藍(lán)莓枝枯病病原菌分離鑒定及孢子萌發(fā)條件研究

路 梅，凌丹燕，馬錫文，郭衛(wèi)東

（1.浙江師范大學(xué)生化學(xué)院，浙江 金華 321004；2.金華市荊龍生物科技有限公司，浙江 金華 321004）

藍(lán)莓（Vacciniumspp.）是一種多年生灌木果樹，在植物分類學(xué)上屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）。其果實(shí)為可食用漿果，風(fēng)味獨(dú)特，具有很高的營養(yǎng)價值。近幾年隨著市場需求量的不斷提高，我國藍(lán)莓種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，栽培地域分布從東北地區(qū)擴(kuò)展到山東、安徽、江浙和廣東［1］等地。

2016年10 月，在浙江省金華市雅畈鎮(zhèn)藍(lán)莓種植基地，種植人員在高叢藍(lán)莓奧尼爾2年生苗中首次發(fā)現(xiàn)整株枯死的現(xiàn)象。觀察發(fā)現(xiàn)，枯死植株初期表現(xiàn)癥狀為上部枝條著生褐色病斑，伴隨病斑的擴(kuò)增，枝梢出現(xiàn)枯萎，后期逐漸導(dǎo)致整株死亡，發(fā)病癥狀與已報道的藍(lán)莓枝枯病相似［2-3］。藍(lán)莓枝枯病是一種世界范圍內(nèi)的真菌病害，危害嚴(yán)重，在歐洲、美洲及亞洲等藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生［4-5］。1939 年 Wilcox［6］首次報道了藍(lán)莓枝枯病的發(fā)生，研究認(rèn)為烏飯樹擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis vacciniiShear）是該病害的致病菌。2008年5月，云南省安寧縣首次發(fā)現(xiàn)國內(nèi)藍(lán)莓枝枯病的危害［7］。迄今為止，除浙江省外，我國主要藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)均有關(guān)于該病害發(fā)生的相關(guān)報道。一直以來，國內(nèi)外對藍(lán)莓枝枯病的研究主要集中在病原菌的分離鑒定方面。長期的研究發(fā)現(xiàn)，病原菌的多樣性是藍(lán)莓枝枯病的顯著特點(diǎn)；而且侵染方式可以是單一病原菌侵染，也可以是多種病原菌混合侵染［8］。不同的病原菌必然在致病性、生物學(xué)特性和抗藥性等方面存在差異。因此，病原菌分類地位的明確是進(jìn)行藍(lán)莓枝枯病相關(guān)研究的首要內(nèi)容。

鑒于藍(lán)莓枝枯病病原菌的復(fù)雜性，明確引起雅畈鎮(zhèn)藍(lán)莓奧尼爾枝枯病的病原菌種類是該病害得到有效防治的關(guān)鍵，也是亟待解決的問題。為此，本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行了病原菌的快速分離鑒定，明確其分類地位；并對外界因素如溫度、pH、光照等對病原菌分生孢子萌發(fā)率的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在浙江金華市雅畈鎮(zhèn)藍(lán)莓實(shí)驗(yàn)基地采集藍(lán)莓枝枯病典型樣本，用于形態(tài)學(xué)研究和病原菌分離；挑選健康的高叢藍(lán)莓奧尼爾2年生苗為病原菌的致病性檢測試材。

1.2 病原菌分離純化

參照常規(guī)組織分離法［9］對病原菌進(jìn)行分離純化，將分離純化后的菌株接種于PDA斜面，25℃、16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)，5 d后置于4℃長期保存。

1.3 病原菌致病性檢測

通過柯赫氏法則（Koch’s postulate）對分離菌株進(jìn)行致病性檢測。選用2年生健康的奧尼爾植株為試材，先將純化培養(yǎng)5 d的病原菌制成菌餅（直徑5 mm），用75%酒精表面消毒枝干接種部位；然后用無菌3號昆蟲針在枝干表面針刺“+”（直徑5 mm、深度0.5 mm），每處接種1個菌餅，每個枝條接種1處，每個植株接種1～2個枝條，共接種3株植株，同時接種空白PDA培養(yǎng)基作為對照。25℃，16 h光照/8 h黑暗保濕培養(yǎng)，每天觀察有無發(fā)病現(xiàn)象。挑選接種后發(fā)病現(xiàn)象顯著的枝條進(jìn)行致病菌的再分離鑒定。

1.4 病原菌的分子鑒定

1.4.1 病原菌rDNA-ITS擴(kuò)增和序列分析 將病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)5 d，用無菌藥勺刮取菌絲，采用改良CTAB法提取基因組DNA［10］。利用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行rDNAITS區(qū)段擴(kuò)增，引物由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。具體反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件均參照李永強(qiáng)等［10］的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)擴(kuò)增出唯一的大小約500 bp的DNA片段后，將未純化產(chǎn)物直接送上海英濰捷基有限公司進(jìn)行測序。

1.4.2 病原菌rDNA-ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將上海英濰捷基有限公司提供的病原菌rDNA-ITS區(qū)段的測序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站。經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)分析后，選取合適的參比菌株，采用MAGA4軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 不同外界條件對分生孢子萌發(fā)的影響

1.5.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響 采用載玻片法進(jìn)行孢子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)［9］。首先，將病原菌接種 PDA 平板，在生化恒溫培養(yǎng)箱中（25℃、16 h光照/8 h黑暗條件下）培養(yǎng)15 d，菌落產(chǎn)生大量分生孢子。用eppendorf 移液器采集孢子，并配置孢子懸浮液（ 1×105～1×106/個/mL），備用。接著，用移液器吸取 200 μL 孢子懸浮液，滴在潔凈的單凹玻片（帆船牌）的凹槽內(nèi)，置于生化恒溫培養(yǎng)箱中不同溫度下（5～35℃，間隔5℃）培養(yǎng)。培養(yǎng)10 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5.2 pH對分生孢子萌發(fā)的影響 以濃度均為1 mol/L的HCl和NaOH溶液為母液，配制pH 3～12共10個梯度的溶液，并按照1.5.1所述方法配制不同酸堿度孢子懸浮液。用eppendorf 移液器將200 μL孢子懸浮液滴在單凹玻片上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)10 h后，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.5.3 光照對分生孢子萌發(fā)的影響 將按照1.5.1方法配制的孢子懸浮液滴在單凹玻片上，放置于全黑暗、全光照（日光燈40 W）、自然條件3種光照條件的培養(yǎng)箱內(nèi)（30℃恒溫），培養(yǎng)10 h后，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.5.4 碳、氮源對分生孢子萌發(fā)的影響 采用麥芽糖、麥芽提取物、葡萄糖和蔗糖等為供試碳源，配制4種濃度為0.01 g/mL的碳源溶液；采用草酸、蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨和硝酸鈉等為供試氮源，配制5種濃度為0.001 g/mL的氮源溶液。按照1.5.1的方法，用上述9種溶液分別配制相應(yīng)的孢子懸浮液；以蒸餾水為對照。按照1.5.2的方法培養(yǎng)并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓枝枯病癥狀觀察

從奧尼爾藍(lán)莓發(fā)病植株上觀察到，發(fā)病初期植株的中上半部枝干著生淺褐色至褐色病斑；中后期逐漸形成環(huán)狀病斑，從而導(dǎo)致上部枝條枝梢枯死，并且擴(kuò)展至下部枝條；后期在枝條上著生黑色小顆粒，即為病原菌分生孢子器（條件適宜，產(chǎn)生分生孢子進(jìn)行病害的再侵染）。枝枯病發(fā)病嚴(yán)重時，枝條營養(yǎng)物質(zhì)及水分正常運(yùn)輸均受到影響，從而導(dǎo)致受害植株整株枯死。

2.2 藍(lán)莓枝枯病病原菌的致病性

從發(fā)病藍(lán)莓植株上分離得到5株疑似病原菌菌株（命名為ZA1～ZA5），將疑似病原菌分別活體接種奧尼爾2年生苗，進(jìn)行致病性檢測。結(jié)果顯示，5種菌株中只有ZA1接種5 d后在接種處產(chǎn)生淺褐色病斑；60 d后接種藍(lán)莓植株出現(xiàn)枯萎癥狀，與藍(lán)莓枝枯病自然發(fā)病癥狀相似，而其他實(shí)驗(yàn)組和對照組中并未見病斑產(chǎn)生或與自然癥狀不一致（圖1，封三）。對接種發(fā)病后的枝條再次進(jìn)行病菌的分離培養(yǎng)，其生長狀態(tài)與接種病菌ZA1一致。因此，根據(jù)柯赫氏法則即可證明分離菌株ZA1為致病菌。

圖1 病原菌致病性檢測

2.3 藍(lán)莓枝枯病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌ZA1置于PDA平板培養(yǎng)，菌落呈圓形，邊緣光滑整齊，具輪紋，7 d左右長滿培養(yǎng)皿（直徑9 cm）；氣生菌絲白色，絮狀或絨狀，旺盛；15 d左右開始產(chǎn)生載孢體，載孢體盤狀，散生，黑褐色（圖2 A，B），并且形成分生孢子。經(jīng)光學(xué)顯微鏡制片觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌ZAI的菌絲細(xì)長并伴有隔膜（圖2C，D）；分生孢子梗無色，呈圓柱形或葫蘆形（圖2D，E）；分生孢子褐色，多呈紡錘形，大小15～25 μm×5 ～10 μm，直或微彎，4個真隔膜將孢子分成5部分，即5個細(xì)胞（5個細(xì)胞中，中間細(xì)胞顏色最深，呈褐色；兩端細(xì)胞無色；其余兩個細(xì)胞顏色較淺，呈淺褐色；細(xì)胞分隔處顏色均有不同程度的加深，且略有縊縮），兩端細(xì)胞均為三角形，頂端細(xì)胞著生2～3根附屬絲，尾部細(xì)胞中生1根附屬絲，所有附屬絲均不分枝（圖2E，F(xiàn)）。

2.4 藍(lán)莓枝枯病病原菌 rDNA-ITS 序列分析

以病原菌ZA1基因組DNA為模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4對核糖體rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過測序分析確定擴(kuò)增片段長度為505 bp。

在GenBank中運(yùn)用BLAST搜索同源序列，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)病原菌ZA1與Pestalotiopsis clavispora（登錄號GQ415344.1）的同源性為100%（圖3）。結(jié)合病原菌的培養(yǎng)形狀和分生孢子的形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)果，在分類學(xué)上藍(lán)莓枝枯病菌ZA1最終被鑒定為棒狀擬盤多毛孢菌（P.clavispora，登錄號KU928245）。該菌歸屬半知菌亞門（Deuteromycotina）、腔孢綱（Coelomycetes）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）。

圖2 擬盤多毛孢菌ZA1在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)

圖3 基于rDNA-ITS序列以及擬盤多毛孢菌屬相似屬構(gòu)建ZA1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 溫度對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，在5～35℃之間，溫度的高低對病原菌ZA1分生孢子的萌發(fā)影響較大。當(dāng)溫度低于15℃時，分生孢子萌發(fā)率較低，在8.64%～22.95 %之間；溫度為30℃時，萌發(fā)率最高，達(dá)到85.48 %；35℃時，萌發(fā)率則略有下降，達(dá)到81.89 %。由此可見，病原菌ZA1分生孢子的最適萌發(fā)溫度為30℃。

圖4 不同溫度對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

2.6 pH對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，在pH 3～12范圍內(nèi)，在pH為5和9時，病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率相對較高，分別為93.17%和96.22%；pH達(dá)到11之后，萌發(fā)率開始明顯下降；pH 12時下降至55.74 %。說明病原菌ZA1分生孢子的萌發(fā)受pH影響相對較小，對懸浮液pH的適應(yīng)性較廣。

圖5 pH值對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

2.7 光照對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的3種光照處理下，分生孢子萌發(fā)率大小為：全光照＞自然光照＞全黑暗。由此可見，光照有利于病原菌ZA1分生孢子的萌發(fā)。

圖6 不同光照對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

2.8 氮源對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

由圖7可知，5種供試氮源懸浮液中分生孢子萌發(fā)率大小順序?yàn)椋毫蛩徜@＞草酸＞蛋白胨＞硝酸鈉＞酵母提取物。其中，在硫酸銨配制的懸浮液中ZA1分生孢子萌發(fā)率最高，為51.40%；在酵母提取物和硝酸鈉配制的懸浮液中萌發(fā)率則較低，分別為31.54%和29.91%。說明硫酸銨比其他4種供試氮源更適合作為外源氮源促進(jìn)病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)。

圖7 不同氮源對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

2.9 碳源對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

圖8 不同碳源對藍(lán)莓枝枯病病原菌ZA1分生孢子萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖8）顯示，5種供試碳源懸浮液中分生孢子萌發(fā)率大小順序?yàn)椋蝴溠刻崛∥铮菊崽牵钧溠刻牵酒咸烟?。其中，在麥芽提取物配制的孢子懸浮液中ZA1孢子萌發(fā)率最高，為58.78%；葡萄糖和麥芽糖為碳源的孢子萌發(fā)率則較低，分別為22.42%和23.70%。說明在供試的4種碳源中，麥芽提取物最適合作為外源碳源促進(jìn)病原菌ZA1分生孢子的萌發(fā)。

3 結(jié)論與討論

擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsisspp.）是重要的植物病原真菌之一，可以引起植株潰瘍病［11］、枯枝病［12］和葉斑?。?3-14］。本研究通過對在田間藍(lán)莓奧尼爾2年生枯死植株的發(fā)病癥狀研究發(fā)現(xiàn)，該病害為枝枯病，病原菌為棒狀擬盤多毛孢菌（P.clavispora）ZA1。藍(lán)莓枝枯病在國內(nèi)遼寧、山東和云南等地均有發(fā)生，典型的癥狀表現(xiàn)為從新梢出現(xiàn)枯萎，逐漸向下干枯，直至整株枯死［2-3］。

關(guān)于藍(lán)莓枝枯病病原菌種類的報道，國內(nèi)外眾說紛紜。到目前為止，已有報道認(rèn)為可以導(dǎo)致藍(lán)莓枝枯病的病原有尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）［15］、球黑孢菌（Nigrospora sphaerica）［16］、棒狀擬盤多毛孢菌（P.clavispora）［11，17］等多種病原真菌。國內(nèi)，岳清華等［2，18］研究發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)導(dǎo)致藍(lán)莓枝枯病的病原菌有兩種，分別為烏飯樹擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis vaccinii）及棒狀擬盤多毛孢（P.clavispora）。徐成楠等［3］研究發(fā)現(xiàn)遼寧地區(qū)藍(lán)莓枝枯病的病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。余磊等［19］則認(rèn)為葡萄座腔菌（B.dothidea）是引起藍(lán)莓潰瘍病的致病菌，導(dǎo)致藍(lán)莓枝枯病發(fā)生的應(yīng)是小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）。2017年最新的國內(nèi)研究報道則認(rèn)為莓帚梗柱孢（Cylindrocladium canadense）［20］是引起湖北藍(lán)莓枝枯病的病原菌。而本研究則再次證明棒狀擬盤多毛孢菌（P.clavispora）可以導(dǎo)致藍(lán)莓枝枯病的發(fā)生［11，17-18］。導(dǎo)致藍(lán)莓枝枯病多種病原菌報道的原因，分析可能有以下幾點(diǎn)：一是藍(lán)莓枝枯病和潰瘍病癥狀難以區(qū)分；二是不同病原菌的復(fù)合侵染；三是不同地區(qū)藍(lán)莓種植品種不同所致。具體原因需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

孢子萌發(fā)標(biāo)志著真菌從休眠狀態(tài)到侵染能力的復(fù)蘇，是其生活史中一個重要階段，也是病害防治的關(guān)鍵。目前對于棒狀擬盤多毛孢菌的報道多集中于病原鑒定，尚未見關(guān)于孢子萌發(fā)條件的研究報道。本研究主要進(jìn)行了對溫度、pH、光照、氮源和碳源等對ZA1孢子萌發(fā)率的影響。研究結(jié)果表明：孢子的萌發(fā)與外界環(huán)境條件密切相關(guān)。ZA1孢子萌發(fā)適宜的溫度為20～35℃，這也說明春末夏初是病害開始侵染再傳播的關(guān)鍵時間；而高溫和低溫，尤其是低溫孢子萌發(fā)率大幅降低，不利于病害的傳播。懸浮液pH值為 3～11時，孢子萌發(fā)率保持在70%～90 %范圍內(nèi)，說明ZA1孢子對酸堿度的適應(yīng)性較廣，這一特點(diǎn)增加了病害的防治難度。光照有利于孢子的萌發(fā)。在不同碳源對孢子萌發(fā)率影響的實(shí)驗(yàn)中，麥芽提取物是麥芽糖、果糖、葡萄糖等多種碳源的混合物，其對ZA1孢子萌發(fā)率的促進(jìn)作用顯著高于單一碳源。說明復(fù)合碳源有助于ZA1孢子的萌發(fā)。

本研究首次報道了浙江省藍(lán)莓枝枯病的發(fā)生及病原菌的分離鑒定，并進(jìn)行了外界因素對分生孢子萌發(fā)影響的研究。藍(lán)莓枝枯病的防治以增強(qiáng)樹勢為主，同時輔以化學(xué)防治［21］。

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