小鼠Lewis肺癌細胞非對稱分裂細胞系的建立及其干性特征

孔亮盛，劉永利，孫志衛(wèi)，王健宇*，邢若曦*

(重慶醫(yī)科大學 1.生命科學研究院 腫瘤干細胞基礎轉(zhuǎn)化研究實驗室； 2.生物醫(yī)學工程學院， 重慶 400016)

腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是指在腫瘤組織中具有自我更新能力， 并且能夠產(chǎn)生該腫瘤中一系列異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞類群[1]。它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。非對稱分裂是干細胞獨有的特性，指的是一個干細胞產(chǎn)生兩個命運不同的子細胞：一個保持干性，一個有分化能力[2- 4]。

近年來腫瘤干細胞理論得到了越來越多的認同[5]，但對于腫瘤干細胞的非對稱分裂的研究才剛剛開始。但是，這些報道[6- 7]都只是在腫瘤干細胞中研究了非對稱分裂，把非對稱分裂作為一個標記，驗證腫瘤干細胞干性[8]，而腫瘤細胞中的非對稱分裂在癌癥生物學特性上意義究竟如何卻無人探究。究其原因，缺乏可以穩(wěn)定研究的細胞模型或許是主要原因之一。基于此，本研究擬通過連續(xù)懸浮聚球及單細胞克隆的方法建立了一個穩(wěn)定傳代的非對稱分裂細胞系，并通過多種功能實驗初步研究其干性特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料與動物：小鼠Lewis肺癌細胞(中國科學院上海生命科學院細胞庫)。SPF級6周齡雌性BALB/cA-nu裸鼠6只(北京華阜康生物科技股份有限公司)。SPF級8周齡雌性C57BL/6小鼠4只(重慶醫(yī)科大學實驗動物中心)。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶、兩性霉素B和青霉素/鏈霉素溶液(Hyclone公司)；胎牛血清(ExCell Bio公司)； Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR 引物(生工生物公司)；瓊脂粉(Sigma公司)；Matrigel(BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠Lewis肺癌細胞的培養(yǎng)：配制含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素溶液和1%兩性霉素B溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基，根據(jù)說明書以0.25%胰蛋白酶處理新購得的小鼠Lewis肺癌細胞，所得細胞懸液傳代接種于內(nèi)含上述培養(yǎng)基的90 mm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、95%濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，待貼壁細胞達70%匯合度時傳代，連續(xù)傳3代后備用，此細胞即小鼠Lewis肺癌細胞親代細胞(Lewis lung carcinoma parental cells，LLC-parental cells)。

1.2.2 小鼠Lewis肺癌細胞非對稱分裂細胞系的分離、建立和培養(yǎng)： 收集LLC-parental cells中呈懸浮增殖的細胞并傳代，連續(xù)重復此步驟8次，分離純化出呈穩(wěn)定懸浮球增殖的有干性的細胞，用第8次收集到的懸浮細胞設置96孔板單克隆實驗，根據(jù)形態(tài)任意選擇出呈現(xiàn)非對稱分裂(克隆斑較松散，一半細胞呈圓形，一半細胞呈有分化的梭形)的克隆連續(xù)重復單克隆實驗5次，最終建立穩(wěn)定的非對稱分裂細胞系(Lewis lung carcinoma asymmetric dividing cells，LLC-ASD cells)。

LLC-ASD cells用含5% FBS、1%青霉素/鏈霉素溶液和1%兩性霉素B溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基，在90 mm 培養(yǎng)皿中，以37 ℃、95%濕度、5% CO2的條件靜置培養(yǎng)，待貼壁細胞達70%匯合度時，分別收集全部懸浮細胞與貼壁細胞傳代，再連續(xù)傳3代后備用。

1.2.3 Brdu標記法檢測非對稱分裂比率：用含1 mmol/L 5-溴脫氧尿苷(BrdU)的培養(yǎng)基孵育于上述培養(yǎng)條件下的LLC-ASD cells，14 d，然后，撤去BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細胞達70%匯合度時收集全部細胞，待用。24孔板的3個孔內(nèi)各加入一片干燥爬片與500 μL 1 mmol/L單純多聚賴氨酸(poly-D-lysine，PDL)，靜置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，然后回收PDL。將待用細胞制備為1 mL細胞懸液，各取200 μL懸液加入含爬片的孔內(nèi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置孵育24孔板2 h。吸盡各孔內(nèi)培養(yǎng)基，各加入70%乙醇固定細胞30 min，酸化透膜，清洗，封閉，一抗孵育，4 ℃過夜，清洗，二抗孵育，清洗，DAPI復染，制片，F(xiàn)SX- 100導航儀下觀察拍照。處于有絲分裂后期且被Brdu標記的細胞計數(shù)為a，這些細胞中進行非對稱分裂細胞的數(shù)量為b，按下面的公式計算非對稱分裂比率：非對稱分裂比率=(b/a)×100%。

1.2.4 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測干性基因表達：貼壁細胞達70%匯合度時收集細胞，Trizol法提取總mRNA，按照說明書使用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄總mRNA并以TBP為內(nèi)參進行RT-qPCR，檢測干性基因表達。

1.2.5 克隆斑的檢測：貼壁細胞達70%匯合度時，6孔板各孔加入2 mL 1 mmol/L單純多聚賴氨酸(PDL)，以37 ℃、95%濕度、5% CO2的條件靜置孵育30 min，然后回收PDL。制備1 000 cells/mL的LLC-parental cells細胞懸液，6孔板一側(cè)相鄰的3個孔各加入細胞懸液500 μL和培養(yǎng)基2 mL，輕柔搖勻后于37 ℃、95%濕度、5% CO2的條件靜置培養(yǎng)，記為LLC-Parental cells組。用同樣的方法于6孔板另一側(cè)3個孔設置LLC-ASD cells組。第7天于倒置顯微鏡下計數(shù)含有30個以上細胞的克隆斑，第10天以甲醇固定細胞20 min，結(jié)晶紫染色3 min，PBS輕柔洗去浮色后陰涼處風干6孔板拍照。

1.2.6 懸浮球的檢測：6孔板各孔平鋪1 mL瓊脂混合物(DMEM，5% FBS，1% 兩性霉素B,1%雙抗和0.5%瓊脂)作為底層，底層固化后，將含有200個LLC-parental cells細胞的0.1%瓊脂的培養(yǎng)基混合物各1 mL分別加至一側(cè)相鄰的3個孔，作為上層，上層固化后，各孔加1 mL培養(yǎng)基，記為LLC-parental cells組。用同樣的方法于6孔板另一側(cè)3個孔設置LLC-ASD cells組。6孔板置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，第7天于倒置顯微鏡下觀察記數(shù)各孔內(nèi)含有30個以上細胞的懸浮細胞球的數(shù)目。

1.2.7 單細胞克隆形成率的檢測：貼壁細胞達70%匯合度時制備1 000 cells/mL的LLC-parental cells細胞懸液1 mL，將此懸液加入內(nèi)含9 mL培養(yǎng)基的50 mL離心管，充分混勻，于96孔板各孔加入該細胞懸液100 μL，記為LLC-parental cells組。用同樣的方法設置LLC-ASD cells組。37 ℃、95%濕度、5% CO2的條件靜置培養(yǎng)96孔板，6 h后于倒置顯微鏡下觀察，并詳細記錄每組96孔板中含有單個細胞的各孔的位置及數(shù)量a。第7天于倒置顯微鏡下觀察之前含有單個細胞的孔，記錄含有30個以上細胞的克隆斑的孔的數(shù)量b，按下面的公式計算各組單細胞克隆形成率：單細胞克隆形成率=(b/a)×100%

1.2.8 同種小鼠肺部移植成瘤實驗：取8周齡雌性C57BL/6小鼠4只，隨機平均分為LLC-parental cells組和LLC-ASD cells組兩組。LLC-parental cells貼壁細胞達70%匯合度時，制備含有120 μL PBS、120 μL Matrigel和12萬個LLC-parental cells的Matrigel細胞懸液240 μL。腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉溶液0.2 mL/只麻醉LLC-parental cells組小鼠，用75%消毒乙醇擦拭左側(cè)胸壁皮膚。于左側(cè)肩胛骨下角鄰近的體側(cè)胸壁區(qū)域做0.5 cm縱行切口，分離皮膚及皮下組織暴露至胸壁，觀察到肺運動后，用注射器吸取細胞懸液，針頭進入肺部5 mm左右，注射20 μL Matrigel細胞懸液，于肺實質(zhì)中并停留5 s再緩慢拔出針頭，用棉球擦干血跡并縫合傷口。用同樣的方法制備LLC-ASD cells組的Matrigel細胞懸液并完成移植。21 d后處死小鼠并解剖，觀察有無原位腫瘤及轉(zhuǎn)移。

1.2.9 裸鼠皮下接種成瘤實驗：取6周齡雌性裸鼠6只，隨機平均分為LLC-parental cells組和LLC-ASD cells組兩組。LLC-parental cells貼壁細胞達70%匯合度時，制備含有120 μL PBS、120 μL Matrigel和12萬個LLC-parental cells的Matrigel細胞懸液240 μL。腹腔麻醉LLC-parental cells組裸鼠，用75%消毒乙醇擦拭裸鼠兩大腿內(nèi)側(cè)皮膚，于皮下各注射LLC-parental cells的Matrigel細胞懸液20 μL。用同樣的方法制備LLC-ASD cells組的Matrigel細胞懸液并完成接種。每2 d觀察一次，觀察有無腫瘤生成并測量腫瘤塊尺寸，按下述公式計算體積，并繪制體積增長曲線：腫瘤體積=長×寬×寬/2

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LLC-parental cells和LLC-ASD cells的鏡下生長形態(tài)

小鼠LLC-parental cells基本全部貼壁增殖，異形性明顯且排列緊密，增殖迅速，整個培養(yǎng)過程中偶爾有少量細胞懸浮增殖(圖1)小鼠LLC-ASD cells貼壁生長的細胞大多呈梭形，少部分圓形；所有梭形細胞與所有圓形細胞數(shù)量比約為1∶1(圖2)。

圖2 LLC-ASD 細胞的鏡下生長形態(tài)Fig 2 Morphology characteristic of LLC-ASD cells(×100)

2.2 Brdu標記法驗證非對稱分裂

FSX-100導航儀下隨機選擇視野觀察拍照，計數(shù)結(jié)果顯示LLC-ASD cells中的非對稱分裂比率約為50%(圖3)。

left.symmetric dividing; right.asymmetric dividing圖3 LLC-ASD 細胞的對稱分裂與非對稱分裂Fig 3 Symmetric and asymmetric dividing of LLC- ASD cells(×40 by FSX- 100)

2.3 干性基因表達情況

兩細胞系中Aldh1和Cd133表達量極低甚至檢測不到值，Bmi1的表達量高，且LLC-ASD cells組的(1.083±0.039)高于LLC-parental cells組(0.466±0.012)(P<0.05，n=3)(圖4)。

*P<0.05 compared with LLC-parental cells圖4 RT-qPCR檢測細胞干性基因的表達Fig 4 Expression of stemness genes in LLC-Parental cells or LLC-ASD cells by RT-qPCR

2.4 克隆斑、懸浮球和單細胞克隆形成率的檢測

圖5 第10天時克隆斑形態(tài)Fig 5 Morphology characteristic of clonogeneicity on day 10

克隆斑形成實驗第7天統(tǒng)計克隆斑數(shù)， LLC-ASD cells組的克隆斑數(shù)(186.7±14.38)明顯高于LLC-parental cells組(15.67±2.02)(P<0.001，n=3)。圖5為第10天對克隆斑染色照片。懸浮球形成實驗第7天統(tǒng)計懸浮球數(shù)， LLC-ASD cells組的懸浮球數(shù)(21.33±2.03)明顯高于LLC-parental cells組(11.33±2.40)(P<0.05，n=3)。單細胞克隆形成實驗第7天統(tǒng)計克隆形成率，LLC-ASD cells組的克隆形成率(50.40%±6.07%)明顯高于LLC-parental cells組(18.90%±1.87%)(P<0.01，n=3)。

綜上，LLC-ASD cells的克隆斑成斑能力、懸浮球形成數(shù)量、單細胞克隆形成率均分別高于LLC-parental cells的(P<0.05)；提示，LLC-ASD cells的干性高于LLC-parental cells。

2.5 同種小鼠肺部移植成瘤實驗

實驗設置第21天解剖小鼠，發(fā)現(xiàn)LLC-ASD cell組小鼠生成的肺部移植瘤和縱膈轉(zhuǎn)移灶腫瘤均比LLC-parental cell組小鼠的明顯(圖6)。

Red.in situ tumor on the left lung；Yellow.mediastinal metastasis圖6 同種小鼠肺部移植成瘤結(jié)果Fig 6 Result of the same lung transplantation into tumor experiment in mice

2.6 裸鼠皮下接種成瘤實驗

實驗設置第4天時皮下疑似有腫瘤塊生成；第6天時腫瘤塊大小生長至可被測量；第10天時起，腫瘤塊體積開始迅速增大；第22天時，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，LLC-ASD cell組腫瘤包塊均比LLC-parental cell組的大；測量計算腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)LLC-ASD cell組的腫瘤塊體積[(242.4±97.6)mm3]大于LLC-parental cell組的[(117.8±13.7)mm3]，(P<0.05,n=6)。提示，LLC-ASD cells的皮下接種成瘤能力高于LLC-parental cells，證明LLC-ASD cells的干性高于LLC-parental cells(圖7～9)。

*P<0.05 compared with LLC-parental cells圖7 裸鼠皮下接種成瘤體積生長曲線Fig 7 Growth curve of tumor volume in subcutaneously transplanted nude mice

the 3 mice on the left.LLC-parental cells group; the other 3.LLC-ASD cells group圖8 皮下接種成瘤第22天的裸鼠Fig 8 Nude mice on 22 days after transplanted with cells subcutaneously

圖9 裸鼠皮下接種成瘤第22天成瘤情況Fig 9 Tumors from subcutaneously transplanted nude mice on day 22th

3 討論

本文報道通過連續(xù)懸浮聚球及單克隆的方法從親代腫瘤細胞中建立非對稱分裂細胞系的方法，并證實該非對稱分裂腫瘤細胞系的干性高于親代。對于腫瘤細胞中的非對稱分裂研究真正始于2010年[9]，后續(xù)的研究[6- 7]僅僅將非對稱分裂作為腫瘤干細胞的一個特征標記，而非對稱分裂對于腫瘤細胞的癌生物學意義仍為空白。因此，在先前研究者的基礎上，大膽嘗試用一種新的方法建立了非對稱分裂腫瘤細胞系。

腫瘤干細胞在腫瘤細胞中僅僅占極少的一部分，很難進行分離純化，所以分離和建立純化的腫瘤干細胞細胞系往往成為研究腫瘤干細胞的第一道難

題?？乖瓨擞浄诌x法，無血清懸浮培養(yǎng)分選法，藥物篩選法等[1，10- 15]都是腫瘤干細胞分離常用的方法，但都存在著難以逾越的弊端，比如缺乏公認可靠的特異細胞表面標記，成本高，分選過程對細胞毒害和損傷，分選出的細胞不能長期正常培養(yǎng)穩(wěn)定傳代等。本課題使用的分離建系方法相對操作簡單，成本低，對細胞無損傷毒害作用，可以在一定程度上盡量保持腫瘤干細胞自然增殖特性，建立的細胞系可穩(wěn)定傳代，且經(jīng)過金標準體內(nèi)成瘤實驗確定具有干性。

之前所報道的文章，都把非對稱分裂作為一個更具有干性的標準應用于檢測腫瘤干細胞干性研究中，這個標準可能是由普通干細胞研究的類比演繹而來的，而實際上，一直未見有從腫瘤細胞的角度，對非對稱分裂是否真正更具有干性這個命題開展研究，本課題通過實驗，證明了與LLC-parental cells相比，LLC-ASD cells更具有干性，非對稱分裂適宜作為一個更具有干性的標準，應用于檢測腫瘤干細胞的干性研究。

綜上，LLC-ASD cells的建立及其干性的初步研究，為腫瘤干細胞領域的研究提供了一種新的切實可靠的細胞系分離建立的方法，也給非對稱分裂作為腫瘤干細胞的干性標志提供了驗證，為從非對稱分裂角度開始探索腫瘤干細胞的癌生物學特性邁出了一步。

參考文獻：

[1] Palmini G, Zonefrati R, Mavilia C,etal. Establishment of cancer stem cell cultures from human conventional osteosarcoma.[J]. J Vis Exp, 2016,53884. doi: 10.3791/53884.

[2] Choi JW, Lim J. Control of asymmetric cell divisions during root ground tissue maturation[J]. Mol Cells, 2016, 39:524- 529.

[3] Mull JL, Asakura A. A new look at an immortal DNA hypothesis for stem cell self-renewal.[J]. J Stem Cell Res Ther, 2012, 2:e105. doi: 10.4172/2157- 7633.1000e105.

[4] Cui S, Chang PY. Current understanding concerning intestinal stem cells.[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22:7099- 7110.

[5] 朱玉珍, 馬雨水, 符達. 腫瘤干細胞在腫瘤轉(zhuǎn)移中作用與相關機制的研究進展[J]. 基礎醫(yī)學與臨床, 2012, 32:457- 460.

[6] Wang L, Bu P, Ai Y,etal. A long non-coding RNA targets microRNA miR- 34a to regulate colon cancer stem cell asymmetric division[J]. Elife, 2016, 5:e14620. doi: 10.7554/eLife.14620.

[7] Hwang WL, Jiang JK, Yang SH,etal. MicroRNA- 146a directs the symmetric division of Snail-dominant colorectal cancer stem cells.[J]. Nat Cell Biol, 2014, 16:268- 280.

[8] Bu P, Chen KY, Lipkin SM,etal. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells?[J]. Oncotarget, 2013, 4:950- 951.

[9] Pine SR, Ryan BM, Varticovski L,etal. Microenvironmental modulation of asymmetric cell division in human lung cancer cells[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 2010, 107:2195- 2200.

[10] Eramo A, Lotti F, Sette G,etal. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.[J]. Cell Death Differ, 2008, 15:504- 514.

[11] Vicari L, Colarossi C, Giuffrida D,etal. Cancer stem cells as a potential therapeutic target in thyroid carcinoma.[J]. Oncol Lett, 2016, 12:2254- 2260.

[12] Singh SK, Clarke ID, Terasaki M,etal. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.[J]. Cancer Res, 2003, 63:5821- 5828.

[13] Qiu P. Computational prediction of manually gated rare cells in flow cytometry data[J]. Cytometry A, 2015, 87:594- 602.

[14 Yu SC, Ping YF, Yi L,etal. Isolation and charac-terization of cancer stem cells from a human glioblastoma cell line U87[J]. Cancer Lett, 2008, 265:124- 134.

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喝啤酒易臉紅的男子易卒中

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016- 10- 27報道，臺灣一項研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶2基因缺陷純合子是男性缺血性卒中危險因子，若男性喝一杯啤酒就臉紅，甚至醉倒，很可能有基因缺陷，卒中概率較一般人高出1.93倍。

臺灣三軍總醫(yī)院神經(jīng)科部主治醫(yī)生宋岳峰認為，過去研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶2(ALDH2)變異型是東亞地區(qū)人口最常見的基因變異。斯坦福大學研究指出，中國大陸約35%的人口具有這種基因變異，日本有30%，韓國為20%，臺灣高達47%，白人比例則不到5%。

宋岳峰指出，乙醛脫氫酶2主要處理酒精的代謝，若基因缺陷，酒精進入人體后代謝不良或不能代謝，乙醛會累積在體內(nèi)，導致喝酒后出現(xiàn)臉紅、心悸、惡心、嘔吐等現(xiàn)象。乙醛也是一級致癌物，若長期累積，會大幅提高癌的發(fā)生率。

他說，過去研究就發(fā)現(xiàn)，乙醛長期累積尤其容易導致消化道的癌，且乙醛脫氫酶2基因變異與高血壓、糖尿病、冠心病、高血脂等疾病也有相關，研究團隊進一步探究乙醛脫氫酶2基因變異與卒中的關系。

研究針對914例缺血性卒中病人與746例非卒中病人進行研究，發(fā)現(xiàn)男性若帶有乙醛脫氫酶2基因缺陷純合子(ALDH22/2)，比沒有這種基因缺陷的男性缺血性中風風險高近二倍。該研究結(jié)果今年9月份刊登在國際醫(yī)學期刊《卒中》(Stroke)。

坐過山車可排腎結(jié)石

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016- 09- 29報道，美國一項最新研究表明，坐過山車可以幫助患者排出腎結(jié)石，成功率近70%。研究者認為，“這絕對是一種低成本的替代療法?！?/p>

據(jù)美國密歇根州立大學(Michigan State University)校訊，該校整骨外科專業(yè)名譽教授大衛(wèi)沃爾廷格(David Wartinger)主持了一項試點研究和一項擴展研究，以評估他從患者那里聽到的故事是真是假。試點研究報告發(fā)表于最新一期的《美國骨科協(xié)會期刊》(JournaloftheAmericanOsteopathicAssociation)。

他在三維合成的中空腎臟模型中嵌入了3顆直徑在4 mm以內(nèi)的腎結(jié)石，用背包背上它，在迪斯尼的巨雷山(Big Thunder Mountain)主題公園坐了20次過山車。初步的結(jié)果證實了患者們的說法。

他說：“在試點研究中，坐在過山車的最后一節(jié)車廂，結(jié)石排出率約為64%，而坐在前幾節(jié)中的成功率只有16%?！?/p>

在擴展研究中，他與一名合作者攜帶多顆腎臟模型乘坐同一輛過山車，發(fā)現(xiàn)坐在后面的座位，排出率可達70%。他們還發(fā)現(xiàn)，在兩項研究中，如果結(jié)石位于腎臟上部，排出率達100%。

“總之，我們用了不同的形狀、尺寸和重量的174顆腎結(jié)石，看看每個模型在同一輛過山車和另兩輛過山車上的情況。只有巨雷山的過山車有效，沃爾廷格解釋說，不奏效的游樂設施速度太快、運動太激烈，人體的反應力會使石頭嵌在腎臟里而排不出來?！袄硐氲倪^山車是速度很快(但不是太快)，并有曲折回轉(zhuǎn)，但不要有大頭朝下的運動?！?/p>