血紅素加氧酶1在間歇性低氧大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的影響

王媛媛 曹 建* 萬建華

（1 南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西 南昌 330009；2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，江西 南昌 330009；3 景德鎮(zhèn)市中醫(yī)院麻醉科，江西 南昌 330009）

在心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。氧自由基和鈣超載是導(dǎo)致再灌注損傷的重要原因，但并不是唯一因素。其他因素還包括有血小板介導(dǎo)的損傷，腎素-血管緊張素系統(tǒng)和補體的激活等[1-3]。如何減輕MIRI，開發(fā)研究心肌缺血再灌注的多靶點治療對于防治缺血性心臟病和臨床心臟病介入性治療的具有重大價值和意義。有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性暴露于適當(dāng)?shù)脱醐h(huán)境可激發(fā)機體的適應(yīng)機制，進(jìn)而產(chǎn)生有利的影響[4]。間歇性低氧適應(yīng)具有明顯的心臟保護(hù)作用，可減輕應(yīng)激、缺血對心肌的損傷。但有關(guān)間歇性低氧心肌保護(hù)的具體機制研究甚少。本實驗擬在研究HO-1在間歇性低氧狀態(tài)下對心肌缺血再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑：本實驗研究經(jīng)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審查通過，許可證號為SCXK（贛）2009-0001。取8～10周左右健康清潔級SD大鼠54只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由南昌大學(xué)動物實驗中心提供，所有動物均分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。全蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)品（普利萊公司）；兔抗小鼠HO-1抗體購自Santa Cruz生物科技公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組及模型建立：將實驗動物按體質(zhì)量隨機分為3組：分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、間歇性低氧-缺血再灌注組。制作間歇性低氧模型[5]，將大鼠暴露在每日4次的低氧循環(huán)（每次接受2 min 6%～8%低氧，3 min氧和處理，循環(huán)5次），處理14 d，含氧量正常的假手術(shù)組作為對照組。假手術(shù)組（n=18），絲線穿過冠狀動脈左室支但不結(jié)扎，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；缺血再灌注對照組（n=18），參照趙秀梅墊扎球囊法[6]制作大鼠缺血再灌注模型，間歇性低氧+缺血再灌注組（n=18），建立間歇性低氧動物模型后，再制作缺血再灌注模型。

1.3 大鼠左心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)測定：所有大鼠在外科處理后8周后進(jìn)行超聲心動圖檢查。所有測量均由同一觀察者行雙盲法測量，所有測量結(jié)果均連續(xù)測3次取平均值。將超聲心動圖基礎(chǔ)參考值由假手術(shù)組測得，小鼠用異氟烷（2%in oxygen）行全麻，采用12 MHz探頭進(jìn)行超聲心動圖檢查。二維心室圖可從四個腔室和胸骨旁長軸和短軸定位獲得。左心室舒張期末容積（LVEDV）和收縮期末容積（LVESV）通過Modified Simpson Rule測量，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%。

1.4 Western blot法檢測HO-1蛋白表達(dá)：制模結(jié)束，處死手術(shù)處理后的存活大鼠。采用Western blot方法測定HO-1蛋白，提取心肌組織，采用考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量。蛋白變性后，將含有20 μg蛋白的樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉，用特異性CHOP抗體孵育，4 ℃過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后用增強化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影液檢測底物表達(dá)，結(jié)果經(jīng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀拍照。用Scion Image 4.03軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值的比值，作為目的蛋白的相對表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用。采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間差異的檢驗，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)：假手術(shù)組、缺血再灌注組、間歇性低氧+缺血再灌注組大鼠在外科處理后8周后通過超聲心動圖測量LVEDV、LVESV、LVEF，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠左室收縮期末容積、舒張期末積體積增加，左室射血分?jǐn)?shù)下降。間歇性低氧處理后，左室收縮期末容積、舒張期末積體積增加，左室射血分?jǐn)?shù)增加，心功能改善。各實驗組LVEDV、LVESV、LVEF與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各實驗組左心室收縮期末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)（±s，n＝18）

表1 各實驗組左心室收縮期末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)（±s，n＝18）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05

組別 LVEDV(μL) LVESV(μL) LVEF(%)假手術(shù)組 426±3.2 182±4.1 57±3.9 I/R組 782±1.6* 547±3.5%* 29±1.6*IH+I/R組 518±4.7# 392±2.8# 46±5.3#

2.3 各實驗組心肌組織HO-1蛋白表達(dá)：通過Western blot法檢測各實驗組HO-1蛋白水平，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組HO-1蛋白蛋白表達(dá)降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，間歇性低氧處理后，間歇性低氧-缺血再灌注組HO-1蛋白表達(dá)明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），提示間歇性低氧促進(jìn)了Nfr2蛋白表達(dá)增加。見表2。

表2 各實驗組HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=16）

表2 各實驗組HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=16）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) HO-1假手術(shù)組 18 0.392±3.176缺血再灌注組 18 0.217±1.326*間歇性低氧-缺血再灌注組 18 0.982±4.538#

注：A（假手術(shù)組），B（缺血再灌注組），C（間歇性低氧+缺血再灌注組）

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)等各種治療缺血性心臟病方法的廣泛開展，MIRI也越來越常見，表現(xiàn)為再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化及血管無復(fù)流等現(xiàn)象[7]。如何防治心肌缺血/再灌注損傷，重新恢復(fù)心肌細(xì)胞的功能已成為目前心肌保護(hù)的研究熱點之一。目前有研究表明間歇性低氧適應(yīng)，類似缺血預(yù)適應(yīng)和長期高原低氧適應(yīng)，具有明顯的心臟保護(hù)作用，表現(xiàn)為增強心肌對缺血/再灌注損傷的耐受性、抗細(xì)胞凋亡、限制心肌梗死面積和形態(tài)學(xué)改變及促進(jìn)缺血/再灌注心臟舒縮功能的恢復(fù)[8]，但具體機制目前尚不明確。

在缺血再灌注損傷中，低氧是HO-1的強誘導(dǎo)因素。HO-1作為一種新型的心肌保護(hù)因子通過催化血紅素降解，其產(chǎn)物的抗炎、抗氧化、抗凋亡和血管舒張等作用在心血管疾病中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[9-11]。HO-1是血紅素氧合酶（HO）的同工酶之一，可被多種刺激因素如：缺血再灌注、熱休克、重金屬和低氧等誘導(dǎo)表達(dá)升高。近年來一些研究結(jié)果顯示，NO對血紅素分子具有親和力，都能激活鳥苷酸環(huán)化酶，調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生舒張血管的作用。HO-1蛋白能通過催化血紅素降解代謝產(chǎn)物，其代謝產(chǎn)物具有的抗凋亡抗炎性反應(yīng)外。除此之外，在體內(nèi)和體外均發(fā)現(xiàn)HO-1的表達(dá)能抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長，同時發(fā)現(xiàn)HO-1作為單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）的下游產(chǎn)物，通過抑制心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，能減輕內(nèi)皮素及AngⅡ所致的心血管重構(gòu)。從而達(dá)到抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，并通過抑制心肌肥大，延緩心室重構(gòu)的提高轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子蛋白表達(dá)，而通過轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子信號通路調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激，提高谷胱甘肽等抗氧化因子表達(dá).這些研究都明顯涉及到對血管損傷后重建的關(guān)鍵[12-14]，在許多疾病中起著重要的保護(hù)作用，但相關(guān)作用的機制還不完全清楚。

本實驗建立間歇性低氧模型及缺血再灌注模型，探討HO-1在間歇性低氧對心肌缺血再灌注的影響。通過監(jiān)測各組大鼠心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧處理后，左室舒張末期容積及收縮末期容積明顯下降，射血分?jǐn)?shù)提高，心功能得到改善。于此同時，通過Western-Blot檢測，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧處理后HO-1蛋白表達(dá)升高。表達(dá)增高的HO-1蛋白通過抑制心肌肥大及代謝產(chǎn)物抗凋亡抗炎性反應(yīng)的作用延緩大鼠心肌重構(gòu)，改善心功能，從而在大鼠心肌缺血再灌注損傷中起到保護(hù)作用，其具體機制有待進(jìn)一步研究。

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