清解扶正顆粒對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

楊弘 李煌 林露敏 曾建偉 ，3 魏麗慧 ， 彭軍， 林久茂，3#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州350122；3福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350122）

大腸癌作為世界上一種常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)在惡性腫瘤中，我國(guó)大腸癌患者每年的病死率居第三位[2]。目前臨床上大腸癌的主要治療方法是以手術(shù)切除為主結(jié)合放療、化療等綜合治療，但經(jīng)綜合治療后仍有50%以上的患者在5年后發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，以5-FU為基礎(chǔ)的化療能夠有效控制大腸癌的發(fā)展，但化療所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)及多藥耐藥嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后，這成為亟待解決的臨床難題[3]。而中醫(yī)藥治療大腸癌等多種腫瘤療效確切，它具有整體調(diào)節(jié)作用，且毒副作用小，受到廣大醫(yī)療科研工作者的青睞。清解扶正顆粒（Qingjiefuzheng Granules，QFG）是由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成，具有清熱解毒、益氣健脾消食等功效的中成藥顆粒劑，臨床輔助化療藥物治療大腸癌等惡性腫瘤，具有改善患者的生活質(zhì)量、減輕胃腸不良反應(yīng)等作用，但其抑制大腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。為探討QFG對(duì)大腸癌的抑制作用機(jī)制，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察QFG對(duì)大腸癌HCT-116和HCT-8細(xì)胞增殖和凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 藥物與細(xì)胞株 清解扶正顆粒由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成200 mg/ml儲(chǔ)存溶液，超聲30 min助溶，用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，再用培養(yǎng)基配成所需要的濃度（對(duì)照組為 0 mg/ml，實(shí)驗(yàn)組分別為 0.5、1、2 mg/ml）。大腸癌細(xì)胞株（HCT-116、HCT-8）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）、二甲亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）干粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞周期試劑盒、Annexin V/PI染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。1.3 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、－80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica儀器有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、Countes全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將大腸癌細(xì)胞株HCT-116、HCT-8分別培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗（含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，并于37℃、5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至匯合度為80%～90%時(shí)，加入1 ml的胰蛋白酶消化1～3 min，隨后加入2 ml完全培養(yǎng)基終止消化，于離心機(jī)中1 000 r/min離心3 min后，吸棄上清并收集沉淀細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集HCT-116、HCT-8細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按100 μl/孔的原則均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)每孔細(xì)胞的匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，輕輕吸走原孔中培養(yǎng)基，隨后每孔分別加入100 μl不同濃度QFG（終濃度分別為 0 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml），干預(yù)24 h或48 h后再次吸走原孔中溶液，并加入等體積的 MTT 溶液（100 μl/孔，0.5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后吸棄各孔中的液體，每孔加入等體積DMSO并振蕩混勻，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（A值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察 收集HCT-116、HCT-8細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的 QFG（0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）干預(yù)24 h，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，拍照記錄。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 收集HCT-116、HCT-8細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的 QFG（0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）干預(yù)24 h后，收集每孔細(xì)胞并用PBS清洗2次后，分別加入預(yù)冷的4℃75%酒精固定4 h，PBS清洗3遍后加入PI 500 μl，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集HCT-116、HCT-8細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的 QFG（0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）干預(yù)24 h后，收集每孔細(xì)胞并用PBS清洗2次后，分別加入Annexin V/FITC和PI各5 μl，避光染色15 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞各時(shí)期凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用比率表示，采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QFG對(duì) HCT-116、HCT-8細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度的QFG可顯著抑制大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8的增殖，具有明顯的劑量依賴和時(shí)間依賴作用，與對(duì)照組（0 mg/ml）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 QFG對(duì)HCT-116、HCT-8細(xì)胞抑制率比較（）

表1 QFG對(duì)HCT-116、HCT-8細(xì)胞抑制率比較（）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

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2.2 QFG對(duì) HCT-116、HCT-8細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8經(jīng)不同濃度的QFG干預(yù)24 h后，隨著藥物濃度的增加，HCT-116和HCT-8細(xì)胞密度逐漸減小，懸浮細(xì)胞增多，部分細(xì)胞皺縮變圓。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)QFG對(duì)HCT-116和HCT-8細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并呈明顯的劑量效應(yīng)。見(jiàn)圖1。

圖1 QFG干預(yù)HCT-116、HCT-8細(xì)胞24 h形態(tài)圖（200×）

2.3 QFG對(duì) HCT-116、HCT-8細(xì)胞周期的影響細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組QFG對(duì)大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8的S期有明顯的抑制作用，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增多（P＜0.05），說(shuō)明QFG能阻止大腸癌細(xì)胞由G0/G1期向S期的進(jìn)程，該作用具有明顯的劑量依賴性。該結(jié)果表明QFG可通過(guò)調(diào)控大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8的細(xì)胞周期進(jìn)程而發(fā)揮其抑制大腸癌細(xì)胞增殖的作用。見(jiàn)表2。

表2 QFG對(duì)HCT-116、HCT-8細(xì)胞周期的影響（）

表2 QFG對(duì)HCT-116、HCT-8細(xì)胞周期的影響（）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別 n 濃度（mg/ml）HCT-8細(xì)胞G0/G1期（%） S期（%）對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組HCT-116細(xì)胞G0/G1期（%） S期（%）3 3 0 0.5 1 2 43.76±3.45 53.36±4.46△73.59±5.13△75.14±4.77△41.71±4.15 33.32±2.93△14.13±3.48△13.16±2.43△34.75±4.14 45.31±2.15△55.15±4.98△65.97±2.42△43.13±2.77 26.93±3.87△26.48±2.07△25.79±1.97△

2.4 QFG對(duì) HCT-116、HCT-8細(xì)胞凋亡的影響Annexin V/PI染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，QFG各劑量組的早期凋亡比例均有明顯增加（P＜0.05），且QFG各劑量組的晚期凋亡比例及總凋亡比例均高于對(duì)照組（P＜0.05），凋亡比例隨著QFG濃度增加而逐漸增多，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用。該結(jié)果表明QFG具有誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8凋亡的作用。見(jiàn)表3。

表3 QFC對(duì)HCT-116、HCT-8細(xì)胞凋亡的影響（）

表3 QFC對(duì)HCT-116、HCT-8細(xì)胞凋亡的影響（）

HCT-8凋亡率早期（%） 晚期（%） 總凋亡（%）對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組組別 n 濃度（mg/ml） HCT-116凋亡率早期（%） 晚期（%） 總凋亡（%）3 3 0 0.5 1 2 0.55±0.34 2.42±0.55△1.45±3.11△9.68±2.43△3.52±0.23 9.45±0.37△11.32±0.91△21.45±0.89△4.07±0.45 11.87±0.78△12.77±4.32△31.13±3.03△0.52±1.39 3.71±2.01△10.16±3.63△15.54±2.12△1.71±2.21 5.63±1.17△7.03±2.41△18.39±2.99△2.23±3.25 9.34±3.33△17.19±4.99△33.93±3.01△

3 討論

大腸癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚、腸蕈、臟毒”等病范疇。脾虛氣弱是大腸癌的發(fā)病基礎(chǔ)，而瘀毒留滯是引發(fā)本病的重要因素，是腫瘤形成、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的直接病理基礎(chǔ)[4]。故該病是因虛致積、因積而逾虛的病證。濕熱、火毒、瘀滯是病之標(biāo)，脾虛、腎虧、正氣不足是病之本[5]。因而正虛邪實(shí)、脾虛、濕毒、瘀滯是病理關(guān)鍵所在。所以，大腸癌的中醫(yī)治則主要為益氣固本、清熱解毒、補(bǔ)肝益腎。由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成的QFG是經(jīng)復(fù)方白花蛇舌草劑型改制而成，其中白花蛇舌草、半枝蓮歸大腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫化瘀等功效，臨床上常用于治療大腸癌等各種惡性腫瘤且療效確切[6～7]；黃芪歸肺、脾經(jīng)，兼有益氣健脾、托毒生肌等功效，現(xiàn)代研究表明它有顯著的抗腫瘤作用[8]；炒麥芽具有行氣消食、健脾開(kāi)胃等功效，臨床用于輔助腫瘤術(shù)后化療療效確切[9]。諸藥合用具有清熱解毒、益氣健脾、消食和胃等功效，主要用于濕熱壅盛、脾胃虛弱型大腸癌等消化道腫瘤的治療，臨床療效顯著，但其抗腫瘤的作用機(jī)制仍不清楚。為研究QFG的抗腫瘤作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)兩株不同的大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8，同時(shí)探討QFG對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

腫瘤是由內(nèi)外因素共同作用下，以局部形成瘤塊為特征的系統(tǒng)性疾病，腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和凋亡抵抗，即增殖/凋亡失衡不受控制是其重要特征[10～11]。因此，抑制大腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)大腸癌細(xì)胞凋亡仍是防治大腸癌的主要方式和途徑。本研究MTT結(jié)果顯示，QFG對(duì)大腸癌細(xì)胞HCT-116和HCT-8的增殖均有顯著的抑制作用；通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞經(jīng)QFG干預(yù)后細(xì)胞密度明顯減小，并出現(xiàn)細(xì)胞變圓、體積縮小和脫落現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了QFG具有顯著抑制大腸癌細(xì)胞增殖的作用。此外，采用Annexin V/PI染色，流式細(xì)胞檢測(cè)分析結(jié)果表明QFG對(duì)大腸癌HCT-116和HCT-8細(xì)胞均有顯著誘導(dǎo)凋亡的作用。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖的重要生物學(xué)特點(diǎn)。細(xì)胞生長(zhǎng)周期分為G0期、G1期、S期、G2期和M期，其中最重要的是由G1期進(jìn)入S期這一過(guò)程且受G1期限制點(diǎn)（Restrictionpoint）調(diào)控[12]。腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖與G1期限制點(diǎn)異常調(diào)控關(guān)系密切，通過(guò)調(diào)控G1期限制點(diǎn)阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期是發(fā)揮藥物抑制腫瘤增殖的重要作用靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，QFG可阻止大腸癌HCT-116和HCT-8細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，初步揭示QFG抑制大腸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

綜上所述，QFG通過(guò)阻止細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗大腸癌的重要作用機(jī)制。但細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控是由各種細(xì)胞表面受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子、周期調(diào)控蛋白和細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白協(xié)同作用共同完成的，QFG精確的抗腫瘤作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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