玉米皮纖維發(fā)酵裂褶菌的產(chǎn)酶分析及木聚糖酶基因克隆、表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)測定

王靖宇，劉玉春，韓偉，莊緒會，李曉敏，陳新，張曉琳*

1(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢，430023) 2(國家糧食局科學(xué)研究院，北京， 100037)

我國玉米淀粉年產(chǎn)量在2 300萬t左右，玉米皮作為玉米淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)品，占玉米籽粒質(zhì)量的15%左右[1]。玉米皮中半纖維素含量較高，約為73.2%～86.0%，蛋白質(zhì)為5.0%～11.5%，淀粉為4.0%～11.2%[2]。玉米皮半纖維素是由β-1,4糖苷鍵連接的木聚糖主鏈及包括L-阿拉伯糖、D-半乳糖、葡萄糖醛酸、阿魏酸等側(cè)鏈殘基構(gòu)成[2]。因此，玉米皮的降解利用需要多種酶參與，如木聚糖酶(xylanase)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)、乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase)、α-葡萄糖醛酸苷酶(α-glucuronidase)等。

木聚糖酶(1,4-β-D-xylanase; EC3.2.1.8)是目前研究最為廣泛的半纖維素酶，也是一種重要的工業(yè)用酶，在食品、飼料、酶法生產(chǎn)功能性低聚木糖工業(yè)等方面都起到重要的作用[3-5]。木聚糖酶在糧食加工和糧油加工副產(chǎn)物增值利用發(fā)面有重要的應(yīng)用價值，但目前關(guān)于木聚糖酶應(yīng)用于糧食加工副產(chǎn)物玉米皮的研究較少，大多數(shù)木聚糖酶仍很難滿足工業(yè)上的要求，因此需要挖掘新的木聚糖酶基因資源。

裂褶菌(Schizophyllumcommune)隸屬于真菌門(Eumy cophy ta)，擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，傘菌目(Agaricales)，裂褶菌科(Schizophy llaceae)，裂褶菌屬(Schizophyllum)，又稱白參、樹花、八擔(dān)柴，具有較強(qiáng)的半纖維素和纖維素的分解能力，在含有半纖維素和木質(zhì)素的基質(zhì)上生長良好[6]。此外，裂褶菌是一種十分重要的食藥兼用真菌，含有豐富的生理活性物質(zhì)，其發(fā)酵產(chǎn)物作為極有開發(fā)前景的生物活性物質(zhì)已得到國內(nèi)外的普遍重視。

本研究設(shè)計應(yīng)用玉米皮纖維發(fā)酵培養(yǎng)裂褶菌，測定了玉米皮纖維的發(fā)酵液中半纖維素酶活性、產(chǎn)酶歷程和發(fā)酵液水解不同底物的酶活力；根據(jù)酶活測定結(jié)果和目前已有基因組序列信息，克隆表達(dá)了裂褶菌木聚糖酶Xyn22，并完成了酶學(xué)性質(zhì)測定，為玉米加工副產(chǎn)物玉米皮的增值轉(zhuǎn)化和資源化利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

SchizophyllumcommuneDB01為由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存菌株。大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)、大腸桿菌E.coliTop10為本實(shí)驗(yàn)室保存，以及質(zhì)粒pET-28a(+)均為本室保存。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖醛酸苷酶試劑盒：Magazine公司；α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、對硝基苯酚：北京索萊寶科技有限公司；石油醚：國藥集團(tuán)；對硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷、對硝基苯酚醋酸酯、樺木木聚糖、D-(+)-木糖：Sigma公司；3,5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-燕麥葡聚糖、魔芋膠、瓜爾豆膠：上海源葉生物科技有限公司。限制性酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及膠回收試劑盒等購自生工生物工程(上海)有限公司；RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)購自Roch公司；生物素、胰蛋白胨和酵母抽提物等購于OXOID公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器

水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；6110分析天平，Tecator公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PCR儀，美國伯樂公司；酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米皮纖維的提取

提取步驟：玉米皮→干燥→超微粉碎→脫脂→離心分離→加水制成懸液→α-淀粉酶酶解→糖化酶酶解→蛋白酶酶解→離心分離→沉淀(玉米皮纖維)

脫脂：有機(jī)溶劑(石油醚)浸提去除玉米皮脂肪。

將干燥后的玉米皮進(jìn)行超微粉碎，粉碎后過60目篩；取100 g玉米皮，按1∶13(g∶mL)的固液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為6.0，向體系中加入耐高溫α-淀粉酶，95 ℃水浴下處理30 min，降低水浴溫度為55 ℃，加入糖化酶，反應(yīng)30 min，并利用I2-KI溶液檢查淀粉水解情況。向上述處理處理液中加入中性蛋白酶，在水浴溫度55 ℃，pH為7.0的條件下，反應(yīng)60 min后，加熱至100 ℃滅酶5 min，紗布過濾，濾渣用蒸餾水洗滌2遍，105 ℃烘干后備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件

玉米皮纖維培養(yǎng)基：

碳源：10 g/L玉米皮纖維;氮源：1 g/L蛋白胨，0.2 g/L尿素；無機(jī)鹽：4.2 g/L (NH4)2SO4、2 g/L KH2PO4、 0.3 g/L CaCl2、0.3 g/L MgSO4·H2O、2 mL微量元素(5 g/L FeSO4·7H2O，1.6 g/L MnSO4·4H2O，1.4 g/L ZnSO4·7H2O，2 g/ L CoCl2)；其他：2 g/L Tween 80。

將目標(biāo)菌株接種于300 mL玉米皮培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)7d。在培養(yǎng)過程中，每24 h取1次樣，取樣過程中盡量避免振蕩，將發(fā)酵液于12 000 r/min離心15 min，取上清液。

1.2.3 發(fā)酵液半纖維素酶活測定方法

1.2.3.1 木聚糖酶活性測定

使用3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)法[7]：取900 μL 10 mg/mL底物(櫸木木聚糖)在37 ℃預(yù)熱后，加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在37 ℃反應(yīng)10 min，然后加1.5 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水煮5 min并冷卻至室溫后，在540 nm波長下測定釋放出的還原糖。同時設(shè)一對照，在加入酶液前先加入1.5 mL DNS試劑終止反應(yīng)。1個酶活單位(U)定義為每分鐘分解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量。

1.2.3.2 乙酰木聚糖酯酶活性測定

以對硝基苯酚醋酸酯為底物，用分光光度法測定裂褶菌發(fā)酵產(chǎn)乙酰木聚糖酯酶活力[8]：取0.04 mL 100 mmol/L 的底物(DMSO溶解)與0.86 mL 100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)混勻，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液液，37 ℃下準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入3 mL甲醇終止反應(yīng)，再加入2 mL去離子水，測定410 nm波長下吸光度。1個酶活性單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.2.3.3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性測定

采用酶水解對硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF)釋放對硝基苯酚(pNP)的量確定。pNPAF終濃度為2 mmol/L，酶液為5 μL，37 ℃反應(yīng)10 min后加人100 μL 1mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，測定410 nm下的吸光值[9]。1個酶活性單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量。

2．王右軍宅所在地的特征。(1)丹池山，“池有水赤色，勺之潔白”，這一特征是后人難以偽造的；(2)池“禱雨甚靈”，新嵊當(dāng)?shù)匕傩諏Ω珊抵昕汕笥甑牡胤蕉挤Q之為龍?zhí)叮?3)南為刻石山，有石可刻；(4)南山之半有巨井，井有蛟；(5)山北有小香爐峰；(6)王右軍出入需經(jīng)過再渡村。

1.2.3.4 α-葡萄糖醛酸苷酶

根據(jù)試劑盒說明書操作。

1.2.4 裂褶菌木聚糖酶基因Xyn22的克隆與表達(dá)

1.2.4.1 大腸桿菌工程菌的構(gòu)建

1.2.4.2 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

連接好的重組質(zhì)粒電激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)。轉(zhuǎn)化后涂在含100 μg/mL卡那霉素(Kana)的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。取含有重組質(zhì)粒pET-Xyn22的E.coliBL21(DE3)菌株和只含有pET-28a(+)空質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株，以0.1%的接種量接種于LB(含100 μg/mL Kana)培養(yǎng)液中，37 ℃快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB(含100 μg/mL Kana)培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～1.0后，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。于30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約8 h后離心收集菌體，超聲破碎，Ni-親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測等，均采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[11]。

酶的最適pH的測定：在重組酶比較穩(wěn)定的溫度(一般為37 ℃)下，將酶促反應(yīng)置于pH 2.0～10.0的緩沖液中進(jìn)行(Gly-HCl：2.0～3.5；Na2HPO4-Citrate：3.0～8.0；Na2HPO4-NaH2PO4：6.0～8.0；Tris-HCl：7.5～9.0；Gly-NaOH：9.0～10.0)。酶的pH穩(wěn)定性測定：將純化的酶液置于pH 2.0～13.0的緩沖液中(Gly-HCl：2.0～3.5；Na2HPO4-Citrate：3.0～8.0；Tris～HCl：7.5～9.0；Gly-NaOH：9.0～10.5；Na2HPO4-NaOH：10.5～12.5；KCl-NaOH：12.5～13.0)，在重組酶比較穩(wěn)定的溫度(一般37 ℃)下處理1 h以上，然后在最適pH及重組酶比較穩(wěn)定的溫度(一般37 ℃)下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。

1.2.4.4 最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定

酶的最適溫度測定：在最適pH的緩沖液中，于25～80 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性測定：將同樣酶量的酶液置于不同的溫度中處理0～120 min后，在最適pH及最適溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。

1.2.4.5 金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對酶活的影響

酶的金屬離子及化學(xué)試劑抗性：在反應(yīng)體系中加入終濃度為5 mmol/L的金屬離子及化學(xué)試劑，在最適pH及最適溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未加金屬離子及化學(xué)試劑的酶液作為對照。

1.2.4.6 水解木聚糖產(chǎn)物分析

木聚糖酶降解底物的產(chǎn)物分析：在37 ℃及最適pH條件下，用純化酶液降解100 μL 10 mg/mL的樺木木聚糖1 h，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖作為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用薄層層析分析水解產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂褶菌發(fā)酵玉米皮纖維

裂褶菌在以玉米皮纖維為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長良好，顯示該菌株能夠有效降解，利用玉米皮纖維，將玉米皮纖維轉(zhuǎn)化為其菌體生長所必須的碳源。7 d培養(yǎng)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基由未接菌時的渾濁變?yōu)槌吻?，裂褶菌生長形成大量球狀菌絲體，如圖1。半纖維素的充分降解需要木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸苷酶等多種酶共同作用，因此結(jié)果顯示裂褶菌能夠通過表達(dá)、分泌多種酶水解玉米皮纖維。

A-玉米皮纖維培養(yǎng)基；B-發(fā)酵培養(yǎng)后菌體生長狀態(tài)圖1 玉米皮纖維發(fā)酵裂褶菌Fig.1 Fermentation culture of Schizophyllum commune DB01 with corn bran fiber

2.2 發(fā)酵液半纖維素酶活測定

玉米皮纖維主要由半纖維素組成，因此測定了發(fā)酵液中半纖維素主鏈降解酶木聚糖酶的活性；側(cè)鏈降解酶乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶的活性(表1)。

表1 裂褶菌發(fā)酵玉米皮纖維產(chǎn)酶分析Table 1 Analysis of enzyme production of corn bran fibersfermented by S.commune DB01

當(dāng)培養(yǎng)至第5天時，發(fā)酵液中木聚糖酶活力基本穩(wěn)定，當(dāng)培養(yǎng)至第6天時酶活達(dá)到最高，為7.45 U/mL。發(fā)酵液側(cè)鏈降解酶，乙酰木聚糖酶在培養(yǎng)至第6天時酶活力達(dá)到最高，為3.41 U/mL。發(fā)酵液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力在培養(yǎng)初期活達(dá)到最高，但培養(yǎng)1～4 d酶活呈下降趨勢，在第5天后基本穩(wěn)定，最高酶活為0.44 U/mL。α-葡萄糖醛酸苷酶活力也在培養(yǎng)初期達(dá)到最高酶活，在之后6天酶活基本穩(wěn)定，且酶活相對較低最高酶活為0.074 U/mL(表1)。

2.3 裂褶菌木聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

裂褶菌木聚糖酶基因Xyn22全長687 bp，編碼228個氨基酸和一個終止密碼子。BLASTp結(jié)果表明,Xyn22與S.communeH4-8來源的11家族木聚糖酶蛋白(XP_003038466.1)具有最高的一致性為100%，該木聚糖酶目前還沒有酶學(xué)性質(zhì)的研究報道。根據(jù)Xyn22核酸序列設(shè)計合成表達(dá)引物，并用表達(dá)引物PCR擴(kuò)增Xyn22基因全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后連接入pET-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。將收集的菌體超聲破碎后經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化。SDS-PAGE電泳表明純化的酶液達(dá)到了電泳純(圖2)，分子質(zhì)量為24.1 kDa，與理論分子量相近。

M-低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1-細(xì)胞破碎液上清；2-純化重組蛋白圖2 Ni2+-NTA親和層析純化重組木聚糖酶Xyn22Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified Xyn22

2.4 重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

2.4.1 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下(20 ～65 ℃)測定木聚糖酶Xyn22的酶活。結(jié)果如圖3-A所示，重組酶Xyn22的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度在45 ℃時其相對酶活在80%以上。將適量的酶液放置在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃下恒溫水浴，每隔15 min取樣測定殘余酶活力。以保溫0 min重組酶的酶活力設(shè)為100%。結(jié)果表明：在40 ℃處理2 h后，Xyn22殘余酶活仍保持在80%左右；45 ℃處理2 h后，Xyn22酶活仍保持在60%左右；在50 ℃條件下處理20 min后，基本上檢測不到有殘余的酶活(圖3-B)。

圖3 Xyn22的最適反應(yīng)溫度(A)和溫度穩(wěn)定性(B)Fig.3 Optimum temperature (A) and thermostability (B) of Xyn22

2.4.2 重組木聚糖酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性

在不同pH緩沖液(2.0～10.0)下測定Xyn22的酶活力，最適pH為5.0，在4.5～6.5的范圍內(nèi)酶活均在80%左右(圖4-a)。將適量的酶液置于pH 2.0～13.0的緩沖液中，處理2 h后，在最適作用條件下測定剩余酶活力。其中酶活力最高的設(shè)為100%，Xyn22在pH 3.0～pH 10.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，酶活保持在80%左右(圖4-b)。

圖4 Xyn22的最適反應(yīng)pH(a)和pH穩(wěn)定性(b)Fig.4 Optimum pH (a) and pH stability (b) of Xyn22

2.4.3 金屬離子和相關(guān)化學(xué)試劑對重組木聚糖酶活性的影響

在重組木聚糖酶Xyn22與底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中加入不同的金屬離子或化學(xué)試劑，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mg2+、Ba2+、EDTA和Hg2+對酶活有抑制作用，Hg2+可以使Xyn22幾乎完全失活。Co2+、Cu2+、K+、Mg2+、Al3+、Fe3+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Ni2+、Na+、Mn2+和對酶活的影響很小(表2)。

表2 金屬離子和化學(xué)試劑對重組木聚糖酶酶活的影響Table 2 Effects of metal ions and chemicals on the activityof recombinant xylanase

2.5 重組酶Xyn22水解木聚糖的產(chǎn)物分析

Xyn22水解樺木木聚糖生成的產(chǎn)物如圖5，在37 ℃及最適pH條件下，用純化酶液降解樺木木聚糖60 min，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖作為標(biāo)準(zhǔn)。由圖可以看出水解產(chǎn)物為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖為主的木寡糖，沒有木單糖產(chǎn)生，因此該酶為內(nèi)切型木聚糖酶。

圖5 重組木聚糖酶Xyn22水解樺木木聚糖的產(chǎn)物分析Fig.5 Hydrolysis of xylan.Xyn22 were incubated with xylan for 60 mins, and the reaction products were analyzed by thin-layer chromatography

3 結(jié)論

以玉米皮為唯一碳源培養(yǎng)裂褶菌，分別測定發(fā)酵液中木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸苷酶的活性。結(jié)果顯示木聚糖酶最高酶活為7.45 U/mL、乙酰木聚糖酯酶最高酶活為3.41 U/mL、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活相對較低，最高酶活分別為0.44 U/mL和0.074 U/mL。根據(jù)酶活測定結(jié)果克隆了裂褶菌的木聚糖酶基因Xyn22，完成了該基因在大腸桿菌中的表達(dá)、重組蛋白純化和性質(zhì)研究。Xyn22的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度在45 ℃時其相對酶活在80%以上。Xyn22的最適pH為5.0，在4.5～6.5的范圍內(nèi)酶活均在80%左右。Xyn22在pH 3.0～10.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，酶活保持在80%左右。Mg2+、Ba2+、EDTA和Hg2+對酶活有抑制作用，Hg2+可以使Xyn22幾乎完全失活。Co2+、Cu2+、K+、Mg2+、Al3+、Fe3+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Ni2+、Na+、Mn2+和對酶活的影響很小。水解樺木木聚糖分析顯示，該酶水解產(chǎn)物為木二糖及聚合度高于木二糖的木寡糖。

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