RCAN1/CaNA在顳葉癲癇患者及戊四氮?jiǎng)游锬Ｐ椭械谋磉_(dá)變化

溫躍桃，吳昆侖，謝 銳，石全紅*

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.神經(jīng)外科； 2. 血管外科， 重慶 400016)

難治性癲癇最常見的類型為顳葉癲癇，其發(fā)生機(jī)制可能與神經(jīng)元功能的異常相關(guān)[1]。與神經(jīng)元功能相關(guān)的一個(gè)重要因子是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CaN)，它參與神經(jīng)系統(tǒng)中重要蛋白的磷酸化修飾，繼而介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元營養(yǎng)不良、神經(jīng)元異常放電以及突觸可塑性改變等過程[2- 3]，且基于分子伴侶學(xué)說與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸調(diào)節(jié)因子1(regulator calcireurin1,RCNA1)的關(guān)系密切[4]，可認(rèn)為兩者的關(guān)系在神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是顳葉癲癇的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。由于RCAN1對(duì)CaN的調(diào)節(jié)作用在癲癇的發(fā)生發(fā)展中尚不明確，因此需要進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人體標(biāo)本：對(duì)照組(n=11)與癲癇組(n=18)人體標(biāo)本取自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室腦庫。本研究符合重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)和赫爾辛基宣言的各項(xiàng)要求，所有患者均簽署了知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： SPF清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g[由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書SCXK(渝2007- 0001)]。

1.1.3 試劑：兔抗鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A(calcineurinA,CaNA)、兔抗β-actin、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和驢抗小鼠FITC(Proteintech公司)；兔抗RCAN1和兔抗IgG(Abcam公司)；山羊抗RCAN1和戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)(Sigma公司)；兔抗GFAP和免疫組化試劑盒 (博士德生物工程有限公司)；驢抗兔Alexa Fluor555、Western blot相關(guān)試劑和Protein A+G Agarose (碧云天生物技術(shù)公司)；驢抗山羊Dylight633(ImmunoReagents公司)；小鼠抗NeuN(Millipore公司)；DAPI(KeyGEN BioTECH公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(model control,MC)組(n=12)和PTZ組(n=18)。PTZ組大鼠連續(xù)腹腔注射PTZ (35 mg/kg) 21 d，MC組大鼠腹腔注射同等劑量相同次數(shù)的0.9%氯化鈉溶液。PTZ注射后觀察行為學(xué)1 h，采用Racine評(píng)分[5]。記錄發(fā)作級(jí)別，連續(xù)3 d出現(xiàn)大于Ⅳ級(jí)及其以上癲癇發(fā)作的大鼠被認(rèn)為模型點(diǎn)燃成功。21 d后大鼠在4%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉下進(jìn)行標(biāo)本的制備。

1.2.2 標(biāo)本的制備：用于Western blot實(shí)驗(yàn)的人體皮質(zhì)標(biāo)本以及大鼠皮質(zhì)和海馬標(biāo)本參照全蛋白提取試劑盒說明書提取各組蛋白，成功提取的蛋白儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。用于免疫熒光?shí)驗(yàn)的人體標(biāo)本和大鼠標(biāo)本制備冰凍切片后儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。用于免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)的人體標(biāo)本和大鼠標(biāo)本制備石蠟切片后常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Western blot檢測(cè)RCAN1與CaNA的表達(dá)：蛋白標(biāo)本上樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)，采用BIO-RAD儀器進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)，成功轉(zhuǎn)至PVDF膜上后用脫脂奶粉封閉1 h。用兔抗RCAN1(1∶1 000)、兔抗CaNA(1∶1 000)和兔抗β-actin(1∶3 000)一抗4 ℃過夜。用TBST洗膜4次，每次5 min。用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶3 000)4 ℃孵育1 h。TBST洗膜后運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法顯色，用Fusion軟件分析吸光度值，且以RCAN1/β-actin，CaNA/β-actin的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)RCAN1與CaNA的表達(dá)：按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進(jìn)行染色后，全自動(dòng)顯微鏡在400倍下拍照，通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析并計(jì)算出RCAN1、CaNA 積分以及光度值與面積的比值(IA/Area)。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)RCAN1的定位：取出冰凍切片，用丙酮浸泡30 min。PBS洗3次，每次5 min。0.4% Triton 37 ℃破膜20 min。PBS清洗后，切片放入檸檬酸抗原修復(fù)液中，微波爐中高火3 min，低火15 min。室溫自然冷卻后PBS清洗。滴加驢血清封閉液37 ℃封閉2 h。滴加羊抗RCAN1(1∶50)、小鼠抗NeuN(1∶100)和兔抗GFAP(1∶50)的一抗混合液4 ℃過夜。37 ℃復(fù)溫1 h。PBS清洗后避光滴加驢抗羊Dylight633(1∶50)、驢抗小鼠FITC(1∶50)和驢抗兔Alexa Fluor555(1∶50)混合物，37 ℃孵育1 h。PBS清洗后滴加DAPI(1∶20)后室溫孵育10 min。PBS清洗后1∶1甘油封片。共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.2.6 免疫共沉淀檢測(cè)RCAN1與CaNA的相關(guān)性：按Protein A+G Agarose說明書處理患者皮質(zhì)組織。一抗分別為兔抗RCAN1、兔抗CaNA和兔抗對(duì)照 IgG，蛋白處理后盡快進(jìn)行Western blot。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者資料比較

18例癲癇患者經(jīng)癲癇灶切除的皮質(zhì)為癲癇組，其中，男10例，女8例，平均(23.4±11.9)歲，病程(9.8±6.0)年，其中9例切除左側(cè)顳葉皮質(zhì)，9例切除右側(cè)顳葉皮質(zhì)。11例腦外傷患者經(jīng)顱內(nèi)減壓術(shù)切除的正常皮質(zhì)為對(duì)照組，男6例，女5例，平均年齡(28.2±11.0)歲，其中5例切除左側(cè)顳葉皮質(zhì)，6例切除右側(cè)顳葉皮質(zhì)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，癲癇組和對(duì)照組在年齡、性別和組織切除部位方面無差異。

2.2 RCNA1和CaNA在人皮質(zhì)組織中的表達(dá)

在患者皮質(zhì)中，RCAN1與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN共表達(dá)，而與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP無共表達(dá)(圖1A)。RCAN1在癲癇患者中低表達(dá)，而CaNA在癲癇患者中高表達(dá)(P<0.01，圖1B～1E)。

2.3 動(dòng)物行為學(xué)

PTZ組在第7～10天陸續(xù)開始出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，21 d后，連續(xù)3 d Ⅳ級(jí)及其以上發(fā)作的有13只，2只沒達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)而被淘汰，3只癲癇發(fā)作死亡，余13只。MC組無癲癇發(fā)作，無大鼠死亡，余12只。

2.4 RCNA1和CaNA在大鼠皮質(zhì)組織中的表達(dá)

RCAN1在大鼠皮質(zhì)中定位于神經(jīng)元的細(xì)胞膜(圖2A)。RCAN1在癲癇患者中低表達(dá)，而CaNA在癲癇患者中高表達(dá)(P<0.01，圖2B～2E)。

2.5 RCNA1和CaNA在大鼠海馬組織中的表達(dá)

RCAN1在大鼠海馬中定位于神經(jīng)元的細(xì)胞膜 (圖3A)。RCAN1在癲癇患者中低表達(dá)，而CaNA在癲癇患者中高表達(dá)(P<0.01，圖3B～3E)。

2.6 免疫共沉淀結(jié)果

在癲癇患者組織中，RCAN1與CaNA有相互作用(圖4)。

A.immunofluorescent staining for RCAN1 (scale bar=50 μm); B, C.immunohistochemical staining for RCAN1 and CaNA(scale bar=50 μm); D,E.Western blot for RCAN1 and CaNA;*P<0.01 compared with control group

A.immunofluorescent staining for RCAN1 (scale bar=50 μm); B,C.iImmunohistochemical staining for RCAN1 and CaNA (scale bar=50 μm); D,E.Western blot for RCAN1 and CaNA;*P<0.01 compared with MC group; PTZ:PTZ group; MC:model control group

A.immunofluorescent staining for RCAN1 (CA1 region; scale bar=50 μm); B,C.immunohistochemical staining for RCAN1 and CaNA (CA1 region; scale bar=50 μm); D,E.Western blot for RCAN1 and CaNA;*P<0.01 compared with MC group; PTZ:PTZ group; MC:model control group

圖4 免疫共沉淀結(jié)果Fig 4 Result of the co-immunoprecipitation

3 討論

CaN在人體內(nèi)廣泛分布，通過底物去磷酸化參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。研究表明，在神經(jīng)系統(tǒng)中，CaN可作用于神經(jīng)元功能網(wǎng)絡(luò)中的多種蛋白，如CREB、NFAT和BAD。CREB是基因表達(dá)的一個(gè)重要原件，過度激活的CaN可以使CREB去磷酸化而失活，從而造成一些重要的蛋白無法完成轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂[6]。NFAT能夠順利入核也是眾多基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的前提，而CaN可以干擾NFAT入核，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元的營養(yǎng)不良和樹突功能異常[7- 8]。BAD被稱為死亡促進(jìn)蛋白，去磷酸化的BAD可從抗凋亡復(fù)合體DAB/Bcl-x/Bcl- 2中解離下來，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[2]。由此可見，CaN可造成神經(jīng)元凋亡，營養(yǎng)不良等改變。而神經(jīng)元的異常是癲癇形成的病理基礎(chǔ)。因此， 明確CaN在癲癇中的表達(dá)情況對(duì)癲癇的機(jī)制研究具有重要的意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaN的催化亞基CaNA在顳葉癲癇患者及癲癇模型中高表達(dá)，說明CaNA與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

生理情況下，除了自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)以外，CaN還受到RCANs家族分子的內(nèi)源性調(diào)控。RCANs是2007年統(tǒng)一命名的，包括RCAN1-3三個(gè)亞型[9]。其中RCAN1不但可以促進(jìn)，同時(shí)也能抑制CaN的表達(dá)，這已在RCAN1敲除小鼠和酵母Rcan1突變型中得到證實(shí)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)RCAN1在癲癇患者及癲癇模型中低表達(dá)。因此，基于RCAN1與CaNA在癲癇患者及癲癇模型中表達(dá)變化，可推測(cè)低表達(dá)的RCAN1對(duì)CaNA的抑制作用減弱，繼而加劇CaNA對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，進(jìn)一步促進(jìn)癲癇發(fā)生。再者，免疫熒光結(jié)果顯示RCAN1與成熟的神經(jīng)元標(biāo)志物共表達(dá)，以及應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)對(duì)CaNA與RCAN1之間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，這進(jìn)一步證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，RCAN1可能通過直接或者間接的方式結(jié)合于CaNA而發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，基于RCAN1在顳葉癲癇患者及癲癇模型中的表達(dá)趨勢(shì)與CaNA相反，人們推測(cè)RCAN1通過抑制CaNA的表達(dá)，進(jìn)而參與癲癇的發(fā)生，這為癲癇的發(fā)生機(jī)制及抗癲癇藥物的開發(fā)提供新思路。

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