玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢相關miRNA的研究

王琪月 孟淑君 張 柯 張戰(zhàn)輝 湯繼華 丁 冬,*

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玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢相關miRNA的研究

王琪月1孟淑君1張 柯2張戰(zhàn)輝1湯繼華1丁 冬1,*

1河南農業(yè)大學農學院/ 省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室, 河南鄭州 450002;2河南省農業(yè)科學院, 河南鄭州 450002

雜種優(yōu)勢已廣泛應用于玉米育種, 在提高玉米產量、品質以及增強抗逆性等方面起到了重要的作用, 然而雜種優(yōu)勢的分子機制尚不清楚。植物miRNA主要在轉錄和轉錄后水平調節(jié)基因的表達。為闡明miRNA是否及如何對玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢產生影響, 本研究對玉米雜交種鄭單958及其親本自交系(昌7-2和鄭58)進行了高通量miRNA測序和降解組測序。取玉米雌穗花序分生組織(IM)發(fā)育為成對小穗分生組織(SPM), 進而產生小穗分生組織(SM), 及小花分生組織(FM)將3個不同時期的雌穗樣品用于miRNA建庫測序, 鑒定出16個miRNA家族中的81個保守miRNA為非加性表達, 認為是與雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢形成相關的miRNA; 3個階段中分別檢測到80.30%、56.06%和48.10%的非加性表達的miRNA被顯性或超顯性抑制。鑒定出8種新的miRNA, 屬于7個miRNA家族。通過雌穗降解組測序, 發(fā)現(xiàn)在鄭單958及其親本自交系中共同檢測到的miRNA靶向42個基因的82個轉錄本。根據(jù)測序結果構建了miRNA參與玉米雌穗雜種優(yōu)勢的模型, 并推測在雌穗發(fā)育早期階段雜交種雌穗的miRNA的普遍抑制導致其靶基因上調表達, 隨著發(fā)育進程miRNA逐步解除抑制, 帶來其靶基因表達量的逐步減少, 這種miRNA與其靶基因的拮抗關系也許與玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢形成有關。

雌穗發(fā)育; 雜種優(yōu)勢; miRNA; 降解組測序; 玉米

雜種優(yōu)勢即F1雜交種產量、品質、抗逆等性狀均優(yōu)于其純合親本系的生物學現(xiàn)象[1]。目前, 雜種優(yōu)勢雖然已經成功運用于作物育種并提高了作物產量, 但其分子機制尚未完全解析。根據(jù)等位基因互作的原理, 前人提出顯性、擬顯性和超顯性假說[2]3種主要理論來解釋雜種優(yōu)勢遺傳基礎。近年來, 隨著高通量技術的發(fā)展, 非等位基因間互作同樣被認為是產生雜種優(yōu)勢的原因, 并據(jù)此提出了上位性[3]和基因調控網絡假說[4]。

玉米作為世界上重要的禾谷類作物, 不僅為人類和動物提供食材, 還可以作為工業(yè)原料用于生產乙醇。由于玉米在表型、等位基因[5]、轉錄[6]和翻譯[7]水平上豐富的變異, 以及有已測序的參考基因組信息, 可作為探索雜種優(yōu)勢遺傳機制的理想模式作物[5]。

miRNA是長度為18~25 nt的非編碼內源小分子RNA, 在轉錄后水平起到關鍵的基因表達調控作用[8]。植物miRNA與其靶向mRNA完全或近乎完全地互補配對, 會引起靶向mRNA斷裂, 導致基因沉默[9]。miRNA調控參與多種生物學進程, 如器官分化[10]、葉生長[11]、性別決定[12]、逆境脅迫[13]和雌雄不育[14]。在H99×B73雜交種與其親本自交系授粉10 d后的籽粒樣品中, 發(fā)現(xiàn)miR167被過度誘導, 表明miRNA可能參與玉米雜種優(yōu)勢相關基因的調控[15]。Ding等[16]基于高通量測序數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)保守的玉米miRNA在玉米雜交種胚中較其親本自交系豐度低, 提出在雜交種中miRNA的普遍抑制可能是產生玉米胚萌發(fā)雜種優(yōu)勢的原因之一。

高通量測序技術(high throughput sequencing)可對DNA或RNA分子精確測序, 從而能夠對某一物種的基因組進行全貌分析。高通量測序技術已經廣泛應用于基因組學、表觀基因組學以及功能基因組學研究的許多方面[17]。降解組測序是一種新的鑒定miRNA靶基因的實驗方法。它綜合了高通量測序技術與生物信息學分析兩者的優(yōu)勢, 對植物體中由miRNA介導而產生的mRNA降解片段深度測序分析, 從而高效、準確地篩選出與之相對應的靶基因。降解組測序已成功應用于鑒定細胞質雄性不育(CMS)[18], 棉花體細胞胚發(fā)生[19]和玉米胚性愈傷組織[20]miRNA的靶基因等研究中。Zhang等[21]報道基于自交系B73的miRNA文庫深度測序, 認為miRNA測序和降解組測序結合的方法是識別miRNA靶標的可靠方法。

玉米雌穗分化可分為4個階段。從營養(yǎng)生長轉向生殖生長時, 位于植株頂端的頂端分生組織(SAM)轉化成花序分生組織(IM); 隨著IM的膨大和伸長, 形成多行排列整齊的分生組織, 即成對小穗分生組織(SPM); 每一個SPM進而分化出兩個短分枝的小穗分生組織(SM); 每個SM分化出兩個小花分生組織(FM)[22]。玉米雌穗產量相關性狀, 包括穗行數(shù)、穗長和粒重都具有雜種優(yōu)勢, 第3階段決定穗粒行數(shù)和穗長。玉米花序形態(tài)與籽粒產量之間有明顯聯(lián)系。研究推測關鍵調控基因在表達時間、表達位置、表達水平的變化可以解釋玉米和其他禾本科作物的結構和遺傳差異[23]。Chuck等[12]研究表明編碼玉米miRNA156的通過靶向AP2結構域轉錄因子來決定玉米性別分化和分生組織細胞分裂能力。玉米雌穗發(fā)育中的SPM至SM階段對miRNA的深度測序表明, miRNA普遍參與玉米雌穗的發(fā)育[24], 然而miRNA影響雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢的機制仍不清楚。

本研究對中國大面積種植的玉米雜交種鄭單958及其親本自交系昌7-2和鄭58進行高通量深度測序, 以期獲得與雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢相關的miRNA。結果表明, miRNA參與雌穗發(fā)育, 尤其是雌穗細胞分化早期階段發(fā)育的雜種優(yōu)勢形成。通過降解組測序鑒定了miRNA的靶基因, 并結合miRNA和降解組測序構建了玉米雌穗發(fā)育中雜種優(yōu)勢可能的miRNA調控途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料和RNA提取

玉米雜交種鄭單958及其親本自交系材料(昌7-2和鄭58)各40株種植于河南農業(yè)大學農業(yè)實驗基地(河南鄭州, 34°48' N, 113°42' E)。年平均氣溫14.3℃, 年降水量640.9 mm。待葉齡指數(shù)達到50%以上(6~8片展開葉), 剝開第一穗位雌穗于顯微鏡下觀察其外部形態(tài)。IM至SPM時期的顯著特點是可以看到生長錐長度大于寬度且在其基部出現(xiàn)了突起; SPM至SM時期顯著特點是雌穗中部開始出現(xiàn)小穗裂片, 由小穗裂片分化成兩個成對的小穗, 呈兩列突起狀; FM時期顯著特點是小穗突起上會出現(xiàn)兩個突起的小花。分別取IM至SPM時期和SPM至SM時期, 以及FM形成時期3個階段的雌穗樣品以液氮速凍備用。采用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取雌穗材料總RNA, 用于miRNA文庫構建, 并分別取20 μg總RNA用于高通量測序(BGI, 北京)。

1.2 小RNA文庫的構建和數(shù)據(jù)分析

使用TRIzol試劑盒(Invitrogen, USA)提取雌穗總RNA, 使用15%PAGE膠分離不同片段大小的RNA, 取16~32 nt之間的條帶, 回收小RNA; 對這些小RNA加上3'和5'接頭; 反轉錄成cDNA, 經過幾輪PCR擴增; 用PAGE膠對RT-PCR產物切膠回收, 溶于EB 溶液, 完成文庫構建, 質檢后用于高通量測序。對llumina測序所得的原始數(shù)據(jù), 去除接頭及低質量的測序片段獲得高質量的測序片段之后, 除去長度小于16 nt的片段, 再比對基因組, 去除tRNA、rRNA等小分子量RNA。將初級分析得到的測序片段分類注釋, 可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息, 排除所有注釋后剩下的小RNA, 于miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.miRBase.org/, Version 21;包括172個成熟的miRNA)中比對, 當測序片段與數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA序列錯配小于2時, 認為該測序片段為保守的miRNA。另一方面, 利用軟件Mireap (http://sourceforge.net/projects/mireap/)預測新的miRNA。判定一個小RNA是否為候選miRNA時要符合以下5個條件: (1)前體可形成莖環(huán)結構; (2) miRNA序列完全包含于莖環(huán)結構的一個臂; (3)發(fā)夾的另一臂上預測的成熟miRNA序列與其互補miRNA*序列之間不超過6個錯配; (4) miRNA或miRNA*序列中不存在環(huán)或中斷; (5)莖環(huán)前體最小自由能指數(shù)MFEI>0.85[25]。

1.3 雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢的miRNA表達模式

為了判斷樣品之間miRNA的表達量差異, 將每個樣品里的所有miRNA都進行歸一化處理, 處理后如果某一miRNA在4個時期內的表達量都小于1RPM 則不予考慮[16], 將玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關miRNA歸類為6組[16]: (1) + +: 超高親表達, 雜交種的表達量顯著高于兩個親本自交系且雜交種的表達量和其親本中高表達量親本的差異超過10%; (2) +: 高親表達, 雜交種的表達量高于其親本, 雜交種的表達量和其親本中高表達量親本的差異低于10%; (3) +-: 加性表達, 雜交種的表達量介于2個親本表達量之間, 且雜交種的表達量和其親本的表達量中值的差異低于10%; (4)-: 低親表達, 雜交種的表達量低于其親本, 雜交種的表達量和其親本中低表達量親本的差異低于10%; (5)--: 超低的親本表達, 雜交種的表達量顯著低于其親本, 雜交種的表達量和其親本中低表達量親本的差異超過10%; (6)顯示出和前幾種不同的表達模式(用“D”表示)與中親值差異大于10%。

1.4 降解組文庫的構建和數(shù)據(jù)分析

從每種材料取約20 μg總RNA混合樣品用來制備降解組文庫, RIN>7.0時, 采用Bioanalyzer 2100和RNA6000 Nano Lab Chip Kit (Agilent, CA, USA)分析總RNA質量和純度。參考并改進前人報道的實驗流程進行建庫測序[26]: (1)使用約150 ng RNA加5￠接頭, 然后將帶接頭的oligo(dT)將單鏈反轉錄成cDNA, 并采用生物素化標記的隨機引物退火; (2)通過生物素化隨機引物捕獲Strapavidin RNA片段; (3) 5￠-端與僅含有5￠單磷酸酯的RNA結合; (4)逆轉錄和PCR; (5)僅對代表原始RNA的5￠端插入片段的前36個核苷酸測序。然后按照LC-BIO (中國杭州)提供的方案, 在IlluminaHiseq 2500上進行單端測序(36 bp)。通過Fisher精確檢驗、卡方2×2檢驗、卡方×檢驗、標準檢驗和ANOVA方差分析測定降解組數(shù)據(jù)水平差異, 設定每個檢驗的顯著性閾值為0.01和0.05。

1.5 miRNA莖環(huán)法反轉錄質量檢測

對雜交種鄭單958及其親本自交系昌7-2和鄭58的發(fā)育中雌穗的miRNA的表達量進行分析, 以驗證miRNA測序結果。選用8個保守miRNA引物對提取到的RNA采用莖環(huán)法[27]進行反轉錄, 對靶基因進行反轉錄, 用于RT-qPCR反應, 內參為玉米基因, 采用2–ΔΔCt方法計算相對表達量, RT-qPCR引物列于表1中, 設有3次技術重復。

2 結果與分析

2.1 玉米miRNA的深度測序

通過對雜交種鄭單958及其親本自交系雌穗的小分子量RNA文庫進行高通量測序, 來鑒定影響雌穗雜種優(yōu)勢的miRNA。對9個樣本測序, 得到175 214 241個原始讀數(shù)。每個樣本平均為19 468 249個讀數(shù), 范圍為17 410 285到22 869 631。平均每個樣品為18 672 474個讀數(shù), 范圍為16 909 865至22 244 845。測序所得的小 RNA幾乎涵蓋所有 RNA, 包括tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、外顯子和內含子降解片段等, 通過去除接頭及低質量的測序片段獲得高質量的測序片段, 共有138 600 762個候選miRNA讀數(shù), 每個樣本平均為15 400 084個, 范圍為11 902 891至19 538 721。在9個樣本中, 將候選miRNA與玉米B73基因組(RefGen_v3)比對, 21 nt的RNA最豐富, 占總量61.60%, 19 nt的RNA次之, 占總量15.51%, 這些miRNA代表玉米雌穗成熟miRNA的典型長度(圖1)。

2.2 玉米雌穗發(fā)育時期與雜種優(yōu)勢相關miRNA的分類

在雜交種和其親本中檢測到3個發(fā)育階段分別有100、95和94個保守miRNA, 大多數(shù)miRNA在雜交種和其親本自交系的雌穗發(fā)育過程中是非加性表達的。在IM至SPM階段, SPM至SM階段和FM階段分別有83、80和87個差異表達的miRNA, 3個發(fā)育階段均檢測到的81個miRNA。將入選的81個玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關miRNA分為5種類型: 3個雌穗發(fā)育階段中分別有3、18和38個miRNA為超高親表達(+ +); 10、11和2個miRNA為顯性高親表達(+); 15、15和3個miRNA為加性表達(+-); 0、9和2個miRNA在親本系中為顯性低親表達(-); 53、28和36個miRNA為超低親表達(--), 如表2所示。

表1 玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關miRNA和其靶基因的檢測引物序列

#代表降解組測序未檢測到玉米miR168a/b的靶基因, 因此此靶基因為預測獲得。

#represent the target genes of zma-miR168a/b were not found in the degradome sequencing data, so they were predicted.

圖1 miRNA的長度分布

表2 共檢測到的保守miRNA的表達趨勢

(續(xù)表2)

IM: 雌穗花序分生組織; SPM: 成對小穗分生組織; SM: 小穗分生組織; FM: 小花分生組織。

IM: inflorescence meristem; SPM: spikelet pair meristem; SM: spikelet meristem; FM: flower meristem.

2.3 通過降解組測序鑒定靶基因

通過降解組測序來鑒定玉米雌穗樣品的miRNA的靶基因。由于miRNA產生和目標mRNA降解之間可能存在延遲, 因此對所有3種材料的3個階段的混合樣品進行測序, 共檢測出42個基因的82個轉錄本。miRNA-mRNA切割位點如表3所示, 對這些目標基因進一步進行GO功能注釋分析, 表明雌穗中miRNA的目標基因側重于編碼轉錄因子(31/42)(表3)。

表3 降解組測序檢測到的玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關miRNA的靶基因

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.4 新miRNA預測和其靶基因

在自交系昌7-2、鄭58和雜交種鄭單958雌穗發(fā)育的3個階段分別發(fā)現(xiàn)了216、174和203個miRNA與保守的miRNA不匹配, 但可形成如pre-miRNA莖環(huán)發(fā)卡結構的側翼序列, 它們可作為候選的miRNA。在9個樣品中共檢測到27個候選的miRNA, 通過計算這27個miRNA的MFEI進一步提高預測精度, 其中有8個MFEI大于0.85, 這8個miRNA最有可能是新的玉米 miRNA。根據(jù)成熟miRNA序列, 將8種預測的新的miRNA分類為7個家族, 其序列、染色體位置和MFEIs如表4所示, 前體miRNA莖環(huán)結構見圖2 (由MatLAB bio-tool創(chuàng)建)。這些新預測的miRNA都由莖環(huán)結構的前體剪切加工而來, 前體序列長度介于98~328 bp之間, 莖環(huán)前體最小自由能指數(shù)MFEI> 0.85, 成熟序列的長度為21 bp, 且對靶基因的抑制方式為直接剪切。有趣的是, 發(fā)現(xiàn)miR-7a和miR-7b具有相同的成熟miRNA序列, 并呈簇狀分布在玉米第1染色體, 該特征與一些保守的成簇分布miRNA前體特征一致[28]。通過在線軟件psRNA Target預測這8個新發(fā)現(xiàn)的玉米miRNA的靶基因, 共預測到49個miRNA的靶基因(表5), 基因預測時候參數(shù)全部使用默認值, 搜索的靶位點文庫為玉米的全部Unigene序列。對這些靶基因進行GO功能注釋分析(圖3), 除了功能未知的基因外, 多為編碼信號轉導因子(6/49)的基因, 其次是編碼應激反應蛋白的基因(4/49)。

表4 新的miRNA及其特性

IM: 雌穗花序分生組織; SPM: 成對小穗分生組織; SM: 小穗分生組織; FM: 小花分生組織; MFEI: 自由能指數(shù)。

IM: inflorescence meristem; SPM: spikelet pair meristem; SM: spikelet meristem; FM: flower meristem; MFEI: minimal free energy index.

圖2 新的玉米miRNA的前體莖環(huán)結構

miR-n7a和miR-n7b享有共同的pre-miRNA和成熟miRNA序列, 它們的特征被各自的pre-miRNA的基因組位置所區(qū)分, 藍色代表已配對, 紅色表示未配對, 綠色代表成熟的新的miRNA。

miR-n7a and miR-n7b share the same pre-miRNA and mature miRNA sequences, the character that distinct them from each other is the genome location of each pre-miRNAs. The blue residues are paired, red ones are unpaired, and green strings show the mature novel miRNAs.

2.5 RT-PCR檢測保守miRNA和其靶基因的表達量

采用莖環(huán)法實時熒光定量的方法檢測miR159、miR160、miR167、miR168、miR169、miR172a、miR172e和miR390這8個miRNA的表達趨勢(圖4)。使用方差分析來分析miRNA和其對應靶基因的RT-PCR的數(shù)據(jù)表明, 所選miRNA的相對表達量與深度測序數(shù)據(jù)相一致。根據(jù)miRNA的表達趨勢(表2), miR390在雌穗發(fā)育過程中, 表達量是逐漸增加的, miR172a、miR172e在SPM至SM期大量表達, 這與我們的定量結果(圖4)是一致的。

圖3 新miRNA靶基因功能分類

圖中數(shù)字表示基因個數(shù)。

The numbers show the number (s) of target genes.

3 討論

自交系與其相應的F1雜交之間的表型差異與基因本身的功能、基因表達的時間、數(shù)量有關[29-30]。水稻、小麥和玉米在雜交種中比其親本中檢測到的表達下調的miRNA要多于表達上調的miRNA, 表明非加性表達的miRNA, 尤其是下調的miRNA可能與作物的雜種優(yōu)勢形成有關[31-32,16]。本研究發(fā)現(xiàn), 雜交種鄭單958在早期的IM至SPM的發(fā)育階段中有很多miRNA被下調, 說明miRNA的負調控可能在玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢中起著重要作用。此外, miRNA家族的非加性表達模式與玉米雌穗發(fā)育的雜種優(yōu)勢形成有關, 且在雌穗發(fā)育的過程中這種表達模式是變化的。在此研究基礎上構建了miRNA對玉米雌穗發(fā)育的雜種優(yōu)勢的調控網絡見圖5。

圖5 miRNA對玉米雌穗發(fā)育的雜種優(yōu)勢的調控網絡

miRNA通過剪切靶mRNA或抑制蛋白質翻譯來調節(jié)基因的表達。大多數(shù)miRNA的靶基因是轉錄因子(TFs), 如(miR156)[33]、(miR167)[34]、(miR164)[35]和(miR396)[36], 其作用是調節(jié)植物發(fā)育。玉米雌穗發(fā)育中miRNA的非加性表達模式是變化的, 雜交種雌穗早期發(fā)育階段的miRNA靶基因較高水平的表達導致下游基因轉錄和翻譯水平提高; 后期發(fā)育階段中miRNA表達量的逐漸上升, 導致其靶基因抑制加強, 這可能是玉米雌穗發(fā)育性狀雜種優(yōu)勢的形成原因之一。

前期研究顯示,是miRNA-RISC的負反饋調節(jié)子, 是擬南芥ARGONAUTE家族的唯一成員, 參與miRNA定向的mRNA切割過程。AGO1體內穩(wěn)態(tài)和AGO1對miR168的轉錄后穩(wěn)定需要miR168和基因的共轉錄調節(jié)。miR168和其靶基因共調控miRNA的負反饋調控途徑[37], 因為是miRNA通路的一個關鍵調節(jié)因子, 在雌穗發(fā)育早期的的mRNA表達變異可能導致miRNA活動改變。玉米miR168的表達可能抑制, 并以此影響多個其他miRNA的靶基因, 因此雜交種與親代自交系相比, 其功能性基因種類更有可能多樣化, 并且表達更加豐富。

玉米卷葉基因是擬南芥基因的同系物。ath-miR166介導的HD-Zip調節(jié)側生器官背腹軸極性的建立和維持[38], 除了參與調節(jié)葉片極性[39],干旱和植物激素[40-41]等各種脅迫條件也能誘導HD-Zip家族的產生。測序表明高豐度的miRNA166成員在雌穗發(fā)育過程中被逐漸誘導, 在IM至SPM期降低, SPM至SM期逐步提高, 并在FM階段被顯著誘導。結合miR166成員的高拷貝數(shù)和其逐漸誘導模式, 表明HD-Zip轉錄因子(或許是)可能在雜合玉米雌穗發(fā)育中被逐漸抑制, 導致對植物激素的敏感性降低。

研究顯示miRNA159通過編碼和來調控種子休眠和發(fā)芽,和是水稻[42]和擬南芥中ABA響應的正向調控因子。ABA是植物成熟和發(fā)育的關鍵調節(jié)因子, 已被證明與許多植物的生物和非生物脅迫反應有關[43]。ABA可以誘導miR159的表達, 降低和的量, 進而降低ABA的敏感性[44], 因此可通過誘導miR159建立ABA體內平衡。本研究中miR159在雜合體中被逐漸誘導, IM至SPM期被顯著抑制, SPM至SM期被抑制, FM期被顯著誘導。雜交種鄭單958雌穗發(fā)育中的miR159的表達水平逐漸提高, 可能通過影響其靶mRNA而降低ABA敏感性, 表明在玉米雌穗期可能發(fā)生ABA調控過程。

玉米不定小穗基因I ()是玉米miR172e的靶基因, 在SPM至SM期大量表達[11-12]。本研究中的miR172e表達與其他miR172家族成員有所不同, 特別是SPM至SM期間存在較低的拷貝數(shù), 表明miRNA穩(wěn)態(tài)是決定玉米雌穗發(fā)育的主要因素, 而且同一個基因家族的不同成員也可能發(fā)揮不同的功能。

除miR172外, miRNA家族的其他成員同樣具有顯著的差異表達水平(表6)。如miR164e與miR164家族的其他成員相比, 其表達量差異超過100倍, miR156k表達量差異超過60倍。同一家族差異表達的miRNA成員不僅具有不同前體, 而且成熟miRNA也很少具有差異序列, 例如zma-miR164e和zma-miR164a-d僅在最后2個(AG/CA)核苷酸處存在差異。通過比較相同miRNA家族不同成員的豐度, 發(fā)現(xiàn)有關特定miRNA在不同發(fā)育階段中發(fā)揮的作用, 以此區(qū)分家族中各個成員的調節(jié)模式。

4 結論

構建了miRNA通過其靶基因參與雌穗雜種優(yōu)勢形成的可能模式, 并推測miRNA可能在玉米雌穗發(fā)育階段通過非加性表達參與雌穗雜種優(yōu)勢性狀的建立, 雌穗發(fā)育早期階段miRNA的普遍抑制及隨后時期的逐漸解除抑制可能是雌穗雜種優(yōu)勢形成的原因。

表6 測序獲得的表達量數(shù)據(jù)

(續(xù)表6)

(續(xù)表6)

(續(xù)表6)

[1] Shull G F. Beginnings of the Heterosis Concept. Ames, IA: Iowa State College Press, 1952. pp 14–48

[2] Jones D F. Dominance of linked factors as a means of accounting for heterosis.1917, 2: 466–479

[3] Powers L. Relative yields of inbred lines and F1-hybrids of tomato., 1945, 106: 247–268

[4] Mendoza L, Thieffry D, Alvarez-Buylla E R. Genetic control of flower morphogenesis in: alogical analysis., 1999, 15: 593–606

[5] Schnable P S, Ware D, Fulton R S, Stein J C, Wei F S, Pasternak S, Liang C, Zhang J, Fulton L, Graves T A, Minx P, Reily A D, Courtney L, Kruchowski S S, Tomlinson C. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics., 2009, 326: 1112–1115

[6] Stupar R M, Springer N M.-transcripioanl variation in maize inbred lines B73 and Mo17 leads to additive expression patterns in the F1hybrid., 2006, 173: 2199–2210

[7] Hoecker N, Lamkemeyer T, Sarholz B, Paschold A, Fladerer C, Madlung J, Wurster K, Stahl M, Piepho H P, Nordheim A, Hochholdinger F. Analysis of nonadditive protein accumu-lation in young primary roots of a maize (L.) F1-hybrid compared to its parental inbred lines., 2008, 8: 3882–3894

[8] Jones-Rhoades M W, Bartel D P, Bartel B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants., 2006, 57: 19–53

[9] Brodersen P, Sakvarelidze-Achard L, Bruun-Rasmussen M, Dunoyer P, Yamamotoet Y, Sieburth L, Voinnet O. Widespread translational inhibition by plant miRNAs and siRNAs., 2008, 320: 1185–1190

[10] Bowman J L. Class III HD‐Zip gene regulation, the golden fleece of ARGONAUTE activity?, 2004, 26: 938–942

[11] Chuck G, Cigan A M, Saeteurn K, Hake S. The heterochronic maize mutant Corngrass 1 results from overexpression of a tandem microRNA., 2007, 39: 544–549

[12] Chuck G, Meeley R, Irish E, SakaiH, Hake S. The maize tasselseed4 microRNA controls sex determination and meristem cell fate by targeting Tasselseed6/indeterminate spikelet1., 2007, 39: 1517–1521

[13] Ding D, Zhang L, Wang H, Liu Z, Zhang Z, Zheng Y. Differential expression of miRNAs in response to salt stress in maize roots., 2009, 103: 29–38

[14] Millar A, Gubler F. TheGAMYB-like genes, MYB33 and MYB65, are microRNA-regulated genes that redundantly facilitate anther development., 2005, 17: 705–721

[15] Mica E, Gianfranceschi L, Pè M E. Characterization of five microRNA families in maize., 2006, 57: 2601–2612

[16] Ding D, Wang Y J, Han M S, Fu Z Y, Li W H, Liu Z H, Hu Y M, Tang J H. MicroRNA transcriptomic analysis of heterosis during maize seed germination., 2012, 7: e39578

[17] Elaine R M. Next-generation DNA sequencing methods., 2008, 9: 387–402

[18] Yang J, Liu X, Xu B, Zhao N, Yang X, Zhang M. Identification of miRNAs and their targets using high-throughput sequencing and degradome analysis in cytoplasmic male-sterile and its maintainer fertile lines of., 2013, 14: 9

[19] Yang X, Wang L, Yuan D, Lindsey K, Zhang X. Small RNA and degradome sequencing reveal complex miRNA regulation during cotton somatic embryogenesis., 2013, 64: 1521–1536

[20] Shen Y, Jiang Z, Lu S, Lin H, Gao S, Peng H, Yuan G, Liu L, Zhang Z, Zhao M, Rong T, Pan G. Combined small RNA and degradome sequencing reveals microRNA regulation during immature maize embryo dedifferentiation., 2013, 441: 425–430

[21] Zhang L, Chia J M, Kumari S, Stein J C, Liu Z, Narechania A, Maher C A, Guill K, McMullen M D, Ware D. A genome-wide characterization of microRNA genes in maize., 2009, 5: e1000716

[22] Bennetzen J L, Hake S C. Handbook of Maize: Its Biology. New York: Springer,2009

[23] Kellogg E A. THE GRASSES: a case study in Macroevolution., 2000, 31: 217–238

[24] Ding D, Li W, Han M, Wang Y, Fu Z, Wang B, Tang J. Identification and characterization of maize microRNAs involved in developing ears., 2014, 16: 9–15

[25] Zhang B H, Pan X P, Cannon C H, Cobb G P, Anderson T A. Conservation and divergence of plant microRNA genes., 2006, 46: 243–259

[26] Addo-Quaye C, Miller W, Axtell M J. CleaveLand: a pipeline for using degradome data to find cleaved small RNA targets., 2009, 25: 130–131

[27] Chen C, Ridzon D A, Broomer A J, Zhou Z, Lee D H, Nguyen J T, Barbisin M, Xu N L, Mahuvakar V R, Andersen M R, Lao K Q, Livak K J, Guegler K J. Real-time quntitiention of micro-RNAs by stem loop RT-PCR., 2005, 33: e179

[28] ReinharB J, Weinstein E G, Rhoades M W, Barte B,Barte D P. MicroRNAs in plants., 2002, 16: 1616–1626

[29] Osborn T C, Pires J C, Birchler J A, Auger D L, Chen Z J, Lee H S, Comai L, Madlung A, Doerge R W, Colot V, Martienssen R A. Understanding mechanisms of novel gene expression in polyploids., 2003, 19: 141–147

[30] Song R, Messing J. Gene expression of a gene family in maize based on non-collinear haplotypes., 2003, 100: 9055–9060

[31] He G, Zhu X, Elling A A, Chen L, Wang X, Guo L, Liang M, He H, Zhang H, Chen F, Qi Y, Chen R, Deng X W. Global epigenetic and transcriptional trends among two rice subspecies and their reciprocal hybrids., 2010, 22: 17–33

[32] Yao Y, Guo G, Ni Z, Sunkar R, Du J, Zhu J, Sun Q. Cloning and characterization of microRNAs from wheat (L.)., 2007, 8: R96

[33] Wang J W, Schwab R, Czech B, Mica E, Weigel D. Dual effects of miR156-targetedgenes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size in., 2008, 20: 1231–1243

[34] Gutierrez L, Bussell J D, Pacurar D I, Schwambach J, Pacurar M, Bellini C. Phenotypic plasticity of adventitious rooting inis controlled by complex regulation oftranscripts and microRNA abundance., 2009, 21: 3119–3132

[35] Baker C C, Sieber P, Wellmer F, Meyerowitz E M. The early extramutant uncovers a role for microRNA miR164c in regulating petal number in., 2005, 15: 303–315

[36] Rodriguez R E, Mecchia M A, Debernardi J M, Schommer C, Weigel D, Palatnik J F. Control of cell proliferation inby microRNA miR396., 2010, 137: 103–112

[37] Vaucheret H, Mallory A C, Bartel D P.homeostasis entails coexpression of MIR168 andand preferential stabilization of miR168 by., 2006, 22: 129–136

[38] Williams L, Grigg S P, Xie M, Christensen S, Fletcher J C. Regulation ofshoot apical meristem and lateral organ formation by microRNA miR166g and its AtHD-ZIP target genes., 2005, 132: 3657–3668

[39] Juarez M T, Kui J S, Thomas J, Heller B A, Timmermans M C. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity., 2004, 428: 84–88

[40] Agalou A, Purwantomo S, Overn?s E, Johannesson H, Zhu X, Estiati A, de Kam R J, Engstr?m P, Slamet-Loedin I H, Zhu Z, Wang M, Xiong L, Meijer A H, Ouwerkerk P B. A genome-wide survey ofgenes in rice and analysis of drought- responsive family members., 2008, 66: 87–103

[41] Dai M, Hu Y, Ma Q, Zhao Y, Zhou D X. Functional analysis of rice() gene reveals a negative function in gibberellin responses., 2008, 66: 289–301

[42] Tsuji H, Aya K, Ueguchi-Tanaka M, Shimada Y, Nakazono M. GAMYB controls different sets of genes and is differentially regulated by microRNA in aleurone cells and anthers., 2006, 47: 427–444

[43] Baron K N, Schroeder D F, Stasolla C. Transcriptional response of abscisic acid (ABA) metabolism and transport to cold and heat stress applied at the reproductive stage of development in., 2012, 188: 48–59

[44] Phillips J R, Dalmay T, Bartels D. The role of small RNAs in abiotic stress., 2007, 581: 3592–3597

Investigation of Maize miRNA Involved in Developing-ear Heterosis

WANG Qi-Yue1, MENG Shu-Jun1, ZHANG Ke2, ZHANG Zhan-Hui1, TANG Ji-Hua1, and DING Dong1,*

1College of Agronomy, Henan Agricultural University / Key Laboratory of Wheat and Maize Crops Science, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

Heterosis has been utilized widely in maize breeding; it plays an important role in increasing yield, improving quality and enhancing stresses resistance. However, the molecular mechanism of heterosis is far from clear. MicroRNAs (miRNAs) act as key regulating factors of gene expression in post-transcriptional level. To investigate whether miRNA-dependent gene regulation is responsible for heterosis during maize ear development, we performed an illumine miRNA deep-sequencing on the most widely-planted elite hybrid Zhengdan 958 and its parental inbred lines (Chang 7-2 and Zheng 58) in China. The ear samples at the developmental stages of inflorescence meristem (IM) producing spikelet pair meristems (SPM), resulting in spikelet meristems (SMs), and floral meristems (FM) were collected for RNA library construction. As a result, 81 conserved miRNAs belonging to 16 miRNA families were identified which were non-additively expressed. At the three stages, 80.30%, 56.06%, and 48.10% of these non-additively expressed miRNAs were repressed ever dominantly or over-dominantly. A total of 82 target transcripts from 42 genes of conserved miRNAs among Zhengdan 958 and its parents were detected via whole genome degradome sequencing. Additionally, eight novel maize miRNAs belonging to seven miRNA families were identified using stringent criteria. Global repression of miRNAs in hybrid ears at the early stage might lead to the up-regulated expressing of their target genes. Moreover, the in-step de-repression of given miRNA family members may be the reason of enhanced repression of their target genes. These results revealed, at least in part, the involvement of maize miRNAs in hybrids leads to higher ear developing vigor compared with its parental lines.

ear development; heterosis; miRNA; degradome;L.

2017-09-29;

2018-03-26;

2018-04-18.

10.3724/SP.J.1006.2018.00796

丁冬, E-mail: dingdong0216@163.com

E-mail: 13633857567@163.com

本研究由國家自然科學基金項目(31370033)和國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2012AA10A305)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370033) and the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA10A305).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180416.0843.006.html