無患子皂苷對3種植物病原菌的抑菌活性1)

赫文琦 魏松坡 賈黎明

(省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

無患子(Sapindusmukorossi)是無患子科(Sapindaceae)無患子屬(Sapindus)的1種落葉喬木，俗稱肥皂樹、洗手果等，主產(chǎn)于我國及東南亞各國，在長江流域、南部各省及海南島均有分布和栽培，北可及河南北部。無患子的果皮、種子、根、皮、葉是重要的天然表面活性劑、生物柴油、中藥等的原料，具有重要的多功能開發(fā)價(jià)值。目前對無患子的研究主要集中在種質(zhì)資源評價(jià)、栽培技術(shù)、化學(xué)成分的分析及有效成分皂苷的提取與分離[1-8]。同時研究表明，無患子皂苷還具有抗病毒、降血壓、抗真菌、殺蟲等多種藥理作用[9-15]。

但是，現(xiàn)階段針對無患子皂苷抑制細(xì)菌和真菌活性的研究還較少，且大多都集中在人體的病原菌方面[8-10]。而對于林業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說，綠色、安全、低毒的病害防治藥劑為業(yè)界求之若鶩。無患子果皮化學(xué)組分的抑菌性，為動植物細(xì)菌、真菌病害防治開辟了一條植物源抑菌新道路。無患子果皮提取物作為一種植物源殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上起到了一定的作用[16]，而在林業(yè)生產(chǎn)上的作用，已有一定開發(fā)，但尚未成熟。本研究選用獼猴桃腐爛病菌(Neofusicoccumparvum)、桉樹潰瘍病菌(Lasiodiplodiatheobromae)和歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌(Lonsdaleaquercinasubsp.populi)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，研究無患子皂苷的抑菌作用，以期為植物源抑菌劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

無患子果皮水提濃縮液獲得的皂苷液，由福建省源華林業(yè)生物科技有限公司提供。

桉樹潰瘍病病菌、獼猴桃腐爛病菌、歐美楊樹潰瘍病菌的菌種由北京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、水)；LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂)。

1.2 方法

1.2.1 無患子皂苷提取液質(zhì)量濃度的測定

將5 mL皂苷液旋蒸成糊狀，用蒸餾水將其洗滌出，再用水飽和正丁醇進(jìn)行反復(fù)萃取，每次正丁醇的用量為10 mL，向萃取后的溶液中加入20 mL甲醇。用35%的鹽酸進(jìn)行2 h的水解，再次進(jìn)行旋蒸后，乙酸乙酯萃取3次(20、10、10 mL)，再加入甲醇定容至10 mL，設(shè)置3個重復(fù)。

配制0.10 g·L-1齊墩果酸-甲醇對照液10 mL，備用；配制5%香草醛-冰醋酸液10 mL，備用。用微量加樣器取對照液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別置于7支具塞試管中，水浴揮干溶劑，先后依次加入香草醛-冰醋酸液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，充分搖勻后于70 ℃水浴加熱15 min，取出后立即冰水冷卻2 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻，在547 nm處測吸光度，以不加對照液為空白組[17]。分析得出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，將處理過的無患子水提液稀釋100倍，吸取0.3 mL液體按上述過程操作測得其吸光度，通過其與齊墩果酸相對應(yīng)的無患子總皂苷的換算系數(shù)[18]，計(jì)算無患子皂苷液的質(zhì)量濃度。

1.2.2 真菌抑菌活性試驗(yàn)

菌株培養(yǎng)：用滅菌的接種針挑取2種菌物的菌絲，接種在PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。

抑菌平板的制作：①皂苷液涂布抑菌。稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和10 g瓊脂，充分溶解后補(bǔ)足水分至1 000 mL，高壓蒸汽(121 ℃)滅菌20 min，將其趁熱倒入經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，凝固后備用。將無患子皂苷液分成3個質(zhì)量濃度,C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1，用針式過濾器進(jìn)行過濾滅菌，以無菌水作為空白對照，共4個處理，每一個處理設(shè)置5個重復(fù)。將4種處理液用滅菌的涂布器均勻涂布在PDA培養(yǎng)基的表面。②皂苷液培養(yǎng)基混合抑菌。將無患子皂苷液分成3個質(zhì)量濃度,C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1，過濾滅菌，按V(皂苷液)∶V(PDA培養(yǎng)基)=1∶4配制帶毒平板培養(yǎng)基[19],以無菌水作為空白對照，共4個處理，每一個處理設(shè)置5個重復(fù)。

抑菌試驗(yàn)：在2種方法制作的有毒培養(yǎng)基上分別接種桉樹潰瘍病病菌、獼猴桃腐爛病菌2種真菌的菌絲，將2種抑菌平板在培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)3 d，每天觀察結(jié)果并測量菌落的直徑。

抑菌率=((對照抑菌圈直徑-試驗(yàn)抑菌圈直徑)/對照抑菌圈直徑)×100%。

1.2.3 細(xì)菌抑菌活性試驗(yàn)

菌株的培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取所用菌種，用平板劃線法接種在LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。

無患子皂苷液抑菌試驗(yàn)：①牛津杯法。稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂10 g，配置成1 000 mL的蒸餾水體系，充分溶解后將pH調(diào)節(jié)至7.2，高壓蒸汽(121 ℃)滅菌20 min，將其趁熱倒入經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，凝固后備用。將無患子皂苷液分成5個質(zhì)量濃度,C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1、C4=5.57 g·L-1、C5=2.79 g·L-1，并過濾滅菌，以無菌水作為空白對照，共6個處理。每一個培養(yǎng)基加入0.1 mL菌懸液，并均勻涂布，細(xì)菌懸液菌數(shù)為1.0×1010個·mL-1。將滅菌牛津杯用無菌鑷子夾出，先置于酒精燈火焰上迅速過一下火，再垂直放置于培養(yǎng)基表面，輕輕按壓，使杯底與培養(yǎng)基之間無縫隙。每個平板放置2個牛津杯(外徑為8 mm)，每種處理設(shè)置3個平板，即每種處理6個重復(fù)，向每個牛津杯注入150 μL的處理液[20]。在培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，測量并計(jì)算抑菌圈大小和抑菌率。

抑菌圈=試驗(yàn)抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑；

抑菌率=((試驗(yàn)抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑)/試驗(yàn)抑菌圈直徑)×100%。

②皂苷液培養(yǎng)基混合抑菌：將無患子皂苷液分成3個質(zhì)量濃度，C1=44.56 g·L-1、C2=22.28 g·L-1、C3=11.14 g·L-1，過濾滅菌，以無菌水作為空白對照，共4個處理。按V(皂苷液)∶V(LB培養(yǎng)基)=1∶4配制有毒培養(yǎng)基。用滅菌后的接種環(huán)挑取歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌，將其接種在4種培養(yǎng)基上，每一個處理設(shè)置5個重復(fù)。并將接種好的抑菌平板放置在的培養(yǎng)箱中30 ℃倒扣培養(yǎng)，每天觀察試驗(yàn)結(jié)果，記錄菌落數(shù)目。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較3種病原菌在不同處理下、不同時間內(nèi)的菌圈直徑數(shù)據(jù)，設(shè)定影響因子為皂苷液質(zhì)量濃度。同因素不同水平間的差異顯著性采用鄧肯多重極差檢驗(yàn)法(Duncan)和最小顯著差數(shù)法(LSD)在0.05和0.01水平上進(jìn)行檢驗(yàn)。分析前，數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirnov test和Levene test檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸分析，得回歸方程為y=8.372 6x+0.005 6，R2=0.990 9，線性關(guān)系較好，測得公司提供的無患子皂苷液吸光度是0.492，通過換算得到其質(zhì)量濃度C=(44.56±0.76)g·L-1。

2.2 對真菌活性的抑制

2.2.1 涂布抑菌

從表1可以看出，2種真菌生長速度較快，都可以在培養(yǎng)基上正常生長，各個質(zhì)量濃度的皂苷液和空白對照間不存在顯著差異，說明用無患子皂苷液涂布法對2種真菌不存在抑制作用。

表1 無患子皂苷液涂布對真菌菌落的抑制效果

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=5)，培養(yǎng)基的直徑為9.0 cm。

2.2.2 皂苷液PDA培養(yǎng)基混合抑菌

從表2和圖1可以看出，不同處理的菌落直徑差異極顯著，說明皂苷液培養(yǎng)基混合法對2種真菌存在抑制作用，且隨著皂苷液質(zhì)量濃度的提高，抑制作用也提高。當(dāng)皂苷液質(zhì)量濃度為11.14 g·L-1時，桉樹潰瘍病菌落直徑第1天、第2天、第3天分別為0.82、4.23、7.56 cm，抑菌率分別為76.4%、52.2%、16.0%。當(dāng)皂苷液質(zhì)量濃度達(dá)到22.28 g·L-1時，抑菌率達(dá)到了100%。獼猴桃腐爛病也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。

表2 皂苷液PDA培養(yǎng)基混合處理對真菌菌落的抑制效果

皂苷提取液/g·L-1獼猴桃腐爛病菌第1天菌落直徑/cm抑菌率/%第2天菌落直徑/cm抑菌率/%第3天菌落直徑/cm抑菌率/%44.560C100.00C100.00C100.022.280C100.00C100.00C100.011.14(0.50±0.04)B80.5(2.52±0.33)B64.1(4.98±0.26)B43.8CK(2.57±0.07)A0(7.02±0.21)A0(8.86±0.09)A0

注：表中菌落直徑的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=5)，數(shù)據(jù)后同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。培養(yǎng)基的直徑為9.0 cm。

N．獼猴桃腐爛病(Neofusicoccumparvum)；L.桉樹潰瘍病病菌(Lasiodiplodiatheobromae)；1～4.皂苷液質(zhì)量濃度分別為0、11.14、22.28、44.56 g·L-1。

圖1皂苷液PDA培養(yǎng)基混合抑菌(培養(yǎng)第2天)

2.3 對細(xì)菌活性的抑制

2.3.1 牛津杯法

從表3可以看出，隨著皂苷液質(zhì)量濃度的提高，抑菌圈直徑差異極顯著，說明牛津杯法對歐美楊樹潰瘍病菌存在抑制作用。皂苷質(zhì)量濃度為2.79、5.58 g·L-1時抑菌率為0；當(dāng)質(zhì)量濃度上升至11.14、22.28、44.56 g·L-1時，抑菌率分別達(dá)到了15.8%、27.9%、38.9%。

2.3.2 皂苷液LB培養(yǎng)基混合抑菌

歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌在空白對照培養(yǎng)基上生長良好，而在混有質(zhì)量濃度為44.56、22.28、11.14 g·L-1的皂苷液的抑菌平板上均不能生長，抑菌率達(dá)到了100%(表4、圖2)。

表3 皂苷提取液對歐美楊樹潰瘍病菌的抑制作用

注：抑菌圈直徑是培養(yǎng)第4天的觀察結(jié)果，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=6)，數(shù)據(jù)后同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表4皂苷液LB混合培養(yǎng)基對歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌的抑制作用

皂苷提取液/g·L-1菌落/個抑菌率/%44.56 010022.28010011.140100CK≥100

注:菌落數(shù)是培養(yǎng)第4天觀察的結(jié)果。

A-D.皂苷液質(zhì)量濃度分別為0、11.14、22.28、44.56 g·L-1。

圖2皂苷液LB混合培養(yǎng)基對歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌的抑制情況(培養(yǎng)第4天)

3 討論

無患子皂苷含有羥基和羧基，為極性分子，分子質(zhì)量較小，均在1 000左右，因此，皂苷可能通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜阻礙微生物的核酸復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過程以及蛋白質(zhì)的翻譯過程，由此抑制微生物的生長繁殖[21]，而真菌和細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異大，所以無患子皂苷液對它們的抑制作用存在差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無患子皂苷液對細(xì)菌病害的抑制作用強(qiáng)于真菌性病害，這與趙志敏等[22]得出的結(jié)論：無患子皂苷對真菌(白色念珠菌(Moniliaalbican)和黑曲霉菌(Aspergillusniger))的抑菌性優(yōu)于細(xì)菌(大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus))不同，這可能在于選取的真菌種類不同而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和耐藥性存在差異。

朱朝陽等[21]發(fā)現(xiàn)，無患子皂苷液對大腸桿菌(Escherichiacoli)有抑制作用，而歐美楊樹潰瘍病菌與大腸桿菌都屬于腸桿菌科，在結(jié)構(gòu)和代謝水平上有一定的相似性，所以無患子皂苷液對它們均存在抑制作用。且歐美楊樹潰瘍病菌與大腸桿菌都是革蘭氏陰性菌，印證了趙志敏等[22]的結(jié)論：無患子的皂苷對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌)的抑菌性優(yōu)于革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)。牛津杯法抑菌，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其質(zhì)量濃度呈梯度遞減。相比于牛津杯法抑菌，混合皂苷液和LB制成的有毒培養(yǎng)基，皂苷液的質(zhì)量濃度更穩(wěn)定，皂苷的含量更多，所以在相同的質(zhì)量濃度下對歐美楊樹潰瘍病菌的抑制作用較好。

皂苷液涂布法對2種真菌不存在抑制作用，將皂苷液與PDA混合制作成的有毒培養(yǎng)基對2種真菌均存在較強(qiáng)的抑制作用，推測這與皂苷液的含量有關(guān)，即混合制成的培養(yǎng)基中皂苷含量更多，對細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。

目前，在不規(guī)范使用化學(xué)殺菌劑的今天，已經(jīng)造成了對環(huán)境的破壞，也導(dǎo)致了病原菌產(chǎn)生了抗藥性。因植物源的抑菌作用機(jī)制不同于抗生素，不易使病菌產(chǎn)生耐藥性，且綠色、環(huán)保，日益倍受關(guān)注。依據(jù)本研究的結(jié)果，推測可以用噴灑皂苷液制劑對歐美楊樹潰瘍病菌進(jìn)行防治，利用膏狀皂苷制劑涂抹在歐美楊樹潰瘍病菌、桉樹潰瘍病菌、獼猴桃腐爛病菌導(dǎo)致的患病處進(jìn)行治療。目前關(guān)于無患子皂苷在抑菌方面的研究較少，本試驗(yàn)只對無患子皂苷提取液的抑菌作用做了初步研究，下一步將研究皂苷的抑菌機(jī)理，以便能為無患子植物源抑菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。因此，積極探討無患子皂苷的抑菌作用，以指導(dǎo)合理使用植物源抑菌劑和化學(xué)殺菌劑協(xié)同使用，對減少耐藥病菌、合理保護(hù)環(huán)境，有著積極的現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

用無患子皂苷液涂布制成的有毒培養(yǎng)基對桉樹潰瘍病病菌、獼猴桃腐爛病菌2種真菌不存在抑制作用，而利用皂苷液與培養(yǎng)基混合制成的有毒培養(yǎng)基，隨著皂苷液質(zhì)量濃度的增大，對2種真菌的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)皂苷質(zhì)量濃度達(dá)到44.56、22.28 g·L-1時，對2種真菌的抑制率分別達(dá)到了100%。細(xì)菌對皂苷液的敏感性強(qiáng)于真菌，隨著皂苷液質(zhì)量濃度的增大，牛津杯法抑菌對歐美楊樹潰瘍病細(xì)菌的抑制作用增強(qiáng)，皂苷質(zhì)量濃度為44.56 g·L-1時，抑菌率達(dá)到了38.9%；皂苷質(zhì)量濃度在44.56、22.28、11.14 g·L-1時，皂苷液培養(yǎng)基與混合培養(yǎng)基的抑菌率均達(dá)到了100%。無患子皂苷對細(xì)菌病害的抑制作用強(qiáng)于真菌性病害，且皂苷液與培養(yǎng)基混合配置的方法抑菌效果更好。本試驗(yàn)可為探索抑菌機(jī)理、開發(fā)植物源抑菌劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 賈黎明,孫操穩(wěn).生物柴油樹種無患子研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,17(6)：191-196.

[2] SUN C W, JIA L M, XI B Y, et al. Natural variation in fatty acid ofSapindusspp. seed oils[J]. Industrial Crops and Products,2017,102:97-104.

[3] 高媛,賈黎明,高世輪,等.無患子樹體合理光環(huán)境及高光效調(diào)控[J].林業(yè)科學(xué),2016,52(11):29-38.

[4] 高媛,賈黎明,蘇淑釵,等.無患子物候及開花結(jié)果特性[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,43(6)：34-40，123.

[5] 劉濟(jì)銘,孫操穩(wěn),何秋陽,等.國內(nèi)外無患子屬種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究,2017,30(6)：12-18.

[6] 饒厚曾,郭隆華.無患子皂苷提取工藝研究[J].江西科學(xué),2002,20(1)：55-58．

[7] 黃素梅,王敬文,杜孟浩,等.無患子的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用[J].林業(yè)科技開發(fā),2009,23(6)：1-4.

[8] 姜翠翠,葉新福,盧新坤,等.無患子研究進(jìn)展概述[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,28(4)：405-411．

[9] 徐凱節(jié),次旦扎西,丁立生.無患子屬植物的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(2)：267-273，257.

[10] 史青.無患子果皮中皂苷的抗皮真菌活性[J].國外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊),2002,24(5)：300-301.

[11] IBRAHIM M, KHAN A A, TIWARI S K, et al. Antimicrobial activity ofSapindusmukorossiandRheumemodiextracts againstHpylori:Invitroandinvivostudies[J]. World Journal of Gastroenterology,2006，12(44):7136-7142.

[12] IBRAHIM M, KHAJA M N, AARA A， et al. Hepatoprotective activity ofSapindusmukorossiandRheumemodiextracts:Invitroandinvivostudies[J]. World Journal of Gastroenterology,2008，14(16):2566-2571.

[13] HUANG H C, TSAI W J, LLAW C C, et al. Anti-platelet aggregation triterpene saponins from the galls ofSapindusmukorossi[J]. Chem Pharm Bull,2007,55(9)：1412-1415.

[14] 王維勝,龍子江,張玲,等.無患子皂苷對腎性高血壓大鼠血壓及血管活性物質(zhì)的影響[J].中國中藥雜志,2007,32(16)：1703-1705.

[15] 金秋,奚立民,張昕欣,等.無患子皂苷的抗菌活性研究[J].科技通報(bào),2014,30(3):35-38,52.

[16] 譚明輝.無患子及其組方抗稻瘟病菌活性皂苷的提取分離及田間藥效[D].南昌:江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[17] 唐青濤,邱海燕,廖偉玲,等.紫外分光法測定無患子果皮中總皂苷的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(5)：84-86.

[18] 張翠.無患子總皂苷制備工藝研究[D].無錫:江南大學(xué),2012.

[19] 林蘭穩(wěn),李兆雄,何熊威.粉葛根腐病菌的生物學(xué)特性及防治研究[J].生態(tài)環(huán)境,2004,13(3)：382-384.

[20] 劉如運(yùn).幾種常用抑菌試驗(yàn)方法的評價(jià)及比較[J].現(xiàn)代企業(yè)教育,2013(14):341-342.

[21] 朱朝陽,胡仁火,孔瓊,等.無患子粗提液抑菌殺菌作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(34)：12081-12082,12086.

[22] 趙志敏,南艷平,唐青濤,等.無患子總皂苷的體外抑菌及抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(4)：799-801.