N-糖基化改造堿性果膠酶的熱穩(wěn)定性

昂安娜，堵國成,2，葛飛，朱龍寶，江志超，馬琪森，朱龍龍，陶玉貴*

1(安徽工程大學 生物與化學工程院，安徽 蕪湖，241000) 2(江南大學,工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

堿性果膠酶(alkaline polygalacturonate lyase, PGL)即聚半乳糖醛酸裂解酶，可在堿性條件下(pH 8～11)通過反式消去作用斷開聚半乳糖醛酸的α-1, 4糖苷鍵，生成不飽和的寡聚半乳糖醛酸，廣泛應用于紡織、環(huán)境、造紙、食品等領域中果膠質(zhì)的降解[1]，是種商業(yè)價值非常高的工業(yè)酶。PGL在微生物中分布廣泛，但野生型菌株生產(chǎn)PGL的能力普遍有限，嚴重限制了PGL的大規(guī)模生產(chǎn)[2]。近年來，研究者們開始利用基因工程技術構建重組菌，重組PGL已在大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和畢赤酵母(Pichiapastoris)中成功表達[3-6]。畢赤酵母由于具有遺傳穩(wěn)定,分泌系統(tǒng)強,易于高密度培養(yǎng),胞外雜蛋白表達量少等優(yōu)勢成為最受關注的表達宿主之一[7]。但是，以往的研究主要集中于重組菌的構建和發(fā)酵條件的優(yōu)化，對于從基因?qū)用娓脑霵GL以提高其表達效率,改善其酶學性質(zhì)的研究并不多，涉及N-糖基化修飾的研究更是寥寥無幾。

我們在之前的工作中發(fā)現(xiàn)，將PGL基因?qū)氘叧嘟湍钢斜磉_會使酶在128、185和353三個位點發(fā)生N-糖基化，于是開始對該重組酶進行N-糖基化改造。先將這3個位點的天冬酰胺分別突變成谷氨酰胺，再進行組合突變，獲得了1株酶活高但熱穩(wěn)定性差的重組菌GS115/N185Q-N353Q[8]。本研究通過定點突變對PGL進行進一步的N-糖基化改造，以期獲得酶活高熱穩(wěn)定性好的突變酶。

結合前期實驗結果，我們猜想去除N-糖基化之所以會對PGL的熱穩(wěn)定性造成不利影響，可能是因為某些發(fā)生N-糖基化的天冬酰胺被谷氨酰胺取代,會破壞其與周圍氨基酸間原有的作用力，從而改變蛋白質(zhì)的區(qū)域結構，造成突變后能量變高。如果轉換方式去除N-糖基化，例如將天冬酰胺突變成相比谷氨酰胺突變能更低的氨基酸，或者不突變天冬酰胺而是將其后面的蘇氨酸突變成除絲氨酸外突變能更低的氨基酸，或許能降低對熱穩(wěn)定性的不良影響。這是本實驗通過N-糖基化改造PGL熱穩(wěn)定性的第一個策略。此外，許多文獻報道引入N-糖基化能提高酶的熱穩(wěn)定性[9-10]，但這種作用具有點特異性[11]。近期有研究證明，在蛋白質(zhì)的反向轉角區(qū)插入具有 EAS 特征的新N-糖基化能較可靠地提高其熱穩(wěn)定性[12]。 EAS的氨基酸組成有3種形式：F-N-X-T、F-X-N-X-T和F-X-X-N-X-T(F 是苯丙氨酸，N是天冬酰胺，X 是除脯氨酸外任意氨基酸，T 是蘇氨酸)[13-14]。相比普通的N-糖基化序列N-X-T，EAS的天冬酰胺前面1-3位置多了1個芳香族氨基酸苯丙氨酸，當該序列位于反向轉角區(qū)時，苯丙氨酸會與天冬酰胺連接的糖鏈及蘇氨酸發(fā)生相互作用并形成1個穩(wěn)定該區(qū)域結構的模塊，從而對蛋白質(zhì)整體構象的穩(wěn)定做出貢獻[15]。據(jù)此，我們可以篩選PGL的反向轉角區(qū)引入 EAS 來進一步提高其熱穩(wěn)定性，這是本實驗改造PGL熱穩(wěn)定性的第二個策略。

在軟件建模分析的基礎上，通過第一個策略，PGL的半衰期被提高了176%，雖然離目標值相差甚遠，但作為第一階段的改造算是取得了一定的成果；接著，篩選出3個合適的位點分別引入具有EAS序列特征的新N-糖基化，后期又進行了組合突變，將PGL的半衰期進一步提高，達到1.35 h，與目標值接近。這兩個策略不僅沒有對酶的催化活力造成負面影響，反而使比酶活小幅上升，即我們在畢赤酵母中獲得了具有更佳酶學性質(zhì)的PGL。本研究表明：在去N-糖基化前對該位點進行氨基酸穩(wěn)定性突變以確定最佳突變是有意義的；在酶的反向轉角區(qū)引入具有EAS序列特征的新N-糖基化對提高其熱穩(wěn)定性具有顯著促進作用。這些結論對于重組酶在畢赤酵母中的N-糖基化改造有具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

編碼經(jīng)N-糖基化改造的重組PGL基因N185Q-N353Q的載體E.coliTOP10 pPIC9K/N185Q-N353Q和GS115/N185Q-N353Q是本實驗室在前期研究中構建好的，克隆宿主E.coliJM109和表達宿主P.pastorisGS115 (his-) 購于美國Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶SacI和DpnI購于美國Thermo Fisher公司；Prime STAR HS DNA 聚合酶和膠回收柱回收試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司；G418、Kanamycin、質(zhì)粒提取試劑盒和蛋白定量檢測試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；聚半乳糖醛酸(Polygalacturonic acid， PGA)：分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PTC-200型基因擴增儀，美國MJ Research公司；恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；GelDoc XR凝膠成像分析系統(tǒng)和蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司；5804 R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；UV-2450型分光光度計，日本Shimadzu有限公司；AKTA蛋白純化儀，美國GE Health公司。

1.3 方法

1.3.1 堿性果膠酶的模板確定

Discovery Studio 2017自帶數(shù)據(jù)庫中有兩個與PGL同源性極高(同源性高達99%以上)的模板蛋白，分別是不帶配體的1BN8[16]和帶配體的2NZM[17]，且存在區(qū)別的氨基酸位點都不在酶的催化區(qū)域或后期要引入新N-糖基化位點的反向轉角區(qū)，故可直接把1BN8和2NZM作為PGL的模板進行結構分析以確定最佳突變。

1.3.2 重組表達載體的構建

根據(jù)突變體的基因序列設計引物(表1)并以pPIC9K/N185Q-N353Q為模板進行全質(zhì)粒擴增，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；34個循環(huán)(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min)；72 ℃保溫10 min。全質(zhì)粒擴增的產(chǎn)物用DpnI處理以消化模板，回收后轉化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，后培養(yǎng)1 h涂板，挑選生長較好的單菌落進行提質(zhì)粒和測序。

表1 實驗所用引物Table 1 The primers used in this experiment

1.3.3 畢赤酵母的電轉及重組子的篩選

對測序正確的菌株進行搖菌和提質(zhì)粒，用SacI將質(zhì)粒線性化，回收后電轉至新制備好的P.pastorisGS115感受態(tài)細胞中，在MD平板上培養(yǎng)3～4 d，經(jīng)YPD-G418(1～4 mg/mL)平板初步篩選重組子的基因拷貝數(shù)。

1.3.4 重組菌的搖瓶發(fā)酵

從YPD-G418(4 mg/mL)平板上挑取生長較好的單菌落接種于30 mL YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)14 h；吸取10%轉接于30 mL BMGY培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)24 h；離心收集菌體，用生理鹽水清洗菌體1～2次，轉入50 mL BMMY培養(yǎng)基中，在22 ℃，220 r/min條件下誘導酶表達，每隔24 h添加450 μL甲醇，72 h取1次樣，96 h停止發(fā)酵并離心收集上清液于4 ℃保存。

1.3.5 堿性果膠酶的提取與純化

往各重組菌的發(fā)酵上清液中邊攪拌邊緩慢加入烘干后的硫酸銨粉末至濃度為50%～70%，離心得粗PGL沉淀，用5 mL A液(先配制20 mmol/L的甘氨酸溶液，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5)對粗PGL沉淀進行復溶和透析，整個提取過程確保酶處于低溫環(huán)境。

純化前先用0.22 μmol/L的濾膜將PGL的提取液過濾，再使用AKTA純化儀和5 mL陽離子柱(HiTrapTM SP FF 2.5 cm，GE)對其進行純化。具體純化步驟為：用50 mL A液平衡陽離子柱，以1 mL/min的流速上樣；用25 mL A液再次平衡柱子，以2 mL/min的流速用B液(先配制20 mmol/L和1 mol/L的甘氨酸-NaCl溶液，再用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5)進行梯度洗脫，最后根據(jù)出峰情況收集洗脫樣品，將酶活最高的樣品用A液透析除鹽后于4 ℃保存。

1.3.6 堿性果膠酶的活性檢測

為了使最后的吸光值在可讀取范圍內(nèi)，先將待測樣品稀釋適當倍數(shù)再檢測其酶活。PGL的具體活性檢測方法為：第一步配制含鈣離子的甘氨酸-NaOH緩沖液，其中甘氨酸的濃度為0.2 mol/L，CaCl2的濃度為0.44 mmol/L，用高濃度NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 9.4；第二步將聚半乳糖醛酸(PGA)邊攪拌邊緩慢加入甘氨酸-NaOH緩沖溶液中至質(zhì)量濃度為2 g/L；第三步在試管中加入配制好的PGA-甘氨酸-NaOH溶液2 mL和待測稀釋樣品20 μL，混勻后于45 ℃水浴鍋中保溫15 min，在反應過程中間斷地搖勻反應液；最后加入3 mL 0.03 mol/L的磷酸溶液終止反應，以無活性的PGL作為空白對照，利用分光光度計在235 nm下測定反應液中PGA的含量。PGL單位酶活(U/mL)的定義為：每分鐘將PGA裂解為1 μmol不飽和的PGA所需要的酶量。

1.3.7 堿性果膠酶的酶學性質(zhì)檢測

用蛋白定量檢測試劑盒測定各純化樣品的蛋白濃度并將它們稀釋成相同且適宜的濃度，按1.3.6中方法檢測其活力，即可由公式得出各突變酶的比酶活；再檢測其在不同質(zhì)量濃度(0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2 g/L)PGA中的活力，即可由軟件GraphPad Prism 5得出各突變酶的Km值和Vmax值。

通過檢測PGL的半衰期來衡量其熱穩(wěn)定性，將各純化樣品放入55 ℃水浴鍋中保溫，每隔15 min取一次樣并測定其酶活，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計并按照文獻所述方法算出各突變酶的半衰期(t1/2)[18]。

2 結果與分析

2.1 確定最佳去N-糖基化方式

前期研究結果表明，在單點突變中，N128Q的比酶活明顯下降，N185Q則顯著提高，半衰期幾乎均沒有變化，N353Q的比酶活上升，穩(wěn)定性卻大大降低[8]，即353位點的N-糖基化對PGL的影響具有兩面性，并直接導致了組合突變株GS115/N185Q-N353的酶活高而熱穩(wěn)定性差。由此，我們將353位點的N-糖基化確立為第一種策略的實施對象。利用Discovery Studio 2017軟件對1BN8的353和355位點分別進行氨基酸穩(wěn)定性突變分析，結果如表2和表3所示。異亮氨酸和色氨酸在這兩個位點的突變能最低，依據(jù)突變能最低原則，確定了N353I和T355W兩個較優(yōu)突變來去除353位點的N-糖基化。

表2 ASN353的氨基酸穩(wěn)定性突變結果Table 2 The result of amino acid stability mutation at ASN353

2.2 新N-糖基化位點的設計

表3 THR355位點的氨基酸穩(wěn)定性突變結果Table 3 The result of amino acid stability mutation atTHR355

文獻報道，PGL發(fā)生催化作用需結合3個Ca2+作為媒介，而這3個Ca2+與酶的結合是由ASP184、ASP223、ASP227、ASN173、ASN180、Lys247、Arg279等支撐的，這些氨基酸即為PGL的關鍵氨基酸，對PGL進行N-糖基化改造時不能改變這些氨基酸或破壞其周圍結構[17]。在此前提下，對1BN8進行結構分析，確定與文獻描述相符合的反向轉角區(qū)，以改變最少氨基酸為原則，對這些反向轉角區(qū)進行篩選，最終鎖定了3個合適的位點(128、137和341)引入具有EAS特征的新N-糖基化，突變分別為A127F、S134F-K139T和G341N。在這里需說明的是，128位點作為原始的N-糖基化位點，鑒于其對酶活的重要影響且周圍結構符合反向轉角特征，也被列入改造范圍。它們的具體突變情況及在PGL中的局部形態(tài)結構和分布如表4、圖1和圖2。由圖可看出，這3個序列符合改造成穩(wěn)定模塊的條件[13-14]，此外，它們都位于蛋白質(zhì)三維結構的表面，不會對PGL的關鍵氨基酸造成干擾或?qū)钚灾行漠a(chǎn)生空間位阻，進一步證明突變的的可行性。

表4 突變序列Table 4 Mutation sequences

圖1 三個待突變序列在PGL中的局部形態(tài)結構Fig.1 The local structure of three to-be-mutated sequences in PGL

圖2 三個待突變序列在PGL三維結構中的位置分布Fig.2 The distribution of three to-be-mutated sequences in the three-dimensional structure of PGL

2.3 突變酶的誘導表達

將各重組子接入搖瓶中發(fā)酵，誘導表達96 h后離心取上清液進行SDS-PAGE分析(圖3)。由圖3可以看出，重組子均可表達相應的突變酶，但表達量不盡相同。PGL的理論分子量為43.5 kDa，在畢赤酵母中表達的實際分子量會隨N-糖基化程度的增加而增加，各突變酶條帶的相對位置與其預測分子量大小相符合，說明定點突變方法成功實現(xiàn)了新N-糖基化的引入。對上清液進行粗酶活測定，結果顯示，除N185Q-T355W-G341N、N185Q-T355W-A127F-G341N、N185Q-T355W-S134F-K139T-G341N和N185Q-T355W- A127F-S134F-K139T-G341N這4個突變酶的粗酶活較N185Q-N353Q有所下降外，其他突變酶的粗酶活并無明顯變化。

M-protein marker; 1-N185Q- N353Q; 2-N185Q-N353I; 3-N185Q-T355W; 4-N185Q-T355W-A127F; 5-N185Q-T355W-S134F-K139T;6-N185Q-T355W-G341N; 7-N185Q-T355W-A127F-S134F-K139T;8-N185Q-T355W-A127F-G341N;9-N185Q-T355W-S134F-K139T-G341N;10-N185Q-T355W-A127F-S134F-K139T-G341N圖3 SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis

2.4 突變酶的催化性質(zhì)檢測

為了驗證PGL經(jīng)N-糖基化改造后其催化性質(zhì)是否受到影響，將各突變酶樣品純化，并對其比酶活和反應動力學常數(shù)進行測定。結果如表4所示：第一階段改造中，突變酶N185Q-N353I和N185Q-T355W的比酶活幾乎沒有變化；第二階段改造中，突變酶N185Q-T355W-A127F的比酶活略有上升，而突變酶N185Q-T355W-S134F-K139T和N185Q-T355W-G341N 的比酶活均有所下降，后者更為突出；在組合突變中，突變酶N185Q-T355W-A127F-S134F-K139T仍顯示較N185Q-N353Q高的比酶活，而包含G341N突變酶的比酶活均顯著降低。此外，N-糖基化改造也影響了PGL的底物親和力，除137位點外，其他位點引入新N-糖基化均導致了底物親和力的下降。

表4 突變酶的酶學性質(zhì)Table 4 The enzymatic properties of mutant enzymes

2.5 突變酶的熱穩(wěn)定性檢測

為了考察N-糖基化改造對PGL熱穩(wěn)定性的作用，對純化后的各突變酶樣品進行半衰期測定。結果(表4)顯示：與N185Q-N353Q相比，突變酶N185Q-N353I的半衰期幾乎沒有改變，而突變酶N185Q-T355W有明顯提高，提高了177%；在此基礎上，通過在 128和137位點插入新N-糖基化使得突變酶的半衰期進一步提升，而在341位點插入新N-糖基化幾乎未產(chǎn)生作用；對128和137位點進行組合突變，使得突變酶N185Q-T355W-A127F-S134F-K139T的半衰期再獲提升，達1.35 h，與PGL在畢赤酵母中表達的原始半衰期值1.42 h接近，而包含G341N 的組合突變酶均沒有在熱穩(wěn)定性上有所突破。

3 討論

在第一階段的改造中，我們根據(jù)Discovery Studio 2017的氨基酸穩(wěn)定性突變結果將353位點的天冬酰胺和355位點蘇氨酸分別突變成突變能低的異亮氨酸和色氨酸，這兩種方式同樣能去除353位點的N-糖基化，且相比直接將353位點的天冬酰胺突變成谷氨酰胺的方法更具理論說服力。然而，經(jīng)過一系列的構建、表達和檢測，發(fā)現(xiàn)只有突變酶N185Q-T355W在熱穩(wěn)定上有所改善，突變酶N185Q-N353I的熱穩(wěn)定性相比N185Q-N353Q幾乎沒有改變。這樣的結果其實是符合預期的，因為在353位點的氨基酸穩(wěn)定性突變結果中沒有穩(wěn)定性突變，雖然異亮氨酸的突變能相對谷氨酰胺更低，但它們同屬于中性突變，而在353位點的氨基酸穩(wěn)定性突變結果中有穩(wěn)定性突變，故突變酶N185Q-T355W的熱穩(wěn)定性結果較理想。

對于新N-糖基化的引入，不同位點顯示了不同影響。128和134位點的N-糖基化使PGL的熱穩(wěn)定性相較N185Q-N353Q得到顯著提高，此外，128位點的N-糖基化還對酶活產(chǎn)生了積極影響，而134位點的N-糖基化使酶活略有下降，但影響較小幾乎可以忽略；在341位點引入N-糖基化，不僅沒有使熱穩(wěn)定性上升，反而使酶活也下降了。原因推測：128和134位點的新N-糖基化非常符合EAS的序列特征和反向轉角區(qū)的結構特征，它們能提高PGL的熱穩(wěn)定性符合預期。此外，128位點原先就是N-糖基化位點，前期實驗結果也表明，該位點的N-糖基化對PGL的催化活力有重要促進作用[8]。通過將128位點的N-糖基化改造成具有EAS特征的新N-糖基化，增強了這個位點的N-糖基化效率[19-20]，這解釋了為什么突變酶N185Q-T355W-A127F的比酶活會有所提高。341位點的N-糖基化不僅沒有提升PGL的熱穩(wěn)定性反而嚴重降低了其比酶活，通過觀察這個位點在PGL三維結構中的位置，發(fā)現(xiàn)341位點相比128和137位點距離PGL的活性中心近很多，雖然不至于影響PGL與其底物的結合，但可能會破壞關鍵氨基酸的周圍作用力和區(qū)域結構，從而影響PGL的催化活力。

總之，本研究通過氨基酸穩(wěn)定性突變和引入新N-糖基化的綜合策略在N185Q-N353Q的基礎上獲得了熱穩(wěn)定性大大提高的突變酶N185Q-T355W-A127F-S134F-K139T，其半衰期達到1.35 h，幾乎回復至原始值1.42 h，實現(xiàn)了 PGL 在畢赤酵母中的進一步改造，證明了在酶的反向轉角區(qū)引入具有EAS特征的新N-糖基化對提高其熱穩(wěn)定性有促進作用，但在設計突變之前必須對酶的結構和關鍵基團及其作用機理認識充分，避免不利突變。

[1] HOONDAL G S, TIWARI R P, TEWARI R, et al.Microbial alkaline pectinases and their industrial applications: a review [J].Appl Microbiol Biot, 2002, 59(4-5): 409-418.

[2] SHARMA D C, SATYANARAYANA T.A marked enhancement in the production of a highly alkaline and thermostable pectinase byBacilluspumilusdcsr1 in submerged fermentation by using statistical methods [J].Bioresource Technol, 2006, 97(5): 727-733.

[3] LIU Y H, CHEN G Q, WANG J L, et al.Efficient expression of an alkaline pectate lyase gene fromBacillussubtilisand the characterization of the recombinant protein [J].Biotechnology letters, 2012, 34(1): 109-115.

[4] BIN Z, DU G C, WEI S, et al.Expression of aBacillussubtilispectate lyase gene inPichiapastoris[J].Biochem Eng J, 2008, 40(1): 92-98.

[5] WANG H, LI J, LIU L, et al.Increased production of alkaline polygalacturonate lyase in the recombinantPichiapastorisby controlling cell concentration during continuous culture [J].Bioresour Technol, 2012, 124(1): 338-346.

[6] LI X, WANG H, ZHOU C, et al.Cloning, expression and characterization of a pectate lyase fromPaenibacillussp.0602 in recombinantEscherichiacoli[J].BMC Biotechnology, 2014, 14(1): 1-12.

[7] POTVIN G, AHMAD A, ZHANG Z S.Bioprocess engineering aspects of heterologous protein production inPichiapastoris: A review [J].Biochem Eng J, 2012, 64(19): 91-105.

[8] 陳雙全.堿性果膠酶高效表達與發(fā)酵優(yōu)化[D].無錫：江南大學，2016.

[9] GUO C, LIU Y, YU H, et al.A novel strategy for thermostability improvement of trypsin based onN-glycosylation within the omega-loop region [J].Journal of microbiology and Biotechnology, 2016, 26(7): 1 163-1 172.

[10] YAO M Z, WANG X, WANG W, et al.Improving the thermostability ofEscherichiacoliphytase,appA, by enhancement of glycosylation [J].Biotechnology Letters, 2013, 35(10): 1 669-1 676.

[11] PRICE J L, SHENTAL-BECHOR D, DHAR A, et al.Correction to context-dependent effects of asparagine glycosylation on pin WW folding kinetics and thermodynamics [J].Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(9):4 450-4 451.

[12] CHEN W, KONG L, CONNELLY S, et al.Stabilizing the CH2 domain of an antibody by engineering in an enhanced aromatic sequon [J].ACS Chemical Biology, 2016, 11(7): 1 852-1 861.

[13] PRICE J L, CULYBA E K, CHEN W T, et al.N-glycosylation of enhanced aromatic sequons to increase glycoprotein stability [J].Biopolymers, 2012, 98(3): 195-211.

[14] PRICE J L, POWERS D L, POWERS E T, et al.Glycosylation of the enhanced aromatic sequon is similarly stabilizing in three distinct reverse turn contexts [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(34): 14 127-14 132.

[15] CULYBA E K, PRICE J L, HANSON S R, et al.Protein native-state stabilization by placing aromatic side chains inN-glycosylated reverse turns [J].Science, 2011, 331(6017): 571-575.

[16] PICKERSGILL R, JENKINS J, HARRIS G, et al.The structure ofBacillussubtilispectate lyase in complex with calcium [J].Nature Structural Biology, 1994, 1(10): 717-723.

[17] SEYEDARABI A, TO T T, ALI S, et al.Structural insights into substrate specificity and the anti beta-elimination mechanism of pectate lyase [J].Biochemistry-Us, 2010, 49(3): 539-546.

[18] XU Z, LIU S, LU X, et al.Thermal inactivation of a recombinant lipoxygenase fromPseudomonasaeruginosaBBE in the absence and presence of additives [J].J Sci Food Agric, 2014, 94(9): 1 753-1 757.

[19] AGUILA S, MARTINEZ-MARTINEZ I, DICHIARA G, et al.IncreasedN-glycosylation efficiency by generation of an aromatic sequon on N135 of antithrombin [J].Plos One, 2014, 9(12):e114454.

[20] MURRAY A N, CHEN W, ANTONOPOULOS A, et al.Enhanced aromatic sequons increase oligosaccharyltransferase glycosylation efficiency and glycan homogeneity [J].Chemistry & Biology, 2015, 22(8): 1 052-1 062.