200 μm；G.7月1日雌花芽，標(biāo)尺=200 μm；H.7月5日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；I.7月10日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；J.7月15日雌花芽，標(biāo)尺=100 μm；K.雌蕊分化期，標(biāo)尺=50 μm；L.小花原基敗育，標(biāo)尺=100 μm;R.花序軸；Fp.小花原基；b.小苞片；Pp.雌蕊原基；F.絨毛；Fa.小花敗育。

圖3絳柳花芽分化過程

圖4 2016年絳柳雌株雌花芽百分比(統(tǒng)計時間2017年3月份)

A.小花敗育的雌花序，可見正常的花序軸和逆轉(zhuǎn)成葉片功能的小苞片；B.雌花序，可見宿存的柱頭；C.葉。

表2 2016年絳柳雌株物候觀測記錄

3 結(jié)論與討論

臨沂地區(qū)絳柳雌株成花決定時間為6月5日至7月10日。這與王建紅等[14]在北京地區(qū)對垂柳的花芽分化發(fā)端時間(6月24日至7月14日)的試驗結(jié)果差距較大。植物的發(fā)育是由遺傳因素和環(huán)境條件共同決定的，其中光周期和溫度是影響開花誘導(dǎo)的主要環(huán)境因子[24]。這種差異可能是由物種及氣候的差異所致。

臨沂地區(qū)5月份至8月份絳柳雌株花芽分化大致經(jīng)歷了花序原基分化期、小花原基分化期、雌蕊分化期3個時期。這一結(jié)果與張明照[16]的研究結(jié)果基本一致，但各時期開始時間略有提前，可能是由于臨沂地區(qū)的環(huán)境氣候較北京更為溫暖、濕潤，物候期整體提前有關(guān)。

試驗期間絳柳物候期的觀測記錄表明：雌株一般在開始飄絮后的38 d左右進(jìn)入花芽分化，52 d進(jìn)入成花決定，整個過程持續(xù)約103 d。注射化學(xué)藥劑物阻止絳柳雌花花芽分化的作用時間應(yīng)在開始飛絮后的13～52 d。結(jié)合與鄭景云等[26]做出的關(guān)于春季物侯期隨地理位置的推移幅度規(guī)律，可以大致推算出北方其他地區(qū)的花芽分化發(fā)端及成花決定日期，建立了絳柳花芽分化進(jìn)程與宏觀物候變化的聯(lián)系，打破飛絮控制技術(shù)應(yīng)用的地域限制。

目前，利用石蠟切片法觀察花芽分化的相關(guān)研究大多旨在建立花芽分化進(jìn)程與花芽外觀形態(tài)變化特征(如長度、寬度、長寬比、顏色等)的對應(yīng)關(guān)系上，達(dá)到減少重復(fù)試驗，指導(dǎo)生產(chǎn)應(yīng)用的目的[15-16,25]。但是文中發(fā)現(xiàn)絳柳雌花芽外觀形態(tài)變化并未呈現(xiàn)出如顏色變化、長寬比固定等顯著特征。當(dāng)雌株完成花序決定進(jìn)入小花的決定(即小花原基分化期)時，芽外觀一直為綠色并無明顯顏色變化；芽體整體圓潤飽滿，長寬比無顯著變化；此時剝開芽鱗可見被毛的幼葉，內(nèi)部花序軸兩側(cè)小苞片及小花原基突起基本全部形成，但尚未分化出雌蕊原基。當(dāng)雌蕊原基分化開始后，可見花序軸兩側(cè)小苞片上絨毛開始形成。因此，花序軸兩側(cè)小苞片上絨毛的有無可作為絳柳雌株成花決定期的判斷依據(jù)之一，此時花序的小花原基進(jìn)入雌蕊原基分化期?？梢耘袛啵藭r小花原基已分化完畢。“抑花一號”對絳柳植株花芽分化的抑制，表明絳柳雌株花芽分化過程中，花序決定與小花決定是可以分開的。絳柳雌花芽可以形成花序，分化出花序軸且形成小苞片(當(dāng)剝?nèi)ゴ浦昊旌涎康难亏[和幼葉，看見大量的絨毛包被著花序時)，此時注射“抑花一號”仍可以有效抑制次年飛絮，但小花分化完成后(此時剝除芽鱗和幼葉，小苞片上形成絨毛，包被著小花原基時)，注射“抑花一號”已無效果。這一結(jié)果與前任對金魚草突變體、豌豆花序和花的分化觀察結(jié)果基本一致[23,27]。

絳柳作為城市園林綠化常用樹種，其飛絮治理問題一直影響著市民的生活。通過對絳柳花芽分化規(guī)律的研究，為飛絮控制技術(shù)的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，在生態(tài)損益最小、社會影響最低的前提下，科學(xué)有效地解決飛絮問題。

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