自制扣式負壓抽提裝置在甲型流感病毒檢測中的應用*

梁敏華 莊健海 吳英 葉俏霞 陳家钖 簡少珍 肖海艷

（廣東省佛山市中醫(yī)院 佛山528000）

流行性感冒是一種常見的臨床病癥，具有傳播速度快、易引起暴發(fā)流行的特點，其中甲型流感病毒侵襲性最強，危害性最大，其RNA依賴RNA聚合酶進行復制和轉錄，然而流感病毒RNA聚合酶缺乏自身校對能力，因此病毒RNA合成過程中易發(fā)生較大的誤差率，從而使得流感病毒基因組突變率較高，病毒進化速度較快[1]。以往臨床中常用液-液萃取方法對其RNA進行提取，但需要使用大量的酚、氯仿等有機溶劑，對環(huán)境影響大，因而不被臨床接受使用。隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，目前臨床中常用自制扣式負壓抽提裝置對流感病毒RNA進行檢測與提取，具有良好的效果[2]。本文將重點探討自制扣式負壓抽提裝置在甲型流感病毒檢測中的應用效果。現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機抽取我院2015年7月～2017年7月420份呼吸道分泌物樣本，用病毒保存專用管置于－80℃保存?zhèn)溆茫瑢嶒炃敖鈨鲋潦覝?。運用隨機數(shù)字表法將其分為實驗1組與實驗2組，實驗1組180份，實驗2組240份，依據(jù)不同的抽提方法，實驗1組采用的是柱式抽提法，實驗2組采用的是自制扣式負壓抽提法。

1.2 檢測方法 實驗1組采用的是柱式抽提法，方法如下：取200 μl樣本并在其中添加250 μl的懸浮液使二者充分混合，之后再向其中添加250 μl的裂解液，放置約4 min后使用離心機離心；在其中添加450 μl的去蛋白液并進行離心；將離心柱轉移至新的離心管后添加50 μl的TE緩沖液，離心后即可收集RNA。實驗2組是自制扣式負壓抽提法，方法如下：在96孔板上按照要求在實驗前分批加入200 μl樣本、裂解液、洗滌液、磁珠液、洗脫液和石蠟油，放置好反應板和磁珠棒后執(zhí)行儀器上程序并運行，自動化結束后，將洗脫液轉移至離心管中，進行約15 min的離心操作，之后提取標本中白細胞層并將其放置于另一試管中，向其中添加紅細胞溶血素-SYS-SLS，比例為1∶5，在冰上孵育10 min，期間渦旋振蕩2次。之后在4℃環(huán)境下離心10 min，棄上清液，加入500 μl的紅細胞溶血素，重懸沉淀白細胞（WBC），重復上一過程后加入400 μl的配套提取試劑里的裂解液，振蕩重懸沉淀，將沉淀的WBC分成兩份，分別放置于兩支不同試管中，向試管中添加0.1%焦碳酸二乙酯，在室溫下浸泡2 h，使用無菌水進行清洗，在100℃環(huán)境下進行15 min的烘烤與滅菌，最終完成收集RNA。

1.3 觀察指標 （1）兩種方法的抽提效率比較。（2）比較兩種方法的定量檢測結果，主要包括RNA的濃度與純度。（3）觀察兩種方法對RNA完整性的影響。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用陽性率表示，采用χ2檢驗，各組間定性結果采用Kappa檢驗；計量資料用（）表示，組間均數(shù)比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法的抽提效率比較 實驗1組對樣本的抽提時間為62 min，實驗2組樣本的對抽提時間為51 min，實驗2組的抽提效率明顯高于實驗1組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩種方法的抽提效率比較

2.2 兩種方法的定量檢測結果比較 經(jīng)提取檢測后得知，實驗2組的RNA濃度為（1.625±0.134）μg/μl，實驗 1組的 RNA 濃度為 （1.542±0.125）μg/μl。經(jīng)提純得知，實驗2組的RNA純度明顯高于實驗1組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并且兩種方法 OD260/OD280的95%CI均位于 1.80～2.00之間，OD260/OD230的95%CI均大于2.00，數(shù)據(jù)相關性良好，具體內(nèi)容。見表2。

表2 兩種方法的定量檢測結果比較

2.3 兩種方法對RNA完整性的影響 自制扣式負壓抽提法對RNA完整性的破壞率為0.83%（2/240），而柱式抽提法對RNA完整性的破壞率約為 3.33%（6/180）。

3 討論

甲型流感病毒具有較強的致病性，對人體的健康將產(chǎn)生嚴重的危害，為有效地抑制甲型流感病毒的傳播，需要對其RNA進行提取，并進一步抑制其RNA聚合酶的復制與轉錄，如此才能有效地切斷其傳播途徑，在較大程度上確保人們的健康[3]。以往在臨床中主要使用配套負壓抽提裝置對其RNA進行提取，雖然能夠獲得一定的效果，然而傳統(tǒng)的液-液萃取方法需要使用大量的酚、氯仿等有機溶劑，對環(huán)境影響大，使用的焦碳酸二乙酯處理水具有較強的致癌性，提取與沉淀都可導致RNA出現(xiàn)一定的損失，并且其操作過程復雜，需要消耗大量時間，同時安全性較低，提取效率低，因而不適合大批量標本操作，已難以適應臨床實驗室的要求，逐漸被淘汰[4]。隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，目前主要采用自制扣式負壓抽提法。自制扣式負壓抽提法提取系統(tǒng)在操作過程中采用96孔板法，對RNA破壞較小，使RNA的降解減少，加之其提取效率高，可有效確保RNA的完整性，因而被廣泛使用[5～8]。OD280 nm與OD230 nm分別代表吸光度分別代表蛋白質(zhì)與有機溶劑含量，依OD260/OD280值與OD260/OD230值可有效的反映出提取RNA純度，兩種提取方式提取的RNA純度均較好，但依據(jù)實驗結果可知，自制扣式負壓抽提法所提取的RNA純度更高。

隨著對甲型流感病毒感染機制的深入了解及各類規(guī)范化指南要求，臨床上對甲型流感病毒RNA檢測的需求日趨提升，對RNA的提取提出了更高的要求。柱式負壓抽提法在我國臨床實驗室應用廣泛，但配套的負壓抽提裝置標本處理能力低，工作效率差，常因與抽提柱的配合性差而導致RNA提取質(zhì)量不穩(wěn)定，使其越來越難以滿足臨床上的需求變化，成為甲型流感病毒RNA檢測的“瓶頸”。因此，研制一種大容量扣式負壓抽提容納裝置十分有必要，不但能推廣良好的技術設施，解決實踐中出現(xiàn)的難題，也可總結經(jīng)驗，為提升RNA提取質(zhì)量提供理論依據(jù)，為進一步的研究打下基礎。依據(jù)本研究結果可知，通過使用自制大容量扣式負壓抽提裝置提取RNA，對于甲型流感病毒RNA的抽提效率達到4.71份 /min， 并 且 OD260/OD280值 與OD260/OD230值 分 別 達 到 （1.976±0.125）與（2.483±0.349），與黃秋香等[9]關于 TritonX-114 液相分離法去除流感單價病毒原液中內(nèi)毒素的實驗研究結果一致，主要原因在于該種方式對病毒RNA的影響較小，能夠形成有效的保護，并且由于在較大程度上排除了外界因素的干擾，因而獲得了較高的提取純度。

綜上所述，本文認為自制扣式負壓抽提裝置在甲型流感病毒檢測中的應用具有顯著效果，不僅能夠提升抽提效率，同時能夠有效地提升抽提純度，更能夠為檢驗師提供可靠的檢測信息，可作為未來一段時間內(nèi)檢測甲型流感病毒的首選方式，并且為后續(xù)治療提供可靠保障。由于本次樣本容量有限，因而關于自制扣式負壓抽提裝置在甲型流感病毒檢測中的應用所產(chǎn)生的深遠影響需要進一步觀察。除此之外，檢驗師還需要不斷加強對該種抽提技術的研究，如此才能提供更加準確的檢測信息。

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