硒與苯那普利抑制單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化

徐 剛， 鄒循亮，傅珍春， 鄢巨振，張夏明， 尹洪萍，亢曉冬

(1.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科， 浙江 杭州 310015； 2.浙江蕭山醫(yī)院 腎內(nèi)科， 浙江 杭州 311201；3.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 浙江 杭州 310036)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是腎小球或腎小管-間質(zhì)病變引起的終末期腎病的最終結(jié)局[1]。有報(bào)道氧化應(yīng)激反應(yīng)所引起的氧化損傷以及由此誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor beta 1,TGF-β1)等多種細(xì)胞因子在RIF的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用[1- 2]；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)可通過抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)、TGF-β/膠原表達(dá)、單核/巨噬細(xì)胞浸潤、細(xì)胞分化及炎性反應(yīng)，減輕RIF[3]。硒是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等多種抗氧化酶類自由基清除劑的必需組分，可清除多種形式的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，防止氧化損傷，同時(shí)也具有抑制TGF-β過表達(dá)的作用。但硒能否與ACEI一樣通過抗氧化和抑制腎組織TGF-β過表達(dá)而減輕RIF尚未見報(bào)道。本研究觀察了硒和苯那普利對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠RIF的作用及其機(jī)制，為RIF的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：清潔級(jí)6周齡雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量180～200 g[杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)：syxk(浙2011- 0157)]。

1.1.2 藥品與試劑：亞硒酸鈉片[每片0.2 mg: 91.3 μg(硒),上海天賜福生物工程有限公司]；洛汀新片(每片含苯那普利10 mg，北京諾華制藥有限公司)；兔抗大鼠結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、TGF-β1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ，Col Ⅲ)多克隆抗體(1∶100，Abcam公司)；二抗為EnVision是標(biāo)記有辣根過氧化物酶及山羊抗小鼠(或兔)免疫球蛋白的多聚體分子 (基因科技上海有限公司)；α-actin 單克隆抗體(Abcam 公司)；羊抗兔IgG (Epitomics公司)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒、ECL放光試劑(Pierce公司)；Western blot用PVDF膜(Bio-Rad公司)，GSH-Px、SOD和MDA測定試劑盒(南京建成生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型制作與分組: 大鼠UUO模型制備方法見文獻(xiàn)[4]。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組各18只：假手術(shù)組(A組)；UUO組(B組)；UUO+硒組(C組)，每天給予亞硒酸鈉0.2 mg/kg (濃度0.01 g/L)灌胃；UUO+苯那普利組(D組)，每天給予苯那普利溶液10 mg/kg(濃度為1 g/L)灌胃。分別于術(shù)后第7、14和21天以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉后處死大鼠(各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)處死6只)，取術(shù)側(cè)腎皮質(zhì)組織，用于HE、Masson染色、免疫組化分析、Western blot和氧化指標(biāo)含量檢測。

1.2.2 腎組織形態(tài)學(xué)分析：用10%中性甲醛固定的腎組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，3 μm切片。HE和Masson染色后光鏡觀察。參照文獻(xiàn)[5]在Masson染色組織切片上進(jìn)行RIF指數(shù)評(píng)分，用CMIAS系列多功能真彩圖像分析儀(北京航空航天大學(xué))計(jì)算RIF指數(shù)，并進(jìn)行半定量評(píng)分。

1.2.3 免疫組化分析：CTGF、TGF-β1、α-SMA和Col Ⅲ均采用EnVision二步法。4 μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用含3% H2O2的封閉內(nèi)源性過氧化物酶。用1 g/L的胰蛋白酶37 ℃，30 min修復(fù)抗原。分別加入一抗α-SMA、CollⅢ工作濃度為1∶100， CTGF 和TGF-β1工作濃度為1∶50，4 ℃冰箱過夜。PBS洗滌后加EnVision兔二抗，37 ℃，30 min，PBS洗滌后用DAB顯色2～10 min，用dd H2O終止顯色，蘇木精復(fù)染1～2 min，藍(lán)化，常規(guī)脫水、透明和封片。同時(shí)用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照[6]。雙盲法應(yīng)用CMIAS系列多功能真彩圖像分析儀，分別對(duì)各組免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，并計(jì)算陽性細(xì)胞面積百分比。

1.2.4 Western blot檢測腎組織CTGF和TGF-β1蛋白表達(dá)：取適量大鼠腎皮質(zhì)組織，經(jīng)液氮研磨后用含蛋白酶抑制劑(halt protease inhibitor，Pierce公司)的RIPA裂解液提取組織蛋白并采用BCA法對(duì)其進(jìn)行定量。每個(gè)標(biāo)本取40 μg蛋白，按1∶4加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后采用PVDF膜進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，300 mA 2 h，之后用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。分別采用以下一抗4℃孵育過夜：抗CTGF、抗TGF-β1(工作濃度1∶400)以及內(nèi)參抗β-actin(工作濃度1∶800)。1×TBST液漂洗3遍后室溫孵育二抗(羊抗兔IgG，1∶4 000)1 h。漂洗后用ECL試劑顯色并用醫(yī)用膠片顯影。

1.2.5 腎組織氧化損傷指標(biāo)檢測：化學(xué)比色法檢測腎組織勻漿中氧化指標(biāo)GSH-Px、SOD和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RIF程度比較

隨梗阻時(shí)間延長腎間質(zhì)逐步增寬，腎小管上皮細(xì)胞彌漫性空泡變性，腎小管管腔擴(kuò)大、萎縮，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、水腫和纖維化改變逐步加重。C組和D組各時(shí)間點(diǎn)RIF指數(shù)明顯低于B組(P<0.01，P<0.05)(圖1～2)。

圖1 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化染色情況Fig 1 Rat renal interstitial fibrosis staining (Masson,×200)

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01 compared with UUO group圖2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化指數(shù)評(píng)分比較Fig 2 Comparison of renal interstitial fibrosis index in each n=6)

2.2 腎組織CTGF、TGF-β1、α-SMA及Col Ⅲ陽性細(xì)胞面積的變化

C組和D組各時(shí)間點(diǎn)腎組織CTGF、TGF-β1、α-SMA和Col Ⅲ的陽性細(xì)胞面積比明顯低于B組(P<0.01，P<0.05)(圖3～10)。

2.3 腎組織CTGF和TGF-β1蛋白表達(dá)

術(shù)后第14天和21天C組和D組CTGF蛋白表達(dá)明顯低于B組(P<0.01，P<0.05)；術(shù)后第21天C和D組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯低于B組(P<0.01)(圖11～13)。

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01, #P<0.05 compared with UUO group圖3 各組大鼠腎組織CTGF陽性細(xì)胞面積百分比Fig 3 Prcentage of CTGF positive cells in renal tissue of rats in each n=6)

2.4 腎組織GSH-Px、SOD和MDA含量的變化

B組各時(shí)間點(diǎn)腎組織GSH-Px、SOD含量均明顯低于A組(P<0.01)，而MDA含量明顯高于A組(P<0.01)；C組和D組GSH-Px、SOD含量均明顯高于B組(P<0.05)，而MDA含量明顯低于B組(P<0.05(表1)。

圖4 各組大鼠腎組織CTGF表達(dá)情況Fig 4 Expression of CTGF in renal tissue of rats in each group (immunohistochemistry,×200)

圖5 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)情況Fig 5 Expression of TGF-beta 1 in renal tissue of rats in each group (immunohistochemistry,× 200)

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01, #P<0.05 compared with UUO group圖6 各組大鼠腎組織TGF-β1陽性細(xì)胞面積百分比Fig 6 Percentage of TGF-β1 positive cells in renal tissue of rats in each n=6)

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01, #P<0.05 compared with UUO group圖7 各組大鼠腎組織α-SMA陽性細(xì)胞面積百分比Fig 7 Percentage of α-SMA positive cells in renal tissue of rats in each n=6)

3 討論

RIF的形成機(jī)制尚未完全闡明。已證實(shí)，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可誘導(dǎo)TGF-βl、CTGF和黏附分子的高表達(dá)，促進(jìn)RIF；醛固酮(aldosterone，ADS)可誘導(dǎo)白介素- 18在腎小管上皮細(xì)胞的高表達(dá)而引起骨橋蛋白表達(dá)上調(diào)，加重RIF[7]，也可通過經(jīng)典和非經(jīng)典鹽皮質(zhì)激素受體促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的產(chǎn)生和沉積，促進(jìn)RIF[8]。而苯那普利可下調(diào)腎組織中TGF-β、單核細(xì)胞趨化蛋白- 1、 血小板源生長因子和金屬蛋白酶鹽酸咪達(dá)普利聯(lián)合法舒地爾治療也可抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)、TGF-β/膠原表達(dá)、單核/巨噬細(xì)胞浸潤、細(xì)胞分化及炎性反應(yīng)而減輕RIF[3]。Ang Ⅱ的內(nèi)源性拮抗因子Ang1- 7可上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)，下調(diào)α-SMA表達(dá)，減輕大鼠RIF[10]。本研究證實(shí)苯那普利可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)腎組織TGF-β1、CTGF、α-SMA和Col Ⅲ表達(dá)而減輕RIF。ROS可以介導(dǎo)和放大UUO所致的炎癥損傷、刺激成纖維細(xì)胞的增生，導(dǎo)致RIF；也可誘導(dǎo)TGF-β1、CTGF過表達(dá)和腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT)，使腎臟ECM產(chǎn)生增多，降解減少，導(dǎo)致其積聚。TGF-β1又可刺激含有P47phox和p22phox的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)促進(jìn)ROS水平增高，激活A(yù)TX/p53通路，導(dǎo)致磷酸化p53與Smad3結(jié)合，上調(diào)CTGF等促纖維化因子表達(dá)[11]，ROS與TGF-β1互為因果，互相促進(jìn)，加重RIF。

圖8 各組大鼠腎組織α-SMA表達(dá)情況Fig 8 Expression of α-SMA in renal tissue of rats in each group (immunohistochemistry×200)

圖9 各組大鼠腎組織Col Ⅲ 表達(dá)情況Fig 9 Expression of Col III in kidney of rats in each group (immunohistochemistry,×200)

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01, #P<0.05 compared with UUO group圖10 各組大鼠腎組織Col Ⅲ 陽性細(xì)胞面積百分比Fig 10 Percentage of Col Ⅲ positive cells in renal tissue of rats in each group

圖11 各組腎組織CTGF和TGF-β1蛋白表達(dá)情況Fig 11 Expression of CTGF and TGF-beta 1 in renal tissues(Western blot)

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01 compared with UUO group圖12 各組腎組織CTGF蛋白表達(dá)情況Fig 12 Expression of CTGF in renal tissue

A.sham-operation group; B.UUO group; C.UUO+sodium selentite group; D.UUO+benazepril group; *P<0.01 compared with sham-operation group; ΔP<0.01 compared with UUO group圖13 各組腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)情況Fig 13 Expression of TGF-beta 1 in renal tissue

此外，ROS還可通過激活血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型蛋白激酶1引起CTGF長期表達(dá)，加重RIF[12]。有報(bào)道通過多種分子機(jī)制途經(jīng)減少ROS的生成具有腎臟保護(hù)作用[13]?？寡趸瘎┲薪樗?intermedin,IMD)可減少間質(zhì)膠原沉積和下調(diào)纖維連接蛋白，顯著減弱UUO誘導(dǎo)的腎小管損傷和RIF[14]；中藥川芎嗪也可下調(diào)UUO模型大鼠腎組織TGF-β1、CTGF，MCP- 1和OPN的基因表達(dá)而有效減輕RIF[15]；本研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)可上調(diào)腎組織TGF-β1和CTGF的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)α-SMA的表達(dá)，導(dǎo)致Col Ⅲ等ECM積聚，引起或加重RIF，補(bǔ)硒則可通過其抗氧化作用下調(diào)腎組織TGF-β1、CTGF和α-SMA表達(dá)，抑制TEMT，減少ECM的產(chǎn)生，減輕RIF。本結(jié)果提示，硒和苯那普利均可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少腎組織TGF-β1和CTGF的過表達(dá)，抑制TEMT，減少ECM的集聚，從而減輕大鼠RIF。

表1 各組大鼠腎組織GSH-px、SOD、MDA的變化 Table 1 Changes of GSH-px, SOD and MDA in renal n=6)

A.sham-operation group； B.UUO group；C.UUO+Sodium selenite group; D.UUO+Benazepril group;*P<0.01 compared with sham-operation group；△P<0.05 compared with UUO group.

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新聞點(diǎn)擊

愛情激素能使耳鳴安靜下來

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 02)報(bào)道，巴西的研究人員在一項(xiàng)小型的初步研究中指出，長期深受耳內(nèi)嗡嗡叫之苦，也就是耳鳴的人，可能通過在鼻內(nèi)噴催產(chǎn)素而得到舒緩。

催產(chǎn)素被封為“愛情激素”是因?yàn)樗芨纳粕缃魂P(guān)系，它可能也有助于舒緩惱人且有時(shí)干擾人的耳鳴噪音。

雖然圣保羅Federal大學(xué)的Andreia Azevedo博士認(rèn)為，不清楚為何催產(chǎn)素能夠舒緩耳鳴，但她推測，它可能在耳內(nèi)會(huì)有效果，或許與內(nèi)耳相關(guān)的液體調(diào)節(jié)以及大腦產(chǎn)生神經(jīng)傳導(dǎo)多巴胺相關(guān)的效果有關(guān)。

Azevedo博士指出，對(duì)某些患者來說，耳鳴會(huì)消失或達(dá)到不痛苦的程度，但就像耳鳴治療一樣，有些患者的耳鳴會(huì)持續(xù)減弱，有些人則會(huì)在藥物治療結(jié)束后再次增加。

雖然催產(chǎn)素看起來是安全的，但它的長期效果仍是未知，目前沒有任何不良反應(yīng)，但未來需做更大型的研究以明確催產(chǎn)素治療耳鳴的作用。

研究團(tuán)隊(duì)正在執(zhí)行其他計(jì)劃，以了解增加催產(chǎn)素的劑量是否可改善或延長反應(yīng)效果。

研究結(jié)果在圣地亞哥舉辦的美國耳鼻咽喉科學(xué)會(huì)頭頸外科會(huì)議中發(fā)表。

健康生活大幅削減癌風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 07- 06)報(bào)道，一篇回顧研究結(jié)論指出，規(guī)律運(yùn)動(dòng)和營養(yǎng)飲食的健康生活型態(tài)可以降低發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)45%。研究者報(bào)告指出，這篇回顧還發(fā)現(xiàn)，遵守防癌飲食與活動(dòng)指引的人死于癌癥的風(fēng)險(xiǎn)降低達(dá)61%。

第一研究者、亞利桑那大學(xué)Mel and Enid Zuckerman公共衛(wèi)生學(xué)院博士生Lindsay Kohler認(rèn)為，整體而言，我們發(fā)現(xiàn)，如果你遵守“防癌”指引，罹癌率或死于癌的概率大幅降低。

Kohler與她的研究伙伴發(fā)現(xiàn)，健康生活對(duì)于預(yù)防乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和結(jié)腸癌特別有效。

她們報(bào)告指出，健康生活可降低乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)達(dá)19%～60%、子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)達(dá)23%～60%、男性與女性結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)達(dá)27%～52%。

Kohler認(rèn)為，其他研究指出這些癌癥與肥胖有關(guān)，這些指引大多數(shù)是幫助你預(yù)防肥胖。

研究者認(rèn)為，超過20%的癌案例與飲食不良、喝太多酒、過重且懶得運(yùn)動(dòng)有關(guān)。

為了了解健康的生活型態(tài)是否會(huì)減少癌病例與死亡，研究者回顧了探討美國癌協(xié)會(huì)和世界癌研究基金會(huì)/美國癌研究院所發(fā)表指引的有效性的12篇研究論文。

這些指引建議改變生活型態(tài)，應(yīng)維持健康體質(zhì)量、規(guī)律運(yùn)動(dòng)、以全谷類取代精制谷類、限制攝取加工肉或紅肉、避免過量飲酒和每天吃5種以上類型與顏色的蔬果。