烤煙抗赤星病種質(zhì)資源的篩選

孔德鈞，王志紅，陳麗莉，吳 春，楊春元，韋克蘇，潘文杰，林英超

（貴州省煙草科學(xué)研究院/煙草行業(yè)山地烤煙品質(zhì)與生態(tài)重點實驗室，貴州 貴陽 550081）

煙草赤星病屬于真菌性病害，是我國煙葉生產(chǎn)中的主要病害之一；在環(huán)境條件適宜的情況下，該病害短時間內(nèi)即可大面積發(fā)生流行，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，不利于優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)［1］。因此，烤煙赤星病抗病基礎(chǔ)以及抗赤星病新品種選育工作一直是研究熱點之一。其中，楊志曉等研究了成熟期赤星病抗病品種凈葉黃和感病品種NC89、長脖黃的葉片氮轉(zhuǎn)運差異，結(jié)果表明不同赤星病抗性品種成熟期葉片氮運轉(zhuǎn)具有明顯差異，抗病品種葉片的氮素再利用能力大于感病品種；感病品種以葉片質(zhì)外體氨揮發(fā)形式損失的氮素多于抗病品種［2］。馮瑩分別以煙草赤星病抗病品種凈葉黃、Beinhart 1000-1與感病品種NC82雜交，對赤星病抗性進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明，赤星病的抗性遺傳以主效基因為主，同時受環(huán)境影響較大［3］。楊志曉等研究了不同煙草赤星病脅迫程度對抗煙草赤星病品種凈葉黃和感病品種長脖黃的光合特性和滲透調(diào)節(jié)的影響，證明凈葉黃具有較強(qiáng)的光合作用和滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)能力，是對煙草赤星病脅迫具有較強(qiáng)抗性的生理基礎(chǔ)［4］。張鼎宇比較分析了11個病程相關(guān)（PR）基因及3個轉(zhuǎn)錄因子家族（WRKY，bHLH和AP2/EREBP）的16個基因在Beinhart 1000-1和K326應(yīng)答赤星病病原菌處理過程中的表達(dá)差異，研究發(fā)現(xiàn)，在候選的 11個PR基因中有9個基因在Beinhart 1000-1中表現(xiàn)出對赤星病病原菌更加強(qiáng)烈的敏感性，揭示了二者抗性差異的分子基礎(chǔ)［5］。

當(dāng)前，人們主要通過種植優(yōu)良抗病品種、噴灑化學(xué)藥物、改善種植模式等方法來控制赤星病的發(fā)生與發(fā)展［6-8］。由于化學(xué)防治不可避免地存在煙葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)、造成環(huán)境污染、導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗性和影響烤煙質(zhì)量等問題，因此采用抗病育種獲得優(yōu)質(zhì)、高抗、滿足生產(chǎn)需要的抗病品種是最有效的手段［9-10］。然而，目前可供利用的高抗赤星病種質(zhì)資源較少［11］。其中，凈葉黃是我國抗赤星病育種的主體親本，但凈葉黃的抗性與不易烘烤性狀連鎖，以其為親本育成的品種大多不易烘烤，限制了其進(jìn)一步的利用；雪茄煙野生品種Beinhart 1000-1較難作為親本材料在烤煙育種中利用［11］；而美國抗赤星病育種的主要抗源NC95 和Coker319，因其抗性水平較低，以其為親本材料，國內(nèi)尚沒有赤星病抗性品種育成?？乖从H本的不足，導(dǎo)致我國赤星病抗病育種中存在遺傳背景狹窄、育種效率低的問題。因此，根據(jù)我國生態(tài)條件，充分挖掘利用抗赤星病優(yōu)異種質(zhì)資源，有目標(biāo)的培育抗病、優(yōu)質(zhì)和適產(chǎn)等多種優(yōu)良性狀的核心親本，拓寬赤星病抗病育種中可用親本的遺傳背景，對提升烤煙抗赤星病育種效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為來自國內(nèi)外的390份烤煙種質(zhì)資源，其中貴州省內(nèi)地方種61份，貴州省內(nèi)選育品種90份，國內(nèi)選育品種105份，國外引進(jìn)品種134份。參試種質(zhì)資源全部由貴州省煙草科學(xué)研究院提供。

田間試驗于2017年2～10月在貴州省清鎮(zhèn)市紅楓湖鎮(zhèn)蘆荻哨村（106°32′E，26°56′N）進(jìn)行，海拔1 200 m，屬北亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫14.1℃，無霜期283 d，年日照時數(shù)1 228.2 h，年雨量1 180.9 mm，雨量豐沛、氣候濕潤、雨熱同季、暖濕共節(jié)，試驗期間試驗地有效積溫及降雨量見圖1。試驗地貌屬以山地、丘陵為主的緩丘坡地，地勢較開闊；試驗地土壤為黃壤，土壤肥力均勻，肥力水平中等，前作烤煙，無較重病害史。

圖1 試驗地溫度和降雨量變化

1.2 試驗方法

試驗以田間自然發(fā)病并鑒定抗性的形式進(jìn)行。各試驗材料種植60株，按3行區(qū)種植，行距1.1 m，株距0.55 m，移栽密度16 500株 /hm2。施純氮量為 97.5 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O=1∶1∶2。試驗期間不施用任何防治煙草赤星病的化學(xué)藥劑，于2017 年8月15～18日進(jìn)行一次病害調(diào)查，記載種質(zhì)資源煙草赤星病的發(fā)病率和病情指數(shù)。調(diào)查方法以種質(zhì)資源為單位進(jìn)行調(diào)查。

病情調(diào)查：煙草赤星病調(diào)查及分級標(biāo)準(zhǔn)參照《煙草病蟲害分級與調(diào)查GB/T23222-2008》進(jìn)行。0級：全葉無??；1級：病斑面積占葉片面積的1%以下；3級：病斑面積占葉片面積的2%～5%；5級：病斑面積占葉片面積的6%～10%；7級：病斑面積占葉片面積的11%～20%；9級：病斑面積占葉片面積的21%以上。0～3級為抗?。≧），5～9級為感?。⊿），以最高級為鑒定結(jié)果。

赤星病人工接種鑒定：以赤星病抗性鑒定感病對照品種Speight G-140和感病品種NC82為感病對照，取前期田間抗病性鑒定試驗篩選出的具有赤星病抗性的23份種質(zhì)資源種子播種，待將幼苗移栽至小花盆后煙株長至5～7 葉期時從每株頂部往下選取第3 或第4片完全展開的葉片進(jìn)行苗期離體葉片赤星病抗性鑒定。其中菌液制備參照閆杏杏等［10］的方法進(jìn)行，接種鑒定參照侯爍等［12］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間自然發(fā)病條件下的植株表現(xiàn)

對不同來源的390份烤煙種植資源植株葉片的赤星病發(fā)病表現(xiàn)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表1和圖2（封二）。其中未發(fā)病種質(zhì)資源4份，其植株在整個實驗過程中均未發(fā)病（圖2C，封二）；發(fā)病等級為1的種質(zhì)資源7份，其植株在實驗過程中僅見少許赤星病斑點（圖2A、B、D，封二）。此兩種發(fā)病等級的種質(zhì)資源煙株總體表現(xiàn)良好，葉片整體清秀、干凈。發(fā)病等級為3的種質(zhì)資源12份，雖然植株下部成熟葉片有少面積的赤星病斑，但仍然表現(xiàn)出一定的抗病能力，葉片仍然保持較好完整性，赤星病斑尚沒有破壞葉片整體的烘烤價值。發(fā)病等級為5的種質(zhì)資源149份，其下部成熟葉片赤星病斑點較多，已形成中央為圓心的同心輪紋且出現(xiàn)破碎，葉片尚具有烘烤價值（圖2E，封二）。發(fā)病等級為7的種質(zhì)資源142份，其下部成熟葉片赤星病斑點增多、面積增大，葉片烘烤價值已極大降低（圖2F，封二）。發(fā)病等級為9的種質(zhì)資源66份，其葉片病斑相互愈合形成大的病斑，并破裂脫落，葉片已不具備烘烤價值（圖2G、H，封二）。

圖2 部分種質(zhì)資源田間發(fā)病表現(xiàn)

表1 烤煙赤星病抗性鑒定結(jié)果

2.2 不同來源種質(zhì)資源赤星病抗性比較分析

由表1可知，貴州省內(nèi)地方種鑒定的61份材料中有抗病材料10份（占16.39%），其中未發(fā)病2份（占3.28%）、1級抗性4份（占6.56%）、3級抗性4份（占6.56%）；感病材料51份（占83.61%）。貴州省內(nèi)育成品種鑒定的90份材料中有抗病材料1份（占1.11%），為1級抗性；感病材料89份（占98.89%）。省外引進(jìn)品種鑒定的105份材料中有抗病材料10份（占9.52%），其中未發(fā)病1份（占0.95%）、1級抗性1份（占0.95%）、3級抗性8份（占7.62%）；感病材料95份（占90.48%）。國外引進(jìn)品種鑒定134份材料中有抗病材料2份（占1.49%），其中未發(fā)病1份（占0.75%）、1級抗性1份（占0.75%）；感病材料132份（占98.51%）。

從表1可以看出，所有種質(zhì)資源中抗病材料比例依次為：省內(nèi)地方種（16.39%）＞省外種（9.52%）＞國外引進(jìn)種（1.49%）＞省內(nèi)育成種（1.11%），所有種質(zhì)資源平均病情指數(shù)依次為：省內(nèi)地方種（5.14）＜省外種（5.96）＜省內(nèi)育成種（6.42）＜國外引進(jìn)種（6.75），說明貴州省內(nèi)地方種抗赤星病種質(zhì)資源最豐富，省外引進(jìn)品種次之。而兩者的抗病性變異系數(shù)次序為省內(nèi)地方種（19.92%）＜省外引進(jìn)品種（27.61%），說明貴州省內(nèi)地方種赤星病抗性較集中，而省外引進(jìn)品種抗性較分散。

由表2可知，在赤星病抗性較強(qiáng)的貴州省內(nèi)地方種材料中，抗性最強(qiáng)的是曉豐8號和湄潭-2，在整個試驗過程中均未發(fā)?。黄浯问谴蠓阶粤舴N、YA-2、惠水-1和惠水-2，其抗性等級均為1；黔江1號、福泉-2、福煙6號和YQ-1的抗性等級均為3。具有赤星病抗性的貴州省內(nèi)育成品種有1份，為紫江1號，抗性等級為1。在赤星病抗性較強(qiáng)的省外引進(jìn)種材料中，抗性最強(qiáng)的是凈葉黃，其在整個試驗過程中均未發(fā)?。黄浯问沁|煙8100，其抗性等級均為1；云煙100、云煙110、單育2號、中煙86、大白筋599、許金4號、龍江911和潘園黃等8份種質(zhì)資源的抗性等級均為3。兩份赤星病抗性較強(qiáng)的國外引進(jìn)種材料中，抗性最強(qiáng)的是Coker spedlgred，其在整個試驗過程中均未發(fā)病，其次是Oxford 26，其抗性等級均為1。

2.3 抗病種質(zhì)資源苗期離體葉片赤星病抗性鑒定結(jié)果

從表3可以看出，參試的25份烤煙種質(zhì)資源病斑平均面積差異較大。病斑平均面積最大的為Speight G-140（118.32 mm2），最小的為曉豐8號（3.52 mm2）。根據(jù)病斑平均面積對25份種質(zhì)資源進(jìn)行赤星病抗性劃分可見，感病對照Speight G-140和NC82；黔江一號、大方自留種、YA-2、福煙6號、YQ-1、紫江一號、云煙100、單育2號、中煙86、大白筋599、遼煙8100、凈葉黃和coker spedlgred等13份種質(zhì)資源表現(xiàn)為中度抗??；曉豐8號、湄潭-2、惠水-1、惠水-2、福泉-2、云煙110、許金4號、龍江911、潘園黃和Oxford 26等10份種質(zhì)資源表現(xiàn)為高度抗病。

表2 烤煙赤星病抗病材料抗性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，貴州省內(nèi)地方品種中抗赤星病種質(zhì)資源較為豐富，抗性較強(qiáng)，可以考慮作為抗赤星病育種親本材料的主要來源。以貴州省內(nèi)地方品種作為新的烤煙赤星病抗源，能夠有效拓寬赤星病抗病育種中抗源親本的遺傳基礎(chǔ)，提高烤煙抗赤星病育種的效率。

表3 不同種質(zhì)資源離體葉片赤星病接種病斑面積比較

雖然我國是煙草種質(zhì)資源保存最多的國家［11］，但由于對一些重要性狀（如抗病性等）缺乏深入、系統(tǒng)的研究鑒定，導(dǎo)致對優(yōu)異資源的發(fā)掘利用不足，限制了其在實際育種工作中的應(yīng)用。貴州省內(nèi)的烤煙育種工作者在近年來的烤煙育種工作中主要致力于解決黑脛病、青枯病等根莖性病害，而忽略了在煙葉成熟階段才會暴發(fā)流行的赤星病等葉斑性病害［13-14］，導(dǎo)致貴州省內(nèi)育成品種對赤星病的抗性普遍較低。

煙草赤星病菌為交鏈孢菌，在13～32℃范圍內(nèi)保濕2 d可表現(xiàn)較強(qiáng)致病性［15］。煙區(qū)日平均溫度、日平均相對濕度及降雨量是影響赤星病發(fā)生的重要因素［16］。貴州省清鎮(zhèn)市蘆荻哨村位于紅楓湖西南面，地處雨量中心地帶，且其東、西、北三面被紅楓湖環(huán)繞，形成了年平均相對濕度82%，平均最高氣溫27.1℃的高濕高溫環(huán)境，赤星病、白粉病和氣候斑等烤煙葉斑病害在該煙區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，是篩選上述病害抗病性品種的理想?yún)^(qū)域。本研究對390份不同來源的烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行了赤星病抗性鑒定，結(jié)果表明貴州省內(nèi)地方種抗赤星病資源比例最高（16.39%），高于省內(nèi)育成種（1.11%）、省外引進(jìn)種（9.52%）和國外引進(jìn)種（1.49%）；且抗性最強(qiáng)，未發(fā)病與抗性等級為1的種質(zhì)資源分別占3.28%和6.56%，遠(yuǎn)高于省內(nèi)育成種（0和1.11%）、省外引進(jìn)種（0.95%和0.95%）和國外引進(jìn)種（0.75%和0.75%）。另外，我國先后自美國、日本等國家引進(jìn)了大量優(yōu)質(zhì)烤煙品種，然而在參試的134個國外引進(jìn)品種中只有Coker spedlgred和Oxford 26兩個參試品種具有赤星病抗性，抗性種質(zhì)資源比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于貴州省內(nèi)地方品種，進(jìn)一步凸顯出發(fā)掘與利用貴州省內(nèi)地方品種在烤煙抗赤星病育種中的重要意義。此外，幼苗離體葉片赤星病抗性鑒定結(jié)果表明，田間赤星病抗性鑒定篩選出來的23份種質(zhì)資源均具備較強(qiáng)的赤星病抗病能力，證明上述抗赤星病種質(zhì)資源的抗性比較穩(wěn)定。

由于植物對不同的致病病理小種具有特異性或?qū)；?，因而不同的生態(tài)環(huán)境下產(chǎn)生的抗病等級會存在差異［17］。本研究鑒定出的高抗赤星病的曉豐8號和湄潭-2是在貴州省貴定縣和湄潭縣收集的地方品種。以此為代表的烤煙地方品種是在所在煙區(qū)的自然條件下，經(jīng)過長期自然選擇和人工選擇所形成的生態(tài)類型，對當(dāng)?shù)刂虏〔≡鞣N生理小種適應(yīng)性及抗性較強(qiáng)。相反，國外引進(jìn)品種雖然品質(zhì)優(yōu)良，對根莖病害抗性較好，但易感煙草赤星病、黃瓜花葉病和氣候斑點病等葉斑病害［18-19］，加之我國各煙區(qū)地理跨度大、生態(tài)環(huán)境迥異等客觀條件，易導(dǎo)致其抗病性不穩(wěn)定等問題［20］。因此，對于非抗病材料需進(jìn)一步在不同生態(tài)區(qū)域進(jìn)行抗病能力鑒定，才能全面評價材料的抗病性能。

［1］楊志曉，丁燕芳，張小全，等.赤星病脅迫對不同抗性煙草品種光合作用和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懀跩］.生態(tài)學(xué)報，2015，35（12）：4146-4154.

［2］楊志曉，郭玉雙，劉紅峰，等.不同煙草赤星病抗性烤煙品種成熟期葉片氮代謝的差異［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，42（5） ：459-465.

［3］馮瑩.煙草赤星病抗性遺傳分析及主效抗性基因的定位研究［D］.青島：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，2015.

［4］楊志曉，薛剛，丁燕芳，等.煙草赤星病脅迫對不同抗性品種光合特性和滲透調(diào)節(jié)的影響［J］.中國煙草學(xué)報，2015，21 （3） ：82-87.

［5］張鼎宇.煙草赤星病抗感材料Beinhart 1000-1和K326間生理和分子差異比較分析［D］.重慶：西南大學(xué)，2017.

［6］劉學(xué)敏，常穩(wěn).煙草赤星病研究現(xiàn)狀及存在問題［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，31（1）：80-85.

［7］唐世凱，劉麗芳，李永梅.烤煙套種甘薯對持續(xù)控制煙草病害的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（9）：26-28.

［8］蒲小明，沈會芳，陳永明.廣東煙葉主要真菌病害無公害化學(xué)防治藥劑篩選試驗［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：97-102.

［9］徐亞中.煙草赤星病發(fā)生流行規(guī)律和藥劑防治研究［J］.中國煙草，1993（1）：18-21.

［10］閆杏杏，蔣彩虹，馮瑩，等.煙草赤星病抗性主效QTL人工選擇響應(yīng)研究［J］.植物遺傳資源學(xué)報2016，17（5） ：929-934.

［11］楊志曉，王軼，劉紅峰，等.我國主栽烤煙品種親緣關(guān)系及育種［J］.中國煙草學(xué)報，2013，19（2）：34-41.

［12］侯爍，朱承廣，趙強(qiáng)，等.一種苗期鑒定煙草赤星病抗性的新方法［J］.中國煙草科學(xué)，2016，37（6）：72-76.

［13］王仁剛，林世鋒，楊志曉，等.煙草野生種資源對青枯病的抗性［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（12）：71-74.

［14］王仁剛，楊志曉，林世鋒，等.煙屬野生種資源黑脛病抗性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（15）：99-102.

［15］談文.煙草赤星病的發(fā)病規(guī)律及綜合治理［J］.煙草科技，1993（2）：45-48.

［16］曾琛，姜于蘭，谷曉平，等.山地氣候?qū)煵莩嘈遣〉挠绊懷芯浚跩］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（3）：32-34.

［17］陳燦，郭輝，張曉麗，等.廣西野生稻稻瘟病抗性鑒定及抗源地理分布［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，48 （11）：1999-2003.

［18］楊春元，任學(xué)良，王志紅，等.貴州烤煙種質(zhì)資源主要特征特性的遺傳多樣性分析［J］.中國煙草科學(xué)，2009，30（S）：47-49.

［19］常愛霞，賈興華，馮全福，等.我國主要烤煙品種的親源系譜分析及育種工作建議［J］.中國煙草科學(xué)，2013，34（1）：1-6.

［20］劉洋，曾琛，向紅瓊，等.貴州省煙草赤星病菌生物學(xué)特性研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（9）：77-79.