甘蔗磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因ScSEC14響應(yīng)干旱和鹽脅迫

毛花英 劉 峰 蘇煒華 黃 寧 凌 輝 張 旭 王文舉 李聰娜 湯翰臣 蘇亞春 闕友雄

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甘蔗磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因響應(yīng)干旱和鹽脅迫

毛花英 劉 峰 蘇煒華 黃 寧 凌 輝 張 旭 王文舉 李聰娜 湯翰臣 蘇亞春 闕友雄*

福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室 / 國家甘蔗工程技術(shù)研究中心, 福建福州 350002

Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 廣泛存在于真核生物細胞中, 參與肌醇磷酸代謝、膜運輸、極性生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫等多種重要的生命過程。甘蔗中響應(yīng)干旱和鹽脅迫的Sec14-like基因尚未見報道。本研究從甘蔗受黑穗病脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得一條基因序列, 并利用RT-PCR技術(shù)克隆得到甘蔗基因cDNA全長序列, 命名為(GenBank登錄號為MG571103)。生物信息學(xué)分析顯示,基因全長1617 bp, 包含一個1008 bp的完整開放閱讀框, 編碼335個氨基酸; ScSEC14為不穩(wěn)定的親水性蛋白, 不存在信號肽; 蛋白二級結(jié)構(gòu)元件多為α-螺旋, 具有典型的SEC14結(jié)構(gòu)域和CRAL_TRIO_N結(jié)構(gòu)域。此外, 系統(tǒng)進化樹分析揭示, 該蛋白屬于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亞家族。亞細胞定位結(jié)果表明, ScSEC14蛋白主要定位于細胞膜。實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),基因在甘蔗中組成型表達, 在蔗皮中的表達量最低, 蔗葉中的表達量最高, 約為蔗皮的4.9倍; 該基因在PEG、NaCl、CaCl2和水楊酸(SA)脅迫下的表達量均上調(diào)。因此, 甘蔗基因可能參與Ca2+和SA介導(dǎo)的抗逆信號通路, 積極響應(yīng)逆境脅迫, 尤其調(diào)節(jié)了干旱和高鹽環(huán)境下的抗逆性。

甘蔗; Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白;; 干旱; 鹽脅迫

磷酸肌醇是磷脂酰肌醇及其磷酸衍生物的總稱, 是一類由磷脂酸與肌醇結(jié)合的脂質(zhì)。磷酸肌醇由一分子的甘油和一分子磷酸結(jié)合而成, 并可以通過磷酸化或去磷酸化獲得到多種不同衍生物[1,2]。目前, 植物中發(fā)現(xiàn)的磷酸肌醇主要包括磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate, PtdIns3P)、磷脂酰肌醇-4-磷酸(phosphatidylinositol-4-phosphate, PtdIns4P)、磷脂酰肌醇-5-磷酸(phosphatidylinositol- 5-phosphate, PtdIns5P)、磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸(phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate, PtdIns (3,5) P2)和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5- bisphosphate, PtdIns (4,5) P2)[1]。這些植物磷酸肌醇在細胞內(nèi)特定位置合成, 并被轉(zhuǎn)運到特定的位置發(fā)揮功能, 其功能包括: 維持細胞結(jié)構(gòu)、控制膜流動、調(diào)節(jié)膜物質(zhì)的轉(zhuǎn)運及調(diào)控離子通道和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3]。

磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白(phosphatidylinositol transfer protein, PITP)是真核生物中普遍存在的一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白[4]。根據(jù)物種來源, 磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白可被分為哺乳動物和昆蟲等多細胞動物的PITP及植物和真菌的PITP兩大類[5]。其中植物與真菌PITP的序列同源性高, 但除PITP結(jié)構(gòu)域外, C端還包含其他的結(jié)構(gòu)域, 如GOLD-domain和Nodulin- domain[1]。根據(jù)C端結(jié)構(gòu)域的不同, 植物PITP又可以分為三類, 一是只含有磷脂轉(zhuǎn)移功能域的PITP, 如大豆中發(fā)現(xiàn)的Ssh1p和Ssh2p, 該類蛋白主要參與滲透調(diào)節(jié)[6]; 二是C端具有GOLD-domain的PITP, 該類蛋白主要參與細胞分裂和囊泡運輸, 如擬南芥AtPATL蛋白[7]和意大利青瓜CpPATL1蛋白[8]; 三是C端具有Nodulin-domain的PITP, 該類蛋白主要與細胞的極性生長有關(guān), 如擬南芥AtSFH蛋白[9]。前人研究顯示, 在真核生物細胞內(nèi), 該蛋白能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)真核生物細胞內(nèi)膜系統(tǒng)間磷脂的轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)磷脂信號的傳遞、調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應(yīng)植物逆境脅迫等功能[5,10]。該基因在不同作物中響應(yīng)鹽脅迫、干旱、低溫等均有相關(guān)報道。Kiba等[11-12]在本氏煙中鑒定了一個, 該基因在脂質(zhì)介導(dǎo)的信號途徑中參與植物的免疫應(yīng)答, 隨后又發(fā)現(xiàn)煙草SEC14磷脂轉(zhuǎn)運蛋白可以通過茉莉酸依賴的防御信號途徑來調(diào)控植物對假單胞菌的抗性。Kielbowicz- Matuk等[13]報道了抗旱大麥中一個基因, 在種子形成與萌發(fā)的特定發(fā)育階段以及不同滲透脅迫下, 其轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平均上調(diào)表達。蘇世超等[14]在普通小麥中克隆了一個基因, 該基因在小麥孕穗期的不同組織中組成型表達, 并受鹽、脫落酸、干旱及低溫脅迫的誘導(dǎo)。王曉宇等[15]在玉米中分離鑒定了一個基因, 該基因在4℃、鹽脅迫、ABA處理時上調(diào)表達, 穩(wěn)定表達該基因則能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對冷脅迫的耐受性。Kearns等[6]和Monks等[16]報道了2個大豆磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白Ssh1p和Ssh2p參與滲透脅迫下植物的應(yīng)答, 隨后又報道了細胞高滲壓力下Ssh1p蛋白通過激活蛋白激酶SPK1和SPK2使其快速磷酸化。

甘蔗(spp)是一種重要的糖料作物, 蔗糖占全世界食糖的60%以上, 占我國的90%以上[17]。我國甘蔗主要種植在鹽堿地和旱地[18]。研究表明, 在甘蔗生長發(fā)育過程中, 干旱脅迫和高鹽環(huán)境對其萌芽、分蘗、伸長生長、葉片擴展和成熟等進程具有重要的影響, 最終造成蔗莖產(chǎn)量的減少和蔗糖分的降低[19-20]。近年來, 從甘蔗克隆出一些與逆境脅迫有關(guān)的基因。例如, 郭晉隆等[21]報道了甘蔗基因, 其參與了甘蔗對干旱、鹽和氧化應(yīng)激反應(yīng); 蘇亞春等[22-23]報道了2種應(yīng)激相關(guān)基因, 即和, 以及從甘蔗中分離的新型應(yīng)激誘導(dǎo)基因, 含有該基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株對干旱、鹽和氧化脅迫具有較高的耐受性; 陳云等[24]報道了一個甘蔗非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白ScNsLTP, 該基因?qū)m應(yīng)干旱和低溫環(huán)境發(fā)揮重要作用。

從基因工程角度看, 一旦挖掘鑒定到控制某種優(yōu)良性狀的主效基因, 我們就有可能通過遺傳轉(zhuǎn)化途徑將其用于改良甘蔗品種的目標性狀[25]。迄今為止,基因僅在幾種作物中被報道[15,26-27], 國內(nèi)外均未見在甘蔗中的研究報道。本研究擬以甘蔗受黑穗病脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中基因序列作為探針, 電子克隆的全長cDNA序列; 利用RT-PCR技術(shù)擴增驗證基因序列的正確性; 并采用實時熒光定量PCR (reverse transcript-qPCR, RT-qPCR)等方法分析該基因在根、側(cè)芽、蔗皮、蔗髓、葉中表達的特異性及其在不同外源脅迫(salicylic acid、CaCl2、PEG、NaCl、CuCl2和CdCl2)下的表達特性。希望能為進一步深入理解基因在甘蔗中的功能表達和作用機制奠定一定基礎(chǔ), 并為甘蔗抗逆性狀的基因工程改良提供具有潛在育種利用價值的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及主要試劑

供試甘蔗材料品種ROC22由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室提供。試劑主要為PrimeScript RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 中國大連)、TRIzol Reagent (Invitrogen, USA)、Gel Extracti on Kit (TIANGEN, 中國北京)、SYBRGreen PCR Master Mix Kit (Roche, USA)。

1.2 材料處理和RNA提取

從田間選取生長健壯、長勢相似的植株, 砍成單芽莖段, 用流動清水浸泡24 h, 于高溫高壓滅菌營養(yǎng)土中催芽(16 h/8 h, 光/暗, 28℃), 待4~6葉時取長勢一致的蔗苗用于組培苗的誘導(dǎo), 而后將組培甘蔗幼苗移出并在溫室內(nèi)開放水培一周。設(shè)置對照組和試驗組, 生物學(xué)重復(fù)為3次。試驗組以5 mmol L–1水楊酸(SA: 3、6和12 h)、50 μmol L–1氯化鈣(CaCl2: 3、6和12 h)、25.0% PEG (模擬干旱: 6、12和24 h)、250 mmol L–1氯化鈉(NaCl: 6、12和24 h)、500 mmol L–1氯化銅(CuCl2: 12、24和48 h)、500 mmol L–1氯化鉻(CdCl2: 12、24和48 h)水溶液培養(yǎng), 以0 h未處理的蔗苗為對照。以上所有甘蔗材料取樣后被立即投入液氮并保存于–80℃冰箱至RNA提取。采用TRIzol法提取所有樣品的總RNA, 包括用于甘蔗基因RT-PCR擴增的蔗苗, 用于組織特異性表達分析的甘蔗根、側(cè)芽、蔗皮、蔗髓和葉片組織, 以及用于SA、CaCl2、PEG、NaCl、CuCl2和CdCl26種外源脅迫處理材料。

表1 實時熒光定量材料處理

1.4 甘蔗ScSEC14基因的RT-PCR擴增及序列測定

使用Prime-Script RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA作為RT-PCR擴增模板。應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計甘蔗基因的RT-PCR擴增引物(表2)。PCR擴增體系總體積為25 μL, 含10×Exbuffer 2.5 μL、10 mmol L–1dNTPs 2 μL、20 μmol L–1上下游引物各1.0 μL、Ex酶0.125 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 17.375 μL。PCR程序為95℃預(yù)變性4 min; 95℃變性30 s, 65℃(每個循環(huán)降0.5℃)退火30 s, 72℃延伸1 min 30 s, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min。先將擴增產(chǎn)物純化回收, 然后將回收產(chǎn)物連接到pMD-19T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中, 于含有氨芐青霉素的LB平板上進行陽性克隆篩選并挑取單菌落鑒定, 隨后送上海鉑尚生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序, 并通過DNAMAN軟件比對測序結(jié)果的正確性。

1.5 甘蔗ScSEC14基因序列的生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPASy中的Protparam tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測基因的理化性質(zhì)及其編碼的蛋白的一級結(jié)構(gòu)、親疏水性等; 利用Prabi (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)、ProtFun (http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)、SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)和TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對其二級結(jié)構(gòu)、功能特性、信號肽、和跨膜特性進行預(yù)測分析; 用SWISSMODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線預(yù)測工具預(yù)測分析蛋白三級結(jié)構(gòu); 通過NCBI中的CDD (conserved domain database)數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域; 用Blastp在線工具查找甘蔗同源氨基酸序列, 并使用DNAMAN 7.0軟件多重比對同源氨基酸序列, 使用MEGA 6.0軟件ML (maximum likelihood,LG+G)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表2 ScSEC14基因克隆與表達所用引物

1.6 甘蔗ScSEC14基因的亞細胞定位分析

采用雙酶切方法將基因構(gòu)建到亞細胞定位載體pCAMBIA 2300-GFP上, 然后將篩選好的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株。在含50 μg mL–1卡那霉素和35 μg mL–1利福平的LB液體培養(yǎng)基上, 用含200 μmol L–1乙酰丁香酮的MS空白培養(yǎng)基, 將菌液濃度調(diào)整至OD600=0.8, 然后選擇5~8片葉齡、長勢一致的本氏煙進行葉片注射, 對照組為空載pCAMBIA 2300-GFP。注射完在28℃下光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng), 2 d后, 顯微鏡觀察亞細胞定位結(jié)果。

1.7 甘蔗ScSEC14基因原核表達分析

運用Gateway構(gòu)載體方法將基因構(gòu)到原核表達載體pEZY19中得到重組菌- pEZY19, 將陽性重組菌株、空白菌株BL21和空載BL21-pEZY19菌液, 分別加至20 mL LB液體培養(yǎng)基中, 于37℃下200 r min–1振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6后, 加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1.0 mmol L–1, 在28℃下200 r min–1搖床內(nèi)進行蛋白誘導(dǎo), 分別于0、1.5、1、2、4、6、8 h取樣。將上述樣品在4℃下8000 r min–1離心10 min收集菌體, 去除上清液后, 加入30 μL 2×蛋白上樣緩沖液, 混勻后于100℃水浴5 min進行裂解, 各取10 μL上清液用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測, 經(jīng)考馬斯亮藍染色和成像分析。

1.8 甘蔗ScSEC14基因表達的RT-qPCR分析

參照Prime-Script RT Reagent Kit操作說明書, 將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA得到模板。采用NCBI引物在線設(shè)計工具Primer designing tool (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計基因和內(nèi)參基因(和)[28]的定量PCR引物(表2)。RT-qPCR體系(20 μL)含SYBRGreen Primix Ex(2×) 10 μL、10 μmol L–1上下游引物各1 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 7 μL。擴增程序為50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 45個循環(huán); 增加熔解曲線; 反應(yīng)時設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。在ABI PRISM7500 Real-time PCR System進行實時熒光定量PCR分析, 實驗結(jié)束后導(dǎo)出Microsoft Excel工作表, 采用2–ΔΔCt算法[29]分析RT-qPCR試驗結(jié)果, 計算3次重復(fù)數(shù)據(jù)的標準誤后繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ScSEC14基因序列的獲得

應(yīng)用電子克隆技術(shù)獲得甘蔗磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因的cDNA全長序列, 并根據(jù)該序列設(shè)計特異性引物, 經(jīng)過RT-PCR擴增、膠回收、連接轉(zhuǎn)化、菌液PCR鑒定和測序獲得約1008 bp的單一條帶(圖1)。序列比對表明, 測序序列與電子克隆序列同源性高達99.40%, 驗證了RT-PCR擴增產(chǎn)物的正確性, 將該基因命名為, 其GenBank登錄號為MG571103?；虻暮怂嵝蛄屑捌渫茖?dǎo)的氨基酸序列如圖2。

圖1甘蔗ScSEC14基因的RT-PCR擴增

M: DNA marker, D2000 bp; 1:目的條帶。

M: DNA marker, D2000 bp; 1: Target fragment.

圖2 甘蔗ScSEC14基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列(*終止密碼子)

方框部分為特異性引物在基因序列中的位置。

The sequence fragment complementary to primer is highlighted in the box.

2.2 甘蔗ScSEC14基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 甘蔗ScSEC14蛋白信號肽、疏水性/親水性的預(yù)測和分析 甘蔗ScSEC14蛋白氨基酸殘基的加權(quán)平均值較小, 為0.101 (<0.5), 推測該蛋白不存在信號肽。即甘蔗ScSEC14蛋白為非分泌蛋白, 在細胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運。從圖3可以看出, 第93位具有最高分值, 為1.633, 疏水性最強; 第215位具有最低分值, 為–2.544, 親水性最強。分值大于0的氨基酸數(shù)為112個, 分值小于0的氨基酸數(shù)為223個, 推測甘蔗ScSEC14蛋白是一種親水蛋白。

圖3 甘蔗ScSEC14蛋白氨基酸疏水性/親水性預(yù)測

2.2.2 甘蔗基因編碼蛋白的一級和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 甘蔗基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示, 該蛋白分子式為C1698H2684N460O500S17, 分子量為38 087.79, 編碼了335個氨基酸, 其等電點(pI)為8.6, 不穩(wěn)定系數(shù)為42.31, 數(shù)值大于40表明該蛋白不穩(wěn)定, 推測為不穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示, 甘蔗ScSEC14蛋白中α-螺旋所占的比例最高, 為43.28%, 延伸鏈所占比例最低, 為15.52%, 無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占41.19% (表3)。

2.2.3 甘蔗ScSEC14蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用SWISSMODEL軟件預(yù)測甘蔗ScSEC14的三級結(jié)構(gòu)(圖4), 由圖4中可以看出, 其結(jié)構(gòu)主要以螺旋和無規(guī)則卷曲為主。比較甘蔗、高粱、玉米、小米和水稻的SEC14蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖, 結(jié)果如圖4所示: 甘蔗ScSEC14蛋白與高粱、玉米、小米和水稻的SEC14蛋白相似度較高, 其中甘蔗與高粱的SEC14蛋白的相似度最高。

2.2.4 甘蔗ScSEC14蛋白的功能預(yù)測和保守結(jié)構(gòu)域分析 Profun 2.2 Server網(wǎng)站預(yù)測分析顯示, 甘蔗ScSEC14蛋白的主要功能與氨基酸生物合成(優(yōu)勢比Odd: 5.878)和輔酶因子生物合成(優(yōu)勢比Odd: 2.893)相關(guān), 其次也可能是翻譯(優(yōu)勢比Odd: 2.818)。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示, 甘蔗ScSEC14蛋白隸屬的家族為SEC14 superfamily, N端包含一個CRAL_ TRIO_N結(jié)構(gòu)域(圖5)。

圖4 甘蔗、高粱、玉米、粟和水稻SEC14蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

表3 甘蔗ScSEC14蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

2.2.5 甘蔗ScSEC14蛋白的氨基酸序列同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析 通過NCBI中的Blastp程序?qū)Ω收峒捌渌锓NSEC14蛋白的氨基酸序列進行同源性分析。結(jié)果顯示, ScSEC14蛋白與高粱(|XP_002459926.1|)、玉米(|NP_ 001136689.1|)、粟(|XP_004956364.1|)、水稻(|XP_006660469.1|)、二穗短柄草(|XP_003576972.1|)、粗山羊草亞種(subsp|XP_ 020197696.1|)、大麥(subsp.|BAK00848.1|)、油棕(|XP_010942585.1|)和海棗(|XP_008797755.1|)中SEC14蛋白的氨基酸序列相似性分別為95%、93%、90%、84%、81%、81%、80%、71%和69% (圖6-A)。本研究中克隆得到的基因編碼蛋白與其他物種的SEC14蛋白具有較高的同源性。將甘蔗ScSEC14與擬南芥、大豆等植物的PITP基因[11]進行系統(tǒng)進化樹分析(圖6-B), 可知植物Sec14-like蛋白主要分為4組: SSH (soybean Sec14 homolog group)、UCSH (uncharacterized SEC14p homolog group)、SFH (Sec14 homolog group)和PATL (patellin group), 其中甘蔗ScSEC14屬于Sec14-like蛋白家族的SSH亞家族, 其結(jié)構(gòu)域中只包含1個N端SEC14結(jié)構(gòu)域(圖6-C)。

圖5 甘蔗ScSEC14蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

(圖6)

(圖6)

A: ScSEC14 蛋白與其他物種的SEC14 蛋白的氨基酸序列比對; B: ScSEC14 蛋白與其他物種SEC14 蛋白的系統(tǒng)進化樹分析; C: ScSEC14 蛋白與其他物種SEC14 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析。

A: Amino acid sequence alignment of the ScSEC14 protein with SEC14 proteins of other species; B: Phylogenetic tree analysis of ScSEC14 protein and SEC14 protein from other species; C: Domain analysis of ScSEC14 protein and SEC14 proteins of other species.

圖7 甘蔗ScSEC14蛋白在煙草葉片中的亞細胞定位

紅色箭頭代表細胞核; 白色箭頭代表細胞膜; 藍色箭頭代表細胞質(zhì)。

Red arrow represents nucleus; white arrow represents plasma membrane; blue arrow represents cytoplasm.

2.3 甘蔗ScSEC14蛋白的亞細胞定位

運用DAPI核染色的方法, 采用明場、綠色熒光、藍色熒光及綠色熒光和藍色熒光疊加這4個視野拍攝ScSEC14蛋白的亞細胞定位圖片。從圖7中可以看出, 對照組在細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)中均有定位, ScSEC14蛋白在細胞膜和細胞核中均有定位, 但在細胞核中的表達較弱, 因此ScSEC14蛋白主要定位于細胞膜。

2.4 甘蔗ScSEC14基因的原核表達實驗

在獲得基因全長cDNA的基礎(chǔ)上, 將其克隆至原核表達載體pEZY19中, 構(gòu)建了重組表達載體pEZY19-, 表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE驗證, 獲得與預(yù)期相符的38 kDa左右的重組蛋白, 表明目的蛋白在大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)中得到成功表達(圖8)。

圖8 pEZY19-ScSEC14和pEZY19(+)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

1: marker; 2: 空菌誘導(dǎo)0 h; 3: 空菌誘導(dǎo)8 h; 4: 空載誘導(dǎo)0 h; 5: 空載誘導(dǎo)8 h; 6~12: 重組菌誘導(dǎo)0、1.5、1、2、4、6、8 h; 白色箭頭代表被誘導(dǎo)的目標蛋白。

1: marker; 2: empty bacteria induced for 0 h; 3: empty bacteria induced for 8 h; 4: empty vector induced for 0 h; 5: empty vector induced for 8 h; 6–12: recombinant bacteria induced for 0, 1.5, 1, 2, 4, 6, 8 h; white arrow represents the target protein induced.

2.5 甘蔗ScSEC14基因的組織特異性表達分析

組織特異性表達的分析結(jié)果顯示, 甘蔗14基因在ROC22中組成型表達, 即在植株的根、側(cè)芽、蔗皮、蔗髓、葉中均有表達。其中在葉中的表達量最高, 約為蔗皮的4.9倍, 其次是在根中的表達量, 約為蔗皮的2.0倍, 在蔗皮中的表達量則最低(圖9), 推測該基因的表達可能與葉片的水分運輸、蒸騰作用相關(guān)[36]。

圖9 甘蔗ScSEC14基因在不同組織中的表達

誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

2.4 甘蔗ScSEC14基因在不同外源脅迫下的表達特性分析

基因在NaCl、SA、PEG、CaCl2脅迫下表達量均上調(diào), 其中在NaCl脅迫下12 h的表達量最高, 約為對照的4.7倍, 同樣在PEG脅迫下12 h的表達量最高, 約為對照的5.5倍(圖10-A); SA脅迫下6 h達到最高, 約為對照的2.4倍, 在CaCl2脅迫下12 h達到最高, 約為對照的2.3倍(圖10-B); 在CuCl2和CdCl2脅迫下的表達量先上調(diào)后下調(diào), 且都在12 h處理時的表達量最高, CuCl2約為對照的1.6倍, CdCl2約為對照的1.1倍(圖10-C)。

3 討論

磷酸肌醇在細胞中發(fā)揮著重要的作用[1]。前人研究表明, Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白是一個信號集成器(signal integrators), 在時間和空間上連接了脂質(zhì)代謝和磷酸肌醇信號, 并參與細胞內(nèi)肌醇磷酸代謝、膜運輸、極性生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫等多種重要的生命過程[1,4]。

本研究以課題組前期甘蔗受黑穗病脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中作為探針, 結(jié)合電子克隆和RT-PCR擴增驗證獲得一條具有完整開放讀碼框的甘蔗基因cDNA全長序列。蛋白與高粱、玉米的同源性較高, 分別為95%和93%, 說明基因編碼的蛋白在不同物種間具有較高的保守性。ScSEC14屬于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亞家族, 其功能主要與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)[1,11]。生物信息學(xué)分析顯示, 甘蔗ScSEC14蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白, 這與羅明武等[30]對巴西橡膠樹磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白基因的分析的結(jié)果相同。此外, 該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋, 這與蘇世超等[14]獲得的小麥SEC14和Kie?bowiczmatuk等[13]獲得的大麥SEC14蛋白的二級結(jié)構(gòu)特征相符。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果顯示, 甘蔗ScSEC14與高粱SEC14蛋白的差異較小, 而與玉米、水稻、小米的SEC14蛋白差異較大, 其原因可能是甘蔗與高粱的親緣關(guān)系較近而與其他物種的親緣關(guān)系較遠。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示, 甘蔗ScSEC14 蛋白的N端具有一個高等植物特有的CRAL_ TRIO_N結(jié)構(gòu)域和一個典型的SEC14結(jié)構(gòu)域。CRAL_TRIO_N結(jié)構(gòu)域通常存在于植物中, 被稱為脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域, SEC14結(jié)構(gòu)域則在細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝、膜運輸?shù)确矫姘l(fā)揮重要作用[26,31], 這2個結(jié)構(gòu)域的存在對預(yù)測甘蔗ScSEC14蛋白的功能具有一定的參考價值。

圖10 甘蔗ScSEC14基因在不同外源脅迫下的表達特性

誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

Error bars represent the standard error of each treating group (= 3).

磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白最核心的基礎(chǔ)功能是轉(zhuǎn)運在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER)上合成的磷脂酰肌醇或磷脂酰肌醇衍生物[32]。亞細胞定位實驗結(jié)果顯示, ScSEC14在細胞核與細胞膜均有定位, 但主要定位于細胞膜, 這與其在質(zhì)膜間轉(zhuǎn)運物質(zhì)的功能相符[32]。目前, 與ScSEC14屬于同一亞家族的擬南芥Atsec14-1、Atsec14-5和大豆Ssh1p, 尚無亞細胞定位的文獻報道。但是, 莫萍麗[33]在研究2個擬南芥花中特異表達的Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白AtSFH3和AtSFH12 (與ScSEC14親緣關(guān)系較近的另一亞家族)時發(fā)現(xiàn), AtSFH3定位在細胞膜, AtSFH12則定位于細胞核與細胞膜上。

干旱、高鹽等逆境在不同程度上影響植物體內(nèi)的水分狀況, 從而嚴重影響作物產(chǎn)量及品質(zhì)[34], 是植物面臨的主要非生物脅迫。蘇世超等[14]在研究普通小麥基因時發(fā)現(xiàn), 該基因在高鹽脅迫下的響應(yīng)程度較明顯, 可能參與鹽依賴抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究中甘蔗基因的RT-qPCR表達分析結(jié)果顯示, 在NaCl和PEG下, 該基因的表達量均上調(diào), 且上調(diào)幅度較大, 推測該基因在植物抗逆過程中積極響應(yīng)干旱和鹽脅迫。近來研究表明, 水楊酸不僅在植物對多種病原體的脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用, 還在非生物脅迫誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起重要作用[35]。本研究中,在水楊酸(SA)脅迫處理下的表達量上調(diào), 推測該基因參與了水楊酸(SA)介導(dǎo)的抗逆信號途徑。有研究報道, 在磷酸肌醇代謝PITP-PLC途徑中, 磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白通過結(jié)合磷脂酰肌醇將其轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜, 該過程會產(chǎn)生第二信使IP3和DAG, 其中IP3釋放到細胞質(zhì)中與胞內(nèi)Ca2+結(jié)合, 激活多種依賴Ca2+的生理生化反應(yīng)[2,36]。本研究中基因在CaCl2脅迫下的表達量上調(diào), 一定程度上說明該基因參與了甘蔗細胞內(nèi)Ca2+信號途徑。當重金屬含量超過某一臨界值時, 會破壞植物生物膜系統(tǒng), 對植物產(chǎn)生一定的毒害作用, 輕則使植物體內(nèi)的代謝過程紊亂, 重則導(dǎo)致植物死亡[37]。本研究中甘蔗基因在CuCl2、CdCl2處理下的表達量在12 h上調(diào), 24 h和48 h下調(diào), 說明在Cu2+和Cd2+脅迫初期, 細胞內(nèi)Cu2+和Cd2+濃度的增加促使磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白將磷脂酰肌醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜以降低細胞內(nèi)離子濃度, 維持細胞穩(wěn)態(tài)[38], 但隨著脅迫時間的延長, 植物體受到毒害作用, 磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白功能受阻,基因表達量也隨之下降。

4 結(jié)論

從甘蔗中克隆到一個典型的Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因(GenBank登錄號為MG571103), 其全長1617 bp, 包含一個1008 bp的完整開放閱讀框, 編碼335個氨基酸。ScSEC14蛋白隸屬于Sec14-like 蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亞家族。ScSEC14蛋白主要定位于細胞膜。在NaCl、PEG、SA、CaCl2以及重金屬Cu2+和Cd2+脅迫誘導(dǎo)下,基因的表達均有不同程度的響應(yīng), 特別是在干旱和高鹽脅迫下響應(yīng)程度較明顯, 因此推測該基因積極響應(yīng)干旱和鹽脅迫。該基因在蔗皮中的表達量最少, 在葉中的表達量最高, 其功能可能與葉片的水分運輸和蒸騰作用相關(guān)。

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A Sugarcane Phosphatidylinositol Transfer Protein GeneResponds to Drought and Salt Stresses

MAO Hua-Ying, LIU Feng, SU Wei-Hua, HUANG Ning, LING Hui, ZHANG Xu, WANG Wen-Ju, LI Cong-Na, TANG Han-Chen, SU Ya-Chun, and QUE You-Xiong*

Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University / Sugarcane Research & Development Center, China Agricultural Technology System, Fuzhou 350002, Fujian, China

Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins are present in all eukaryotic genomes and involved in a variety of biological activities, such as metabolism of inositol phosphate, membrane transportation, polar growth, signal transduction and stress responses. The responses of Sec14-like gene to drought and salt stresses have not been reported in sugarcane. In this study, agene sequence was obtained in the sugarcane transcription database infected by, and the full length cDNA sequence of a sugarcanegene was obtained by RT-PCR technology and named as(GenBank accession number: MG571103). Bioinformatics analysis showed a full length of 1617 bp ingene containing a complete open reading frame of 1008 bp and encoding 335 amino acid residues. ScSEC14 is an unstable hydrophilic protein with no signal peptide. The secondary structure of ScSEC14 protein is mostly α-helices, with a typical SEC14 domain and a CRAL_TRIO_N domain. Phylogenetic tree analysis showed that ScSEC14 belonged to SSH (soybean Sec14 homolog group) subfamily of Sec14-like protein family. Subcellular localization experiment showed that ScSEC14 protein was mainly localized in the plasma membrane. Real-time quantitative PCR analysis showed thatgene was constitutively expressed in sugarcane, with the lowest expression level in skin, and the highest in leaf, which was 4.9 times of that in skin. The expression ofgene was up-regulated under the stresses of PEG, NaCl, CaCl2and salicylic acid (SA). We speculate thatplays an important role in response to drought and salt stresses, and may be involved in the stress response signaling pathway mediated by Ca2+and SA.

sugarcane; Sec14-like phosphatidylinositol transfer protein;; drought; salt stress

2017-12-10;

2018-03-15;

2018-03-19.

10.3724/SP.J.1006.2018.00824

闕友雄, E-mail: queyouxiong@126.com

E-mail: 1297415212@qq.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31671752), 福建省杰出青年基金項目(2015J06006)和國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-17)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31671752), the Natural Science Foundation of Fujian Pro-vince for Distinguished Young Scholars (2015J06006), and the China Agriculture Research System (CARS-17).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180317.1633.002.html